Name: הקמתה של תרבות המשובטים של אצות חד־תאיות שהיו Conjugating (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: למדו שיטה להקמת תרביות קלוניות של אצות חד־תאיות ממשפחת Conjugatophyta מדגימות מים טבעיות. השיטה כוללת בידוד תאים בודדים באמצעות פיפטה וגידול במדיה נקייה ליצירת זנים ייחודיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אנו מודים Hisayoshi Nozaki (אוניברסיטת טוקיו), טאקאשי Nakada (אוניברסיטת קיו), יוקה Marukawa השימוטו (אוניברסיטת של יפן נשים) ו הירויוקי Sekimoto (אונ' יפן לנשים). אנחנו רוצים להודות הבודקים להערות שלהם. מחקר זה נתמך על ידי מענק של הסיוע למחקר מדעי (מס 26440223 ו- 15H 04413) מן האגודה יפן עבור קידום של המדע, יפן, על ידי מענק מטעם קרן פיתוח טכנולוגיה חדשה יוקי Tsuchikane.

1. אוסף של דגימת מים המכילים אצות
הערה: conjugatophytes חד־תאיות לגדול באזורים קיפאון מים מתוקים, כמו אגמים, ביצות ושדות אורז. דוגמה מים המכילים אצות נאסף מאחד סביבות אלה לייצר זן תרבות. הפריטים הבאים נדרשים לפני תחילת התהליך: פלנקטון נטו, על פיפטה חד פעמיות, ואת בקבוק או שפופרת 50 מ"ל. לאיסוף דגימות מים.
<ol><li>משתמשים פלנקטון נטו בסביבת אגם לאיסוף אצות מן המים. השתמש של הרשת המתאים, בהתאם למטרה. הערה: החלק העליון של הרשת הוא חדיר למים. האצות נתפס על ידי הרשת מרוכזים לתוך המיכל התחתון פלנקטון נטו. רשת גס מאפשר אצות קטן לעבור. רשת קנס מקבל סתומות בקלות.</li>
	<li>להעביר את המים (כ- 50 מ"ל) ברכבת התחתית 50 מ ל או בקבוק פלסטיק 100 מ. להביא דגימת מים מרוכז המעבדה.</li>
	<li>Conjugatophytes חד־תאיות לגדול גם ביצות או שדות האורז. באזורים אלה מים רדודים, דגימת מים המכילים אצות ניתן לטעום ישירות עם טפי. לאחר מכן, להעביר את המים (30-50 מ"ל) ברכבת התחתית 50 מ ל או בקבוק פלסטיק 50 מל. הערה: המים בזהירות שנדגמו מעל פני האדמה, כך המדגם אינו מכיל שום קרקע.</li>
</ol>2. אישור של אצות
הערה: הפריטים הבאים נדרשים: עם זכוכית מגדלת או מיקרוסקופ נייד ו- 60 מ"מ דיש להשגחה.
<ol><li>כדי לאשר את הנוכחות של אצות במדגם בעוד הוא נמצא פיפטה חד פעמיות, להשתמש זכוכית מגדלת כדי לבחון את הדגימה ישירות. הערה: תאים גדול יותר של 400-1, 000 מיקרומטר באורכו (למשל, Closterium ehrenbergii) יכולה בקלות להיות שנצפו בשיטה זו.</li>
	<li>כדי לאשר אצות תחת המיקרוסקופ נייד, יוצקים דגימת מים בצלחת פלסטיק מעבדה.<ol>
<li>שים המדגם (בערך 3 מ ל) על החלק הפנימי של החצי העליון (מכסה) 60 מ מ פטרי, אז במקום החצי התחתון, עם חלקו התחתון מול החלק הפנימי של המכסה, על העליונה. הערה: בשיטה זו מונע את הדגימה נע ומקל על התצפית.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. הכנה של פיפטה נימי זכוכית מ פיפטה פסטר הבידוד
הערה: לפני תחילת התהליך, הפריטים הבאים נדרשים: עיקור פיפטות פסטר, ארון תקשורת עבור מנורה רוח, מתנול עבור המנורה רוח, מצית, מלקחיים, פח אשפה לזכוכית, דרך הנורה גומי, כפפות, פיפטות פסטר את, חדר נקי או למינריות הוד זרימה (במקרה הצורך).
<ol><li>להצית צורב אלכוהול.<ol>
<li>כדי לייצר פיפטה נימי זכוכית עבור הבידוד, ודא שהלהבה לא מהבהבת. לחדד את הלהבה, להמיס את פיפטה פסטר בקצהו.</li>
	</ol>
</li>
	<li>חום זכוכית סטריליים פסטר פיפטה על הלהבה, תמיכה בצד של הנורה גומי בעבודת יד, בצד קצה באמצעות מלקחיים.</li>
	<li>. קח את פיפטה פסטר את הלהבה ולמתוח אותו.<ol>
<li>כאשר הזכוכית נמס, להסיר במהירות את פיפטה פסטר מתחנת הלהבה ולאחר מכן משוך. הערה: בניסוי זה, פיפטה פסטר הוארך על ידי 15-20 ס מ. ודא בטוח זה את הלהבה פיפטה במהלך הוצאת.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לשבור את קצה פיפטה נימי זכוכית באורך המתאים. כיוון שחלק התקשתות הטובים ביותר, זה אידיאלי על הטיפ. הערה: מחקר זה פיפטה נימי זכוכית עם טיפ של 5-10 ס מ הוכן.<ol>
<li>הקפד לבטל את נימי לאחר נמס זה, וודא כי הלהבה יצא החוצה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הבועות שוחררו על פיפטה נימי זכוכית מציינים את הגודל של קצה פתיחת. בחר את גודל תקין של התא תהיה מבודדת. כ- 1 מ מ של בועות הוא הולם ניתוקה של מינים Closterium , עם תא רוחב של 10-20 מיקרומטר.</li>
</ol>4. החד-תאיים בידוד באמצעות פיפטה נימי זכוכית
הערה: הפריטים הבאים נדרשים לפני שמתחילים: מיקרוסקופ אור הפוך, שעונים משקפיים, צלחת פלסטיק ו סטרילי משורשרות מבחנות המכילות בינוני CA (טבלה 1) או ממוזגים CA בינוני7.
<ol><li>להכין לצפות כמה כוסות (22 מ מ בקוטר של 1 מ מ עומק), המכיל כל 1 מ"ל של אמצעי CA סטרילי.</li>
	<li>לבודד את תא היעד דגימת מים שנאספו בשטח.<ol>
<li>יוצקים את דגימת מים (בערך 30-40 מ"ל) המכיל תאי היעד לתוך קערה מפלסטיק.</li>
		<li>תוך כדי התבוננות המדגם בצלחת פלסטיק תחת מיקרוסקופ אור הפוך, לאסוף תאים בודדים באמצעות פיפטה נימי את הזכוכית.</li>
		<li>להביא את פיפטה נימי זכוכית ליד התא כדי להקל על השאיפה של התא על ידי נימיות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>העבר את התאים לתוך כוס שעון המכיל 1 מ"ל של CA בבסיס, אמצעי סטרילי (איור 1 א').</li>
	<li>לאסוף את התאים שוב באמצעות חדש זכוכית נימי פיפטה של המדיום CA סטרילי, להעביר אותו זכוכית השעון השני המכיל אמצעי CA סטרילי (איור 1b). הערה: תהליך זה חוזר על עצמו עד לתא בודד מבודד בצלחת ספוט (איור 1 c).</li>
	<li>לאסוף את התא הבודד באמצעות פיפטה נימי זכוכית חדשה ולאחר לבסוף להעביר אותו למבחנה המכילה 14 מ של CA בינוני או CA ממוזגים בינוני (איור 1-d). דגירה המדגם ב 23 ° C תחת אור: 8 16-ה-h כהה מחזור בשבועיים הקרובים. הערה: factor(s) לא ידוע על התפשטות תאים, אשר מופרשים מן גדל התאים לתוך הסביבה, כלולים המדיום ממוזגים כדי להקל על חלוקת התא4. אם נוצרת תרבות המשובטים, להכין האמצעי CA ממוזגים תרבות בינוני4. התרבות יהפוך לירוק אם מוצלחת.</li>
</ol>

<ol><li>Wickett, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylotranscriptomic+analysis+of+the+origin+and+early+diversification+of+land+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Phylotranscriptomic analysis of the origin and early diversification of land plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111, E4859-E4868 (2014).</li>
<li>Delwiche, C. F., Cooper, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolutionary+origin+of+a+terrestrial+flora%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The evolutionary origin of a terrestrial flora.</a> Current Biology. 25, R899-R910 (2015).</li>
<li>Daste, P., Neuville, D., Victor-Baptiste, B. <a target="_blank" href="https://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/00071618300650011">A simple procedure for obtaining clonal isolation of diatoms.</a> British Journal of Psychology. 18, 1-3 (1983).</li>
<li>Pringsheim, E. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPringsheim%2C+EG+%22Pure+Cultures+of+Algae%3A+Their+Preparation+and+Maintenance%22">Pure Cultures of Algae: Their Preparation and Maintenance</a>. , Cambridge University Press. London, UK. 119(1946).</li>
<li>Sieracki, M., Poulton, N., Crosbie, N. Automated isolation techniques for microalgae. <a target="_blank" href="https://www.elsevier.com/books/algal-culturing-techniques/andersen/978-0-12-088426-1">Algal Culturing Techniques: Automated isolation techniques for microalgae</a>. Andersen, R. A. , Elsevier Academic Press. 101-116 (2005).</li>
<li>Andersen, R. A., Kawachi, M. Traditional microalgae isolation techniques. <a target="_blank" href="https://www.elsevier.com/books/algal-culturing-techniques/andersen/978-0-12-088426-1">Algal Culturing Techniques: Traditional micro algae isolation techniques</a>. Andersen, R. A. , Elsevier Academic Press. 83-100 (2005).</li>
<li>Abe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+nuclear+transformation+of+the+Closterium+peracerosum-strigosum-littorale+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+and+Cell+physiology%22%5BJournal%5D)">Stable nuclear transformation of the Closterium peracerosum-strigosum-littorale complex.</a> Plant and Cell physiology. 52, 1676-1685 (2011).</li>
<li>Tsuchikane, Y., Tsuchiya, M., Kokubun, Y., Abe, J., Sekimoto, H. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/j.1440-1835.2010.00602.x">Conjugation processes of Penium margaritaceum (Zygnemophyceae, Charophyta).</a> Phycological Research. 59, 74-82 (2011).</li>
<li>Kanda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-based+knockouts+reveal+that+CpRLP1+is+a+negative+regulator+of+the+sex+pheromone+PR-IP+in+the+Closterium+peracerosum-strigosum-littorale+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-based knockouts reveal that CpRLP1 is a negative regulator of the sex pheromone PR-IP in the Closterium peracerosum-strigosum-littorale complex.</a> Scientific Reports. 7, 17873(2017).</li>
<li>Ichimura, T. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF02493393">Mating types and reproductive isolation in Closterium-ehrenbergii Meneghini.</a> Botanical Magazine-Tokyo. 94, 325-334 (1981).</li>
<li>Sekimoto, H., Satoh, S., Fujii, T. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF02411384">Biochemical and physiological properties of a protein inducing protoplast release during conjugation in the Closterium peracerosum-strigosum-littorale complex.</a> Planta. 182, 348-354 (1990).</li>
<li>Ichimura, T., Watanabe, M. <a target="_blank" href="http://agris.fao.org/agris-search/search.do?recordID=US201302724192">The Closterium calosporum complex from the Ryukyu Islands-Variation and taxonomical problems.</a> Memoirs of the National Science Museum. 7, (1974).</li>
<li>Provasoli, L., Pintner, I. J. Artificial media for fresh-water algae: problems and suggestions . <a target="_blank" href="https://archive.org/details/ecologyofalgaesy00tryo">The Ecology of Algae, a symposium held at the Pymatuning Laboratory of Field Biology on June 18 and 19, 1959</a>. , Pymatuning Laboratory of Field Biology, University of Pittsburgh, . Pittsburgh. 84-96 (1960).</li>
<li>Provasoli, L. Media & prospects for the cultivation of marine algae. <a target="_blank" href="https://ci.nii.ac.jp/naid/10008776057/">Proceedings of U. S.-Japan Conference in Hakone, Japan</a>. Tryon, C. A. Jr, Hartmann, R. T. , Japanese Society of Plant Physiologists. 63-75 (1968).</li>
<li>Guillard, R. R. L. Purification methods for microalgae. <a target="_blank" href="https://www.elsevier.com/books/algal-culturing-techniques/andersen/978-0-12-088426-1">Algal Culturing Techniques: Purification methods for microalgae</a>. Andersen, R. A. , Elsevier Academic Press. 117-132 (2005).</li>
</ol>

שימוש בשיטת ההווה, תרבות המשובטים 9 זנים של Closterium sp. הוקמו מתאי 15 מבודד דגימת מים (Inba1), המייצג את שיעור 60% הצלחה. לזן שיבוצע בעתיד על ידי התבוננות מורפולוגי, כמו גם ניתוח הדנ א, כגון ניתוח פילוגנטי מולקולרי8.
בשיטה הנוכחית, הרעננות של דגימת מים חשוב שיעור ההצלחה. עדיף לבודד את התאים מדגימות המים בהקדם האפשרי לאחר האוסף שדה. למרות תאים Closterium המינים (למשל, ehrenbergii ג, ג peracerosum-strigosum-littorale מורכבים) יכול להישמר במדגם מים במשך כ 7 d על-ידי אחסונם ב 4-8 ° C, הבידוד של התאים רצוי ביום של האוסף או למחרת. זה חשוב גם להסיר את כל מזהמים חוץ תאי היעד, אז להגדיל את מספר החזרות כביסה (קרי, > 3 x) עשוי למנוע זיהום של התרבויות על-ידי מיקרואורגניזמים קרקע, תאים.
מגבלה של טכניקה זו היא התקשורת תרבות בשימוש פרוטוקול זה (CA או ממוזגים בינוני CA) אינם תמיד מתאים כל האצות conjugating. במקרים מסוימים, ייתכן צורך לשקול שימוש באמצעי אחר, כמו גם בתנאי טמפרטורה ואור שונה. בנוסף, גם ככה קשה להוכיח אם תרבות גדל מ תא בודד, יש צורך במדויק לאסוף רק 1 התא בעת העברת תאים מבחנה. לכן, העברת צריך להיעשות עם פיפטה נימי זכוכית חדשה בכל פעם.
הקמת תרבות המשובטים עם זה פיפטה שטיפה שיטה היא שיטה קלאסית/תקן והיא השיטה האמינה ביותר לשימוש כדי לבודד את התאים הרצויים עבור מחקר. תרבויות המשובטים conjugating אצות בשימוש הרבה מחקרים8,9,10,11 הוקמו בשיטת ההווה. קשה לנתח conjugating אצות ללא תרבות המשובטים. יתר על כן, בשנים האחרונות, דה נובו רצפי הגנום כולו הפך קל להשיג (למשל, באמצעות הרצפים (sequencer) nanopore מיניון), הקמת המשובטים תרבויות נוספות יקל על רצף דה נובו . במילים אחרות, שיטה זו היא הצעד הראשון ללמוד בעתיד של אצות אלה כדי להבין טוב יותר את המגוון הביולוגי שלהם.
על מנת ליצור זן תרבות יציב, זה צורך לבצע שלבים קריטיים מסוימים במדויק בתוך הפרוטוקול. הצעד החשוב ביותר הוא הכנת פיפטה נימי זכוכית עם צמצם אופטימלי כדי לאפשר המעבר של תא בודד בלבד. הצמצם של פיפטה נימי הזכוכית בטח מעט יותר מאשר אורך ציר מינור של התא עניין. פיפטה נימי האופטימלית זכוכית ניתן תשאף תא בודד על-ידי נימיות. עם זאת, אם הקוטר של הצמצם הוא גדול מדי, נימי ימשוך גם חומרים שאינם חיים מזהם או אפילו (an) אחרים organism(s), בנוסף לתא המטרה.
כדי להשיג על פיפטה נימי זכוכית עם צמצם אופטימלי, הנקודות הבאות הן חשוב לציין. ראשית, התווך של להבה להיות צרים בעת חימום על פיפטה נימי זכוכית. בשלב הבא, בעת משיכת פיפטה של פסטר, יש להסיר הלהבה; אחרת, הצמצם של פיפטה פסטר תתמוטט
הציוד ואת מכולות שמוצג פרוטוקול זה פשוטים, שניתן לשנותם. לדוגמה, באמצעות לוחות רב טוב במקום שעונים משקפיים עם באר אחת, הכביסה תא שניתן יהיה יעיל יותר. בנוסף, המכולות הרבה מכדי האחרים דומים. על ידי העברת תא בודד למדיום תרבות-השלב האחרון, ניתן ליצור תרבות המשובטים.
הכנת במיכל מעוקר ועבודה בשכונה תקים זנים (מזוהמת) axenic. כדי למנוע זיהום, יש צורך חזור על השלב כביסה עם aliquots טריים יותר מ- 3 x. לפעמים, חיידקים גם סטריליים על-ידי הוספת אנטיביוטיקה15.
שיטה זו מתמקדת desmid בידוד (Zygnematales), אבל על ידי שינוי גודל הצמצם פיפטה נימי זכוכית, ניתן להחיל אותה את בידודה של פלנקטון בגודל שונה.

Conjugating אצות (על אף המסדר Zygnematales), הידוע גם בשם conjugatophytes, לכבוש את עמדת פילוגנטי מפתח כמו קרובי משפחה הקרובים ביותר חיים של אבות מיידית של קרקע צמחים1,2. תרביות המשובטים של אצות הובילו על מגוון רחב של מחקרים בטקסונומיה, הפיזיולוגית גנטית במהלך השנים האחרונות. הטכניקות בידוד מיקרואורגניזמים מתוך שדה טבעי יש מסורת ארוכה3,4. בשנים האחרונות, בידוד אוטומטי באמצעות cytometry זרימה טכניקות היו גם הקים5. השיטה הנפוצה ביותר והשיג תא בודד להקמתה של תרבות המשובטים הוא בידוד תא בודד באמצעות פיפטה נימי זכוכית6. שיטה מסורתית זו דורשת מיומנות, פרוטוקול נסיוני מדויק.
במאמר זה נדגים הדוגמאות של אצות מן השדה ודוגמאות הקמתה של תרבויות המשובטים של אצות חד־תאיות שהיו conjugating, כמו מינים Closterium , באמצעות פיפטה נימי של זכוכית. דגימת מים המכיל תאים וגטטיבי נאסף מתוך אתר שדה (למשל, אגם, בריכה או שדה אורז). התאים מבודד דגימת מים באמצעות פיפטה נימי זכוכית, ואז לשטוף. התאים מתורבתים במבחנה המכילה חנקן-בתוספת בינוני (CA בינוני) ב 24 ° C תחת אור: 8 16-ה-h משטר אפל. שיטה זו מתאימה גם בידוד אחרים microalgae ליצור תרבויות המשובטים.

<table><tbody><tr><td><חזק>דגימה</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פלנקטון נטו</td><td>RIGO, יפן</td><td>N-NO380T</td><td>גודל רשת: 32 ומיקרו; m</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ נייד (למשל, Nature Scope FABRE)</td><td>ניקון, יפן</td><td>ינואר: 4960759 206725</td><td>הגדלה: פי 20;</td></tr><tr><td>זכוכית מגדלת (למשל, Peak 1985 Steinheil System Magnifier)</td><td>Tohkai Sangyo Co. Ltd., יפן</td><td>1985-20</td><td>הגדלה: פי 20;</td></tr><tr><td>Spuit</td><td>EIKEN CHEMICAL CO. LTD. יפן</td> צינור <td>סטרילי מס' 4</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל (צינורות צנטריפוגה 50 מ"ל עם מכסי בורג)</td> <td>Labcon, ארה"ב</td><td>3181-345-008</td><td></td></tr><tr><td>בקבוק (בקבוק פוליקרבונט 100 מ"ל)</td> <td>AS ONE Corporation, יפן</td><td>1-7403-01</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 60 מ"מ</td><td>Asahi glass Co. Ltd., יפן</td><td>1010-060</td><td>&nbsp; לתצפית על אצות.&nbsp; 60 מ"מ/צלחת לא מטופלת</td></tr><tr><td><חזקה>הכנת פיפטות מיקרופיפטה</חזקה></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פסטר (כותנה סתומה 9 אינץ') פסטר פיפטס)</td><td>פישר סיינטיפיק, ארה"ב</td><td>13-678-8B</td><td>7 ופעמים; 225 מ"מ</td></tr><tr><td>נורת גומי (סיליקון SPOID, 1 סמ"ק)</td> <td>AS ONE Corporation, יפן</td><td>5-5669-01</td><td>10 ופעמים; 40 מ"מ</td></tr><tr><td>מלקחיים אל חלד</td><td>AS ONE Corporation, יפן</td><td>PT-09</td><td>110 מ"מ</td></tr><tr><td><חזק>בידוד תאים בודדים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>זכוכית שעון (לוח תגובת דם)</td><td>Sekiya Rika Co., Ltd, יפן</td><td>F14-155-030</td><td>לשטיפת תאים במהלך הבידוד. קוטר 22 מ"מ ועומק 1 מ"מ</td></tr><tr><td>מבחנות הברגה&nbsp;</td><td>Fujimotorika, Co., Ltd, יפן</td><td>XX142</td><td>18 &Oslash; & 170 מ"מ</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אור הפוך</td><td>אולימפוס, טוקיו, יפן</td><td>CKX41N</td><td>לבידוד אצות.</td></tr><tr><td>צלחת פלסטיק</td><td>Asahi זכוכית ושות' בע"מ, יפן</td><td>SH90-15E&nbsp;</td><td>&nbsp; 90 ופעמים; 15 מ"מ</td></tr></tbody></table>

הקמתה של תרבות המשובטים של אצות חד־תאיות שהיו conjugating

Establishment of a Clonal Culture of Unicellular Conjugating Algae

זה חיוני להקים תרבויות המשובטים microalgae לשימוש במחקרים של נושאים שונים, כגון פיזיולוגיה, גנטיקה, טקסונומיה, מיקרוביולוגיה. לכן, חשוב מאוד לפתח טכניקות כדי ליצור תרבויות המשובטים. במאמר זה נדגים הקמת המשובטים התרבויות אצה conjugating. דגימות מים נאספים מן השדה. לאחר מכן, תאים מבודדים באמצעות פיפטה נימי זכוכית, מניחים בכלי התקשורת, גדלו בתנאים מתאימים ליצירת תרבות המשובטים.

דגימת מים (Inba1) של 50 מ ל נאסף מנקודת הדגימה אחד ב אגם ענבה-numa (pH 8.1, 24.7 ° C; 35 ° 44′30. 2″N 140 ° 12′08. 2″E)-סאקורה-שי, צ'יבה, יפן, על יוני 25, 2016. דגימת מים היה מאוחסן ב 4-8 ° c למחרת אחרי האוסף, דוגמא של Closterium sp. הופרדה מרשת דגימת מים המכיל תאים וגטטיבי. חמש עשרה תאים וגטטיבי של מורפולוגיה זהה (Inba1-1,-2-3-4,-5,-6,-7, -8,-9,-10,-11,-12,-13,-14, ו-15) הם בודדו אותנו מהמתרחש המדגם, ואז לשטוף בעזרת פיפטה של שטיפת בשיטה. חמש עשרה תאים בודדים מבודדת היו תרבותי במבחנות עצמאי המכיל 15 מ"ל של מדיום CA ממוזגים. לאחר 2 שבועות של דגירה, התפשטות תאים נצפתה במבחנות 9 [Inba1-1,-3,-4,-5 (איור 2 א),-6,-9,-10,-12 (איור 2b) ו-13; בטבלה 2]. תשע התרבויות המשובטים הוקמו מ מבודד מדגם Inba1 (איור 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57761/57761fig1.jpg"> איור 1 : הזרם של תא בודד בידוד. () העברת התא אצה יעד בודד מדגם המים המקורי סטרילי בינוני בכוס השעון הראשון. (b, c) להעביר את התא שוב אל הזכוכית השעון הבא כדי לשטוף. הליך זה יש לחזור עד ישנם אחרים תאים/חומציות מאשר המטרה בטווח הבינוני; שלושה כוסות שעונים מוצגים בתרשים כאן כדוגמה. (ד) בסופו של דבר, להעביר את התא שטף מבחנה של המדיום המתאים לצמיחה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57761/57761fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57761/57761fig2v2.jpg"> איור 2 : צילומים של תאים וגטטיבי של Closterium sp. () Inba1-5 ו- (b) Inba1-12 מוצגות כאן. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57761/57761fig2v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57761/57761fig3.jpg"> איור 3 : הקמתה של תרבות המשובטים מדגם Inba1. צינורות הבדיקה תרבותי 2 שבועות צולמו מלמטה. כוכבית מציינת התפשטות תאים. סרגל קנה מידה = 2 ס מ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57761/57761fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>השם של המדיה</td>
			<td>הפניה</td>
			<td colspan="2">הערות</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="13">CA</td>
			<td rowspan="13">Ichimura ו ואטאנבי12
</td>
			<td>Ca (3)2·4H2O</td>
			<td>2 מ ג</td>
		</tr>
<tr>
<td>יודע3
</td>
			<td>10 מ ג</td>
		</tr>
<tr>
<td>מלון NH43
</td>
			<td>5 מ"ג</td>
		</tr>
<tr>
<td>Β – נה2glycerophosphate·5H2O</td>
			<td>3 מ"ג</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgSO4·7H2O</td>
			<td>2 מ ג</td>
		</tr>
<tr>
<td>ויטמין B12</td>
			<td>0.01 μg</td>
		</tr>
<tr>
<td>ביוטין</td>
			<td>0.01 μg</td>
		</tr>
<tr>
<td>תיאמין HCl</td>
			<td>1 μg</td>
		</tr>
<tr>
<td>PIV מתכות</td>
			<td>0.1 מ"ל</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fe (כמו EDTA; טוחנת 1:1)</td>
			<td>0.1 מ"ל</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>40 מ ג</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">להוסיף מים כדי ליצור 100 מ</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">pH להסתגל עם NaOH 7.2</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="7">P הרביעי מתכות</td>
			<td rowspan="7">Provasoli ו- Pintner13
</td>
			<td>נה2EDTA·2H2O</td>
			<td>100 מ ג</td>
		</tr>
<tr>
<td>FeCl3·6H2O</td>
			<td>19.6 מ ג</td>
		</tr>
<tr>
<td>MnCl2· 4H2O</td>
			<td>3.6 מ"ג</td>
		</tr>
<tr>
<td>ZnCl2*</td>
			<td>1.04 mg</td>
		</tr>
<tr>
<td>CoCl2·6H2O</td>
			<td>0.4 מ ג</td>
		</tr>
<tr>
<td>נה2MoO4·2H2O</td>
			<td>0.25 מ ג</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">להוסיף מים כדי ליצור 100 מ</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">Fe (כמו EDTA; טוחנת 1:1)</td>
			<td rowspan="3">Provasoli14
</td>
			<td>Fe (NH4)2(כל4)2·6H2O,</td>
			<td>70.2 מ ג</td>
		</tr>
<tr>
<td>Na2EDTA·2H2O,</td>
			<td>66 מ ג</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">להוסיף מים כדי ליצור 100 מ</td>
		</tr>
<tr>
<td>בינוני CA ממוזגים</td>
			<td>אייב et al.7
</td>
			<td colspan="2">דגירה תאים במדיום CA טריים במשך 14 עד 20 ימים. לאסוף את המדיום בתרבית על ידי סינון באמצעות נייר סינון איכותי, לעקר את המדיום מסוננת על-ידי autoclaving (121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות).</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">* NIES, 1.04 מ"ג ZnCl2 מוחלף על ידי 2.2 מ ג ZnSO4·7H2O.</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: ניסוחים של המדיה השתמשו במחקר זה.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>דגימת מים</td>
			<td>השם של תא</td>
			<td>סטטוס לאחר תרבות</td>
			<td>שם זן</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="15">Inba1</td>
			<td>-1</td>
			<td>תאים התרבו</td>
			<td>Inba1-1</td>
		</tr>
<tr>
<td>-2</td>
			<td>לא השתנו</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>-3</td>
			<td>תאים התרבו</td>
			<td>inba1-3</td>
		</tr>
<tr>
<td>-4</td>
			<td>תאים התרבו</td>
			<td>inba1-4</td>
		</tr>
<tr>
<td>-5</td>
			<td>תאים התרבו</td>
			<td>inba1-5</td>
		</tr>
<tr>
<td>-6</td>
			<td>תאים התרבו</td>
			<td>inba1-6</td>
		</tr>
<tr>
<td>-7</td>
			<td>לא השתנו</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>-8</td>
			<td>לא השתנו</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>-9</td>
			<td>תאים התרבו</td>
			<td>inba1-9</td>
		</tr>
<tr>
<td>-10</td>
			<td>תאים התרבו</td>
			<td>inba1-10</td>
		</tr>
<tr>
<td>-11</td>
			<td>לא השתנו</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>-12</td>
			<td>תאים התרבו</td>
			<td>inba1-12</td>
		</tr>
<tr>
<td>-13</td>
			<td>תאים התרבו</td>
			<td>inba1-13</td>
		</tr>
<tr>
<td>-14</td>
			<td>לא השתנו</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>-15</td>
			<td>לא השתנו</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 2: בידוד משפט הסיכום.

במאמר זה נדגים הקמתה של תרבויות המשובטים המינים חד־תאיות conjugating אצה שנאספו מתוך אתר שדה טבעי.

הקמתה של תרבות המשובטים של אצות חד־תאיות שהיו Conjugating

It is essential to establish clonal cultures of microalgae for use in studies of various topics, such as physiology, genetics, taxonomy, and microbiology. ...

אנו הולכים להציג את השיטה שלנו להקמת מחרוזת אצות, במיוחד קונוגטופיטים חד תאיים. לצורך הקמת זן, יש צורך באיסוף דגימת מים, המכילה אצות באמצעות עבודת שדה. דגימת המים מכילה חומרים זרים מלבד אצות.רק תא בודד מבודד מהדגימה הזו. ה-THIL מועבר למדיום נקי ומנקה שוב ושוב. הבידוד מתבצע באמצעות תהליך זה.עיקור אפשרי אם הוא מתבצע בצורה זהירה. לבסוף, התא המבודד מועבר למבחנה ונוצר זן באמצעות גידול. כאן אנו מתמקדים בצימודים חד-תאיים בהם מזוהים סוגים שונים של צורות.קונוגטופיטים חד-תאיים גדלים באזור מים מתוקים עומדים כמו אגם, ביצה ושדה אורז. מסביבות אלה, אצות המכילות דגימת מים נאספות כדי לייצר זן תרבית. נציג שיטה לאיסוף דגימות מים מסביבת האגם.רשת פלנקטון משמשת לסביבת האגם. החלק העליון של הרשת חדיר למים. האצות שנתפסו על ידי הרשת ירוכזו במיכל התחתון.רשת צולבת מאפשרת לאצות קטנות לעבור. רשת דקה נסתמת בקלות. יש להשתמש ברשת מתאימה בהתאם למטרה.הביאו את דגימת המים המרוכזת למעבדה. קונוגטופיטים חד-תאיים גדלים גם בשדה ביצה או אורז. באזור המים הרדודים הוא נדגם ישירות עם טפטפת.מים נדגמים בזהירות מפני האדמה, לא כדי להכיל את האדמה. אשר אם דגימת המים מכילה אצות. האצות, בסביבות 400 מיקרומטר ומעלה, נצפות ישירות דרך לולאה.באשר לאצות קטנות, משתמשים במיקרוסקופ נייד. דגימת מים מותקנת על מכסה צלחת פטרי ומכוסה בגוף. שיטה זו מונעת מהדגימה לנוע ומקלה על התצפית.על דגימת מים זו מתבצע בידוד של אצות. נציג את השיטה להכנת פיפטה, המשמשת לבידוד אצות חד-תאיות מדגימת מים. איך מכינים פיפטה לבידוד.הדליקו מבער אלכוהול. מחממים פיפטה פסטר סטרילית על הלהבה. הסר את הפיפטה מהלהבה ומתח אותה.חותכים את קצה הפיפטה לאורך המתאים. הקפד להשליך את נימי ההיתוך. הקפד לבדוק אם הלהבה כבויה.כדי לייצר פיפטה עדינה לבידוד, עליך לוודא שהלהבה אינה מהבהבת. מחדדים את הלהבה וממיסים את הפיפטה בקצה. בעת מתיחה, עליך לוודא שהפיפטה מחוץ ללהבה.הנה החלק המשתחווה הוא המשובח ביותר. זה אידיאלי עבור הקצה. הבועות מהפיפטה מציינות את גודל הקצה.בחר את הגודל המתאים עבור התא שיש לבודד. מוצג עבור רוחב התא של 10 עד 20 מיקרומטר. מכינים מספר מספיק של משקפי שעון הדרושים לעריסה.שים את המדיום על זכוכית שעון. לבודד תא מטרה מדגימת מים שנאספה בשטח. צינור זכוכית דק מאוד לוקח מים עקב תגובה נימית.הניחו את צינור הזכוכית ליד התא כדי להרים אותו. בודד את התא מהמדיום שעל זכוכית השעון והעביר אותו לזכוכית שעון חדשה. השתמש בפיפטה חדשה כדי להעביר את התא מזכוכית השעון הראשונה לשנייה.ועוד פיפטה לשלישית. לבסוף, התא המבודד מועבר למבחנה. באמצעות גידול מבחנה זו, מקודם ריבוי תאים ונוצר זן.התרבית עשויה להפוך לירוקה תוך שבועיים אם תצליח. במחקר הזה בודדנו 15 תאים מדגימת המים שנאספה באגם בביווה שביפן. שבועיים לאחר מכן, נצפה משקע ירוק בתשע מבחנות שסומנו במסגרת אדומה, מה שמצביע על כך שטיהור התאים של האצות נמשך.המשקעים נצפו רק עבור התאים המבודדים, מה שמראה שבידוד התאים היה מוצלח. זו השיטה שלנו להקים זן ייחודי של תרבית אצות. ניתן להקים זן תרבית אקסני אם אתה מבצע בידוד בתנאים מקובלים, כגון במזון.

establishment-of-a-clonal-culture-of-unicellular-conjugating-algae

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הזדווגות והפרדה הטטרדה נדרשים לניתוח...

הזדווגות והפרדה של הטטרדה Chlamydomonas reinhardtii עבור ניתוח גנטי

שברת את improvisus Balanus (Amphibalanus) היא דוגמנית ללמוד osmoregulation ו- antifouling. עם זאת, ההשרצה עונתיים טבעי מניב אטומטי בלתי צפוי של הזחלים cyprid. כאן, עבור culturing בכל ימות השנה של improvisus דרב פרוטוקול המתואר, כולל הייצור של הזחלים. השימוש של ספחות בתרבית במחקרים ביטוי גנים מודגם.

זיפרגליים Balanus improvisus כמודל ימית - Culturing, ביטוי גנים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לבנות מעבדה-סולם בועה עמודה photobioreactors ולהשתמש בהן כדי microalgae תרבות. הוא מספק גם שיטה לקביעת שיעור הצמיחה תרבות ותוכן השומנים נייטרלי.

טיפוח של ירוק Microalgae בועה עמודה Photobioreactors ואת וזמינותו עבור ליפידים נייטרלי

ניתוח כלל מערכת של biomolecules מרובות הוא חיוני להשגת תובנות פונקציונליות ומכניסטיות לתהליכים ביולוגיים. בזאת, פרוטוקול נרחב מתואר עבור הפקת תפוקה גבוהה של שומנים, מטבוליטים, חלבונים ועמילן ממדגם אחד שנקטפו מן התרבות Chlamydomonas מסונכרן.

שיטת הפקת מולטי-Omics לניתוח מעמיק של תרבויות מסונכרנות של הירוק Alga Chlamydomonas הקשה

Doliolids, כולל את המינים דולילטה gegenbauri, הם קטנים זואופלנקטון הג ימית של משמעות אקולוגית המצויים על מערכות משנה יצרנית המדף ברחבי העולם. הקושי של התקשות האורגניזמים העדינים האלה מגביל את החקירה שלהם. במחקר זה אנו מתארים גישות טיפוח לאיסוף, גידול ושמירה על הdoliolid דולילטה gegenbauri.

הטיפוח-תרגול של החיל הימי ( uljanin 1884) למחקרים ניסיוניים

דיוקולורה היא אורגניזם מודל מטונלי בתחומי הביולוגיה השונים. אנו מתארים שיטות דגימה, זיהוי מינים, התקנת culturing, ו culturing פרוטוקולים עבור בעלי חיים והזנה פריחת אצות. אנו מדגישים גורמי מפתח שסייעו לחזק את מערכת התרבות ולדון בבעיות וברזולוציות האפשריות.

דיגום וטיפוח בצורה מפושטת של לאראקא הקוסמופוליטן, אויקולאורה דיואיקה

פרוטוקול מתואר לשימוש בפחמן דו-חמצני בגז טבעי של גז טבעי כדי לטפח מיקרו-אצות בבריכות פתוחות של מסלולי מרוצים. הזרקת גז Flue נשלטת באמצעות חיישן pH, וצמיחת מיקרו-אצות מנוטרת באמצעות מדידות בזמן אמת של צפיפות אופטית.

צימוד לכידת פחמן מתחנת כוח עם בריכות מסלול מרוץ פתוחות אוטומטיות למחצה לגידול מיקרו-אצות

חילוץ פוליפ הוא תהליך המושרה על ידי עקה חריפה, שבה פוליפים של אלמוגים מעכלים את הרקמה המחברת אותם למושבה שלהם ומתנתקים ממנה כדי לחיות כפרטים. הפרוטוקול הנוכחי מתאר כיצד לגרום למיקרו-פרופגציה של אלמוגים על ידי חילוץ באמצעות טיפולים בהיפר-סלין או במי ים נטולי סידן.

גרימת חילוץ פוליפ במושבות אלמוגים כדי להשיג מיקרו-פרופגאטים מותאמים אישית לשימוש ניסיוני במעבדה

המחקר הנוכחי מדגיש את היתרונות של שימוש בשיטה שפיתחו ג'פרי והאמפרי למיצוי וכימות פיגמנטים מסיסי שומן ממיקרו-אצות. שיטה זו משמשת כלי רב ערך להערכת ההשפעה של גורמי גדילה על ייצור הכלורופיל ותכולת התאים באורגניזמים אלה.

הערכת ההשפעה של גורמי גדילה על ייצור כלורופילים A ו-B ממיקרו-אצות

וידאו זה מדגים תרבות חדש, שיטה שבאמצעותה הם עוברים חומוס בתרבית מחוץ הביצה עד 24 שעות. שיטה זו מאפשרת ללמוד פיתוח מוקדם (פס פרימיטיביים עד 14 סום.), תקופה המקבילה E7-9 בעכבר. יישומים של טכניקה זו כוללים electroporation, ב הכלאה אימונוהיסטוכימיה באתרו.

שיטת לתרבות מוקדם של עוברים צ&#39;יק לשעבר vivo (תרבות חדש)

למדו שיטה להקמת תרביות קלוניות של אצות חד־תאיות ממשפחת Conjugatophyta מדגימות מים טבעיות. השיטה כוללת בידוד תאים בודדים באמצעות פיפטה וגידול במדיה נקייה ליצירת זנים ייחודיים.

הקמתה של תרבות המשובטים של אצות חד־תאיות שהיו Conjugating

גלה סרטונים נוספים