צבען FM רכיבה על הסינפסה: השוואה בין דפולריזציה אשלגן גבוהה, חשמל וגירוי Channelrhodopsin
24 במאי 2018
שלפוחית סינפטית (SV) רכיבה על אופניים היא מנגנון הליבה של המערכת הסנסור הסינפסות עצביים. FM לצבוע ספיגת המחפשים לשלב בין טיפול אלטרנטיבי ונוחות האמצעי העיקרי של באופן כמותי assaying SV אנדו - ו אקסוציטוזה שחרור. כאן, אנו משווים את כל השיטות גירוי לנהוג FM1-43 רכיבה על הסינפסה דגם צומת עצב-שריר (NMJ) דרוזופילה .
המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לצפות במחזור האנדו והאקסוציטוזיס של שלפוחיות סינפטיות בהכנה חיה של צומת עצב-שריר של זחל דרוזופילה באמצעות צבעי FM פלואורסצנטיים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מדעי המוח, כגון אילו גנים קריטיים לתפקוד מחזור השלפוחית הסינפטית? היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לעקוב אופטית אחר רכיבה על שלפוחית בתכשיר חי באמצעות שלושה סוגים שונים של גירויים, דפולריזציה גבוהה של אשלגן, גירוי חשמלי או באמצעות אופטוגנטיקה.
להליך זה, הוסף את הנוגדן נגד HRP, המצומד ללקסופלור 647 למי המלח המנתחים. לאחר מכן, הוסף תעודת כיסוי מצופה אלסטומר לתא החיתוך ולאחר מכן הוסף את תמיסת החיתוך עם נוגדן HRP לתיוג המסוף הפרה-סינפטי NMJ במהלך הדיסקציה. בעזרת מכחול עדין, העבירו כוכב שלישי נודד מבקבוקון המזון לזכוכית כיסוי מצופה אלסטומר.
לאחר מכן מלאו קצה מיקרו פיפטה מזכוכית בנפח קטן של דבק, באמצעות לחץ אוויר שלילי שנוצר על ידי הפה. לאחר מכן, מקם את הזחלים, הצד הגבי כלפי מעלה, בעזרת מלקחיים והדביק את הראש להחלקת הכיסוי המצופה אלסטומר עם טיפת דבק קטנה באמצעות לחץ אוויר חיובי בפה. חזור על הליך זה עם הקצה האחורי של הזחלים, וודא שהחיה מתוחה מתוחה בין שני חיבורי הדבק.
בעזרת מספריים, בצע חתך אופקי של מילימטר אחד בחיתוך אחורי ואנכי לאורך קו האמצע הגבי. לאחר מכן הסר בעדינות את קנה הנשימה הגבי, המעיים, גוף השומן ואיברים פנימיים אחרים, המכסים את השרירים. חזור על הליך ההדבקה של ארבעת דשי דופן הגוף, הקפד למתוח בעדינות את הגוף הן אופקית והן אנכית.
לאחר מכן, הרם את ה- VNC וחתוך בזהירות את העצבים המוטוריים בעזרת המספריים והסר לחלוטין את ה- VNC. החלף את מי מלח החיתוך במי מלח נטולי סידן כדי לעצור את מחזור SV. לגירוי חשמלי, הכינו פיפטת יניקה באמצעות מושך המיקרואלקטרודות כדי להשיג את גודל ההתחדדות והקצה הנדרשים.
לאחר מכן, יש ללטש את קצה המיקרו-אלקטרודה בעזרת מיקרו-זיוף כדי ליצור התאמה הדוקה בעת יניקת עצב מוטורי יחיד. החלק את פיפטת היניקה על מחזיק האלקטרודה על מיקרומניפולטור, המחובר לצינור פלסטיק ארוך וגמיש ולמזרק. לאחר מכן, הניחו את התכשיר עם צבע FM על במת המיקרוסקופ והרימו את הבמה עד שהזחלים ופיפטת היניקה יהיו במוקד.
לאחר מכן למצוץ לולאה של עצב מוטורי חתוך, ועצב את קטע ההמי שנבחר בלחץ אוויר שלילי, שנוצר על ידי המזרק לתוך אלקטרודת היניקה. לאחר מכן, לעורר את העצב המוטורי באמצעות הפרמטרים שנבחרו כדי להניע אנדוציטוזיס SV וספיגת צבע FM 143. השלב הקריטי ביותר בשלב זה בהליך הוא לשאוב אקסון מנוע יחיד לתוך אלקטרודת היניקה בהתאמה הדוקה.
זה עשוי לדרוש קצת ניסוי וטעייה. לאחר שנמצאה אלקטרודת יניקה מתאימה, השתמש באותה אלקטרודת לכל המצבים המושווים כדי להבטיח מתח גירוי עקבי. לפריקת צבע FM, יש למצוץ את אותו עצב מוטורי לאותה אלקטרודה ולאחר מכן לעורר את העצב המוטורי להפעיל אקסוציטוזיס SV ושחרור צבע FM 143.
לגירוי channelrhodopsin, חבר נורית LED כחולה לממריץ הניתן לתכנות באמצעות כבל קואקסיאלי והנח את ה-LED ביציאת המצלמה. מקד את אלומת אור ה-LED הכחולה על התכשיר עם צבע FM באמצעות פונקציית הזום של המיקרוסקופ. השלב הקריטי ביותר בנקודה בהליך הוא לוודא שהגדרות ה-LED נשמרות קבועות ושאתה מאיר את אותו חלק של כל בעל חיים עבור כל התנאים המושווים כדי להבטיח מתח גירוי עקבי.
התחל את הגירוי הקל ועקוב עם הטיימר למשך הזמן שנקבע מראש של תקופת הגירוי האופטוגנטי. כאשר הטיימר נעצר, הסר במהירות את תמיסת צבע ה-FM והחלף אותה במי מלח נטולי סידן כדי לעצור את מחזור ה-SV. של פריקת צבע FM, התחל את גירוי האור ועקוב עם טיימר למשך הזמן שנקבע מראש של תקופת הגירוי האופטוגנטי.
כאשר תקופת הטיימר מסתיימת, הסר במהירות את תמיסת צבע FM והנח אותה עם מי מלח ללא סידן כדי לעצור את מחזור ה-SV. כדי לכמת את התמונה הפלואורסצנטית, טען אותה בתמונה J וצור הקרנה בעוצמה מקסימלית על ידי לחיצה על תמונה, ערימות, Zproject, ולאחר מכן באמצעות ערוץ אנטי-HRP 647, עבור אל תמונה, התאמה, סף והחלק את סרגל הכלים העליון עד שרק ה-NMJ מודגש. באמצעות כלי השרביט, לחץ על ה-NMJ.
אם ה-NMJ אינו רציף, החזק את לחצן ה-shift ובחר את כל החלקים. לאחר מכן שנה את התמונה לערוץ הצבע FM 143 ועבור אל ניתוח, מדידה, כדי לקבל את מדידת הקרינה. חזור על שלבים אלה עבור התמונה שלא נטענה מאותו NMJ.
ניתן להמיר FM 143 פלואורסצנטי למשקעים צפופים באלקטרונים DAB מחומצנים להדמיה באמצעות TEM. להלן תרשים סכמטי של שיטת המרת התמונות לתיוג הדרוזופילה NMJ בעקבות טעינת צבע FM 143 תלויה בפעילות. זוהי תמונת TEM מייצגת של בוטון סינפטי מסוג בר במנוחה, המראה אוכלוסייה צפופה של SVs בגודל אחיד.
תמונות אלה מציגות את הבוטונים הסינפטיים שעוררו עם דפולריזציה גבוהה של מי מלח אשלגן במשך חמש דקות ללא המרת אור או עם המרת פוטו FM 143. ניתן לראות את מבני ההומו בתפזורת כאן. והתמונות הללו מראות את הבוטונים הסינפטיים שעברו גירוי חשמלי עם אלקטרודת יניקת העצבים ב-20 הרץ למשך חמש דקות ללא המרת אור או עם המרת פוטו FM 143.
שימו לב שהשלפוחיות העמוסות בצבע נראות כהות בהרבה משלפוחיות סמוכות שנפרקו. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע דיסקציה של דבק זחלים כמו גם טעינה ופריקה של צבע FM באמצעות דפולריזציה גבוהה של אשלגן, גירוי חשמלי וגירוי אופטוגנטי של ערוץ רודופסין. מאז שצבעי FM סונתזו לראשונה על ידי פיי-מאו, צבעים רב-תכליתיים אלה שימשו לחקר גיוס תלוי פעילות של בריכות שלפוחיות נפרדות כדי לחקור את ההבדל בין אנדוציטוזיס בתיווך קלתרין, כמו גם לחקור פעילויות סינפטיות מעוררות, ספונטניות ומיניאטוריות.
ישנם גורמים רבים שיש לקחת בחשבון במהלך הניסוי הזה. בין היתר, ריכוז הסידן החיצוני, סוג שיטת הגירוי שבה אתה משתמש, כמו גם כמה זמן לטעון ולפרוק את צבע ה-FM במהלך שלבי הקליטה והשחרור. אנא קח בחשבון את הגורמים הללו בעת תכנון הניסוי שלך.
בהצלחה!
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה בוחן את מחזוריות הוסיקולות הסינפטיות (SV) בצומת העצבי-שרירי של זחלי Drosophila באמצעות צבעי FM פלואורסצנטיים. המחקר בוחן שיטות גירוי שונות, כולל דפולריזציה באמצעות ריכוז גבוה של אשלגן, גירוי חשמלי ואופטוגנטיקה, כדי להעריך באופן כמותי את האנדו- ואקסוציטוזה של ה-SV.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- העברה סינפטית
- דימוג פלואורסצנטי
רקע
- מחזוריות של וסיקולות סינפטיות (SV) חיונית לתקשורת בין-תאית בסינפסות עצביות.
- ספיגה ושחרור של צבע FM משמשים כשיטות עיקריות לבחינת מחזוריות של וסיקולות סינפטיות (SV).
- מחקר זה משתמש ב-NMJ של *Drosophila* כמערכת מודל.
- הבנת מנגנונים סינפטיים יכולה לספק מענה לשאלות יסוד במדעי המוח.
מטרת המחקר
- להשוות טכניקות גירוי שונות להנעת מחזוריות של FM1-43.
- לזהות גנים קריטיים המעורבים במחזוריות של SV.
- לעקוב באופן אופטי אחרי מחזוריות של שלפוחיות בדגימות חיות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנה חיה של NMJ מזחלי Drosophila.
- מעקב באמצעות צבע FM פלואורסצנטי להערכת מחזוריות של SV.
- השוואה בין שלוש שיטות גירוי: חשמלי, אופטוגנטי ודפולריזציה באמצעות פוטסיום.
- שלבים מרכזיים כוללים דיסקציה לצורך ההכנה ויישום של תמיסת מלח ללא סידן לעצירת מחזוריות ה-SV.
- ניתוח תמונות באמצעות ImageJ לכימות של מדידות פלואורסצנציה.
תוצאות עיקריות
- המחקר מאשר את יעילותן של כל אחת משיטות הגירוי לצורך ניתוח מחזורי ה-SV.
- הבדלים בעצימות הפלואורסצנציה מדגישים התנהגות של שלפוחיות התלויה בפעילות.
- ניתן לבצע פוטו-המרה של צבע FM לצורך ויזואליזציה משופרת באמצעות TEM.
- התוצאות מספקות תובנות לגבי התהליכים המכניסטיים העומדים בבסיס ההעברה הסינפטית.
מסקנות
- מחקר זה מאפשר הבנה מעמיקה יותר של מנגנוני המחזור של ואסיקולות סינפטיות (SV) בצומת העצבי-שרירי (NMJ).
- התוצאות סוללות את הדרך למחקר נוסף של השפעות גנטיות על התנהגות סינפטית.
- השלכות המחקר חלות על פלסטיות עצבית ומנגנונים בסיסיים בתמסורת סינפטית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הבנת מנגנוני המחזור של שלפוחיות סינפטיות היא קריטית לתיקוף מטרות במחקר של מחלות ניווניות של מערכת העצבים, שבהן תפקוד לקוי פרה-סינפטי תורם לפתופיזיולוגיה. היכולת להשוות כמותית בין שיטות גירוי מאפשרת הפחתת סיכונים מנגנונית של היפותזות טיפוליות על ידי בידוד דינמיקת השחרור הפרה-סינפטית. גישה זו תומכת בביטחון ניבוי בשלבי גילוי מוקדמים על ידי קישור הפרעות גנטיות להתנהגות תפקודית של מאגר השלפוחיות במערכת רלוונטית למחלה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בחינת היפותזות טיפוליות באמצעות כימות מחזורי של שלפוחיות התלויים בפעילות במודלים גנטיים של תפקוד סינפטי לקוי.
- ערך תפעולי: מתן אפשרות לתיקוף תפקודי של מטרות טיפוליות באמצעות מדידה ישירה של קצבי אנדו- ואקסוציטוזה פרה-סינפטיים.
- ערך ניבוי: תמיכה במיון פורטפוליו על ידי הבחנה בין תרכובות המשקמות פגמים במחזור השלפוחית לבין כאלה המשפיעות על בריאות נוירונלית כללית.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: הכנה של מערכות ביולוגיות עוברי ולידציה לסריקת תרכובות בשלב הבא, תוך שימוש בפרוטוקולים סטנדרטיים של ספיגה ושחרור של צבע FM.
- תוצרי כמות: הפקת מדידות של עוצמת פלואורסצנציה המאפשרות ניתוח תגובה למינון ואישור פגיעות (hit confirmation).
- שימוש חוזר בפלטפורמה: ביסוס זרימת עבודה להדמיה שניתנת לשימוש חוזר, התואמת למיקרוסקופיה קונפוקלית ומיקרוסקופיה אלקטרונית לצורך ולידציה מולטי-מודאלית.
מחקר טרנסלציונלי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלות: שימוש במעגל העצבי-שרירי (NMJ) של Drosophila כמודל מכניסטי לחקר מסלולים סינפטיים שמורים הרלוונטיים לניוון עצבי בבני אדם.
- המשכיות תרגומית: גישור בין ממצאי גילוי לאישור פרה-קליני באמצעות מתאם בין פגמים במחזור הצבעים לפנוטיפים התנהגותיים או אלקטרופיזיולוגיים.
- קידום מותאם סיכונים: שימוש בנתוני מחזור השלפוחיות לקבלת החלטות go/no-go בהתבסס על מעורבות המטרה והצלה תפקודית.
אינטגרציה של תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי עבודה של שלבי הגילוי המוקדמים על ידי אספקת קריאות פונקציונליות המשלבות בדיקות גנטיות וביוכימיות, ובכך תומכת במעבר מזיהוי המטרה לאופטימיזציה של המולקולה המובילה.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות על ידי קישור מניפולציה גנטית לשינויים מדידים בדינמיקה של שלפוחיות סינפטיות.
- סריקה: מאפשר סטנדרטיזציה של בדיקות באמצעות פרוטוקולי גירוי הניתנים לשחזור (K+ גבוה, חשמלי, אופטוגנטי) המניבים נתונים כמותיים של מחזור השלפוחיות.
- אנליזה: מספק קריאות מבוססות פלואורסצנציה והמרה פוטונית תואמת TEM לצורך ניתוח נתונים רב-מודאלי בעל תוכן גבוה.
- מחקר תרגומי: מקשר בין מנגנון לפנוטיפ על ידי מתן אפשרות להצליב פגמים במחזור ה-SV עם תפוקה מוטורית או הישרדות במודלים גנטיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמת דימות ניתנת להרחבה, ישימה על פני מספר קווי מוטציה ותנאי גירוי למחקרים אורכיים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית בתיקוף של מטרות סינפטיות על ידי אספקת קריאות אופטיות ישירות של גיוס מאגרי וזיקולות.
- ערך תפעולי: מבטיח שחזור באמצעות פרוצדורות סטנדרטיות של דיסקציה, גרייה ודימוג בין מעבדות שונות.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי מתן אפשרות לזיהוי מוקדם של תוצאות חיוביות שגויות (false positives) בסריקת תרכובות נוירו-פרוטקטיביות.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מטרות מותאם סיכון, בהתבסס על הצלה פונקציונלית של מחזור הוזיקולות במודלים רלוונטיים למחלה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בגנטיקה של Drosophila, נוירו-אנטומיה ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית לצורך הכנה ודימוג אמינים.
- תלוי בגישה למיקרוסקופים קונפוקאליים, ציוד גירוי (אלקטרודות יניקה, מערכות LED) ותוכנה לניתוח תמונות (ImageJ).
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרמטרי הגירוי (משך, עוצמה) כדי להבטיח השוואה בין תנאים ומעבדות שונות.
- כולל שיקולי התאמה בעת הרחבה למערכות מודל אחרות, בשל הבדלים בגודל הסינפסה, בנגישות ובניתוב גנטי.
- כולל מגבלות מעשיות כגון דליפת צבע, פוטוטוקסיות ושונות במצב הבריאותי של ההכנה, אותן יש לשלוט בהן באמצעות חזרות ובקרות.
שאלות נפוצות בתחומי הביופארמה
Chapters in this video
0:04
Title
0:42
Larval Glue Dissection
2:36
Electrical Stimulation: FM Dye Loading and Unloading
4:08
Channelrhodopsin Stimulation: FM Dye Loading and Unloading
5:21
Fluorescence Quantification
6:12
Results: Synaptic Ultrastructure with FM Dye Photoconversion to Mark Vesicles
7:22
Conclusion
