פרוטוקולים לבדיקת הרעילות של הרומן בדיקות, חרקים הביוכימיה על היתושים

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בגילוי קוטלי חרקים ושדות בקרה וקטוריים. כגון, עד כמה רעילה הכימיה הלא מעוצבת לאוכלוסייה של זחלי יתושים או מבוגרים? האם לכימיה יש פוטנציאל להתפתחות כ קוטל דם או קוטל מבוגרים?

ומה יכול להיות מסלול המסירה היעיל ביותר? היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שניתן להשתמש בה כדי להעריך את הרעילות של כימיות לא מעוצבות הרעילות של כימיה נגד מינים מרובים של יתושים וקטוריים, ו ניתן לשנות את קנה המידה שלה כדי להעריך מאות תרכובות בקיבולת תפוקה גבוהה. הדגימה של ההליך תהיה ג'זלן קאור, טכנאית מדעית מהמעבדה שלי.

כדי להתחיל, לתייג את בארות של צלחת תרבות רקמות 24 היטב. השתמש באיזון אנליטי כדי לשקול את תרכובת הבדיקה. לאחר מכן, שומם את המתחם במים מזוקקים כפול סטריליים בצינור 1.5mL, וכתוצאה מכך פתרון מלאי 80mM.

לאחר מכן, לדלל באופן סדרתי את פתרון המלאי באמצעות מים מזוקקים כפולים כדי להכין פתרונות מלאי עבודה של הריכוזים הרצויים. שים לב כי יש לקחת את הזחלים מתווספים בארות, במהלך הסרת מים עודפים, וכאשר הכימיה הבדיקה מתווספת כדי למנוע נזק פיזי לזחלים. פציעה עלולה להגביר את התמותה, ובכך לייצר תוצאות חיוביות שגויות או לפסול את הבדיקה.

השתמש פיפטה העברת פלסטיק נשא רחב להעביר חמישה זחלים instar שלישי לכל באר של הצלחת. לאחר מכן, השתמש פיפטה אחת mL כדי להסיר בעדינות את המים, ולהחליף אותו עם הנפח הרצוי של מים מזוקקים כפולים. הקפאו לא לגעת בזחלים בעת הסרת עבודת המים במהירות כדי להבטיח שהזחלים לא יתעבו, ומוסיפים בעדינות את כימיית הבדיקה על ידי צינורות נגד הצד הנגדי של באר הפלסטיק.

הוסיפו נפח בדיקה מתאים לכל באר, וסובבו בעדינות את הצלחת כדי להבטיח ערבוב אחיד. מניחים את הצלחת בתא צמיחה שמירה על מחזור אור / כהה 12 שעות ב 25 מעלות צלזיוס עם 75 עד 85 אחוז לחות יחסית. כדי לבדוק את תנועת הזחל, הקישו בעדינות על הצלחת.

אם לא נצפתה תנועה, יש לגעת בעדינות בזחל באמצעות קיסם סטרילי. ציון הזחל כמת אם לא שמתו לב לתגובה, ולהשתמש בגיליון ניקוד כדי לתעד את המספר הכולל של זחלים מתים בכל באר, בנקודות הזמן המתוארות בפרוטוקול הטקסט. תרבות שלושה עד חמישה ימים יתושים נקבה בוגרת בכלוב פלסטיק 20 ליטר.

תווית תשע כוסות נייר גרם עם השם והריכוז של תרכובת הבדיקה. הבא, להכין פתרון מלאי 10mg/mL של תרכובת הבדיקה אצטון בקבוקון זכוכית 20mL. לאחר מכן, לדלל באופן סדרתי את פתרון המניות כדי להשיג את ריכוזי העבודה הרצויים.

נקה את מזרק הזכוכית mL אחד עם אצטון. ואז למלא אותו עם פתרון הבדיקה בריכוז המתאים. אבטח את המזרק במיקרו-מוליקט המותאם לספק נפח של 0.25uL.

לאחר מכן, השתמשו בשו שאפה כדי להסיר מהכלוב יתושים של נקבות בוגרות בני 10-5 ימים. הרדמה אותם לחמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. ואז להעביר את היתושים לצלחת פטרי.

מניחים את המנה על קרח במשך 10 דקות. על מנת למנוע פגיעה יתוש בוגר, אשר יכול לתרום לתמותה, להבטיח כי הם לא הרדמה במקרר במשך יותר מחמש דקות, או משותק על הקרח במשך יותר מ 10, ולמזער את הטיפול של יתושים. אם יש לך גישה לצלחת קרה, ומיקרומניפולטור עם שלב מטלטלין, זה עשוי עוד יותר למזער את הטיפול של היתושים.

השתמש פינצטה בסדר כדי להסיר כל יתוש מן המנה. עם מיקרו-מוליך מזרק להחיל 0.25uL של פתרון הבדיקה לבית החזה הגבי, תחת מיקרוסקופ ניתוח הבא, להעביר את היתושים לשקית נייר שכותרתו על קרח. לאטום את ה עם ריבוע רשת 10 על 10 סמ גומייה אז, להעביר אותו לתא הצמיחה, ולתרשם את מספר יתושים מתים כפי שתואר קודם לכן.

לאסוף כ 150 ארבעה עד חמישה ימים יתושים נקבה בוגרת עם שאפה, ולהעביר אותם לכלוב נפרד. הסר את מקור הסוכר שעה עד 24 שעות לפני ההזנה. הכן פתרון מלאי 80mM של תרכובת הבדיקה במים.

לאחר מכן, לדלל אותו באופן סדרתי עם מים, כדי לקבל פתרונות מלאי עבודה של הריכוזים הרצויים. כדי להשיג את ריכוזי הבדיקה הרצויים, להוסיף 40uL של כל דילול ל 960uL של דם ארנב defibrinated בצינור 1.5mL, ומערבבים על ידי צינור. מניחים מסנן חבר על יחידת האכלה ולאטום אותו עם טבעת גומי.

לאחר מכן, השתמש פיפטה להעביר מ"ל אחד של הדם עם פתרון בדיקה דרך יציאת המסירה, הממוקם בצד ההפוך של יחידת ההזנה. חבר את יחידת ההזנה ליחידת חימום. לאחר מכן, ספוגית משטח הממברנה בעדינות עם תסכמה חומצה לקטית 10 אחוז מוכן טרי.

שים את יחידת ההאכלה בכלוב. מכסים את הכלוב במטלית כהה, ומאפשרים ליתושים לאכול במשך שעה. לאחר האכלת היתושים, מניחים את הכלוב במקרר בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות כדי להרטיב את היתושים.

לאחר מכן, לספור ולתרשם את המספר הכולל של יתושים בכלוב. על ידי בחינת הבטן, לספור ולתרשם את המספר הכולל של יתושים נקבה מוזן באופן מלא חלקית. מינימום של 50 יתושים המוזנים בדם יש להשיג למנה.

הסר את כל היתושים שלא האכילו. לאחר מכן, להעביר את הכלוב לתא צמיחה, ולהשתמש גיליון ניקוד כדי לתעד את מספר יתושים מתים בנקודות הזמן המתאימות. ביום השלישי לאחר האכלת הדם, מניחים ספל ביצים בכלוב למשך 72 שעות.

השתמש במיקרוסקופ לנתח כדי לספור את המספר הכולל של ביצים המיוצרות לכל טיפול. הערכה מגע זחל בוצעה כדי להעריך את ההשפעה של amitriptyline, אנטגוניסט קולטן דופמין, על תמותה זחל לאורך זמן. הנתונים גילו כי ערך LC 50 יורד עם הזמן במהלך הניסוי.

ההשפעה של amitriptyline על התמותה של יתושים נקבה בוגרת הושווה עם bifenthrin, ושני פקדים שליליים. בהשוואה לפקדים שליליים מטופלים ובלתי מטופלים, הן amitriptyline והן bifenthrin גרמו לתמותה משמעותית בכל נקודת זמן ניסיונית. בדיקות האכלה כמותית בוצעו כדי להעריך את ההשפעה של שלוש מנות שונות של amitriptyline על פריון ותמותה אחוז של יתושים נקבה בוגרת.

הנתונים לא חשפו הבדל מובהק סטטיסטית בבריונות של יתושים שניזונו מ-amitriptyline במינון הגבוה ביותר בהשוואה לפקדים שניזונו מדם בלבד. לאחר השליטה, כל אחת מהראיות שתיארנו כאן, יכולה להסתיים תוך כשעתיים על ידי אדם אחד, אם מבוצע כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לטפל בעדינות באורגניזם, וצריך להיות עקביות במהלך יישומים אקטואליים ובמהלך ניקוד זחל או מבוגרים.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו בדיקות ביולוגיות להערכת רעילות באמצעות ספיגה, באמצעות טרסי היתושים, בדיקת בקבוק ה- CDC, ומבחן הצינור של WHO על מנת לענות על שאלות נוספות לגבי היעילות של הכימיה הלא מעוצבת, או מוצר מנוסח, ופוטנציאל להתפתחות כקוטל חרקים במגע או תרסיס חלל.