הגדרת פעילות מוסדר חמצון-חיזור המלווה של Hsp33 ומיפוי השינויים הסתגלותי על Hsp33 באמצעות ספקטרומטר מסה של המרת מימן-דאוטריום

זרימת העבודה המוצגת כאן יכולה לעזור להרחיב את ההבנה שלנו לגבי התפקיד התאי של מלווים במצבי עקה חמצונית. באופן ספציפי, זה יכול לעזור להבין כיצד מלווים מונעים צבירת חלבון במהלך תנאים מתפתחים. כי שני הגבים הללו של טכניקות שונות מספקים תובנה לגבי פעילותם של מלווים מופרדים בדגל.

זה יכול לשמש גם לחקר חלבונים אחרים לאינטראקציה כגון אינטראקציות חברתיות של אנזימים ודינמיקה של חלבונים. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון שהיא כרוכה בשימוש במכשירים שונים שעשויים לאתגר משתמשים חדשים. ראשית, סובב דגימת חלבון שהופשרה בעבר כדי להסיר אגרגטים.

לאחר מכן הוסיפו חמישה מילי-מולרי DTT ו-20 אבץ כלוריד מיקרו-מולרי ודגרו על הדגימה למשך 1.5 שעות לפחות ב-37 מעלות צלזיוס. כדי להסיר את ה- DTT, יש לאזן עמוד התפלה עם מאגר אשלגן פוספט בגודל 40 מילימולרית על ידי מילוי העמודה לחלוטין במאגר ולתת לו לטפטף החוצה. בעזרת פינצטה, דחף בעדינות כלפי מטה את מסנן הדיסק הלבן בעמודה והסר אותו.

מלאו את העמודה במאגר אשלגן פוספט וצנטריפוגה ב 1000 פעמים G למשך שלוש דקות. לאחר הצנטריפוגה העבירו את העמודה לצינור נקי והוסיפו את דגימת החלבון לאט לאמצע העמודה. צנטריפוגה של העמודה ב-1000 פעמים G למשך שתי דקות כך שהחלבון נטול ה-DTT נמצא בזרימה.

כעת בדקו את ריכוז החלבון ומדדו את ספיגתו ב-280 ננומטר. חלקו מחצית מדגימות החלבון למחוזות. דגרו את האליקוטים בתנאים אנאירוביים למשך 20 דקות להסרה מלאה של חמצן.

לאחר מכן אטמו את הצינורות בסרט פלסטיק ואחסנו את הדגימות בתנאים קרים. לאחר מכן, הוסיפו מי חמצן טריים של חמישה מילי-מולרי לדגימת החלבון הנותרת ודגרו במשך שלוש שעות בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס תוך כדי ניעור. לאחר הצנטריפוגה, בדוק את ריכוז החלבון ולאחר מכן חלק את החלבונים המחומצנים לאליקוטים ואחסן אותם בתנאים קרים.

הכן את המצע המפורק על ידי דגירה של 12 מיקרו-מולרי ציטראט סינתאז בן לילה ב-40 מילי-מולרי HEPES ו-4.5 גואנידיניום כלוריד מולרי. למחרת, פתח את תוכנת הפלואורוספקטרומטר ועבור למדידת קורס זמן. הגדר את רוחב הפס של העירור ל-2.5 ננומטר.

אורך גל העירור ל-360 ננומטר. אורך גל הפליטה עד 360 ננומטר. רוחב פס הפליטה לחמישה ננומטר.

ומרווח הנתונים ל-0.5 שניות. הגדר את הטמפרטורה ל 25 מעלות צלזיוס. הכן את הדגימה על ידי הוספת 1600 מיקרוליטר של 40 מילי-מולרי HEPES לקובט קוורץ.

הכנס את הקובט למחזיק הדגימה של פלואורוספקטרומטר ומאפשר לדגימה להגיע לטמפרטורה הרצויה. לאחר הגדרת הערבוב ל-600 סל"ד, התחל במדידה עד לקביעת קו הבסיס. כדי למדוד את צבירת הציטראט סינתאז בהיעדר מלווה, הוסף 10 מיקרוליטר של סינתטאז ציטראט מפוגל, 120 שניות לתוך המדידה.

לאחר מכן המשך במדידה למשך 1200 שניות. כדי למדוד את צבירת סינתאז הציטראט בנוכחות Hsp33 הוסף Hsp33 60 שניות למדידה. לאחר 60 שניות נוספות מוסיפים 10 מיקרוליטר של סינתטאז ציטראט מפוגל וממשיכים במדידה למשך 1200 שניות.

לאחר מכן, העלה את קובץ הנתונים לביצוע ניתוח נתונים והסרת רעשים על ידי Kfits. כדי להסיר רעש כלשהו, בחר פרמטרי ניתוח, השתמש בדגם הטוב ביותר האוטומטי ובחר רעש הוא תמיד מעל האות. הסר ידנית חריגים ברורים באמצעות הקווים המתכווננים הירוקים והאדומים שיסננו את הרעשים מעל הקו הירוק ומתחת לקו האדום.

לאחר מכן, הגדר את קו הבסיס ואת עקומת ההתאמה. לאחר החלת סף הרעש, הורד את הנתונים המעובדים. הכן דגימות מורכבות של מצע חלבון על ידי הוספת ציטראט סינתטאז ל-Hsp33 ביחס של 1 עד 1.5 ב-43 מעלות צלזיוס.

השתמש בארבעה שלבים לפחות ודגר את הדגימות למשך 15 דקות בטמפרטורה של 43 מעלות צלזיוס לאחר כל הוספה כדי לאפשר היווצרות מורכבת. צנטריפוגה את הדגימות ב-16000 כפול G בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי להסיר אגרגטים. לאחר מכן הניחו את הדגימות בתוספות זכוכית של 150 מיקרוליטר והעבירו אותן לבקבוקונים.

לאחר מכן הניחו אותם במגשים המתאימים. החזק את המאגרים H ו-D ב-25 מעלות צלזיוס והחזק את הדגימות ואת מאגר המרווה באפס עד שתי מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הפעל ידנית את כל יחידות הקירור של ספקטרומטר המסה.

ברגע שכל מערכות הקירור מגיעות לטמפרטורות היעד שלהן, הפעל ידנית גם את ה-HPLC וגם את משאבות הטעינה. פתח את התוכנה השולטת בשתי המשאבות כמו גם בתוכנה השולטת בספקטרומטר המסה וודא שה-MS במצב המתנה. לאחר מכן, נתק את שסתום היציאה HPLC ממקור MS.

שטפו את המערכת תחילה בתמיסת ניקוי משולשת. לאחר מכן עם מאגר B ולבסוף עם מאגר A.ואז הכנס את עמודת הפפסין למערכת. לאחר שטיפת המערכת בזרימה קבועה ולחץ קבוע, הכנס את שסתום יציאת ה-HPLC למקור MS והפעל את ה-MS.

כעת פתח את התוכנה. בנה רצף ריצה והזן את כל נקודות הזמן, שמות הדגימה והמיקומים במגשים, כמו גם את שמות המאגרים והמיקומים. לאחר השלמת ההפעלה, נתח את כיסוי הפפטידים של הדגימה על ידי הפעלת דגימות הבקרה הלא-דה-דוטרטיות דרך התוכנה.

העבר נתונים לתוכנת HDX Workbench ונתח את התוצאות באמצעות התוכנה. שמור את הפפטידים שנבחרו והמשך הלאה לניתוח ספיגת הדאוטריום. דנטורציה כימית מובילה לצבירה מהירה של סינתטאז ציטראט הנגרמת על ידי קיפול מחדש של חלבון שעבר דנטורציה מלאה בתנאי חיץ שליליים.

מצד שני, הצבירה המושרה תרמית נובעת מהתפתחות איטית יחסית של המצע המקופל באופן מקובל. בשתי צורות הדנטורציה, התוספת של Hsp33 מחומצן ביטלה לחלוטין את הצבירה, והורידה את קריאות ה-360 ננומטר לערכים זניחים. לנוכחות של Hsp33 מופחת לא הייתה השפעה על יציבות הציטראט סינתטאז ונתנה עקומת צבירה דומה לזו שזוהתה בהיעדר מלווה.

דפוס הדאוטרציה בין המלווה הקשור והלא קשור Hsp33 לסינתטאז ציטראט המצע שלו חושף אתר אינטראקציה של לקוח בתוך תחום מתג החמצון החיזור C-terminal של המלווה . ל-Hsp33 מופחת יש מבנה מסודר לחלוטין אך הופך לפונקציונלי כאשר הוא חש במתח חמצוני. בעוד ש-Hsp33 המצומצם והלא קשור מייצר עקומות פפטיד דומות, ה-Hsp33 המחומצן מראה הפרש דאוטרציה של 30% בין המלווה הקשור והלא קשור עם אזורים ספציפיים של החלבון הקשור המעידים על עיכוב אלוסטרי.

לאחר הקמתה, ניתן להשלים את בדיקת הפיזור תוך מספר שעות, בעוד שניתן להשלים את מתודולוגיית DHEX תוך יומיים עד ארבעה ימים אם היא מבוצעת כראוי. בזמן ניסיון הליך זה חשוב לתכנן מראש. זכור כי המצב המתואר כגון טמפרטורה, זמני דגירה ותמיסות חיץ הם ספציפיים לחלבון ויש לבצע אופטימיזציה עבור כל חלבון.

בעקבות הליך זה ניתן לבצע מתודולוגיות אחרות כגון קישור צולב או משקעים על מנת להשלים מחקרים של אינטראקציות מצעי מלווה. לסיכום, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה המבנית לחקור פלסטיות חלבונים במלווים מולקולריים.