מניפולציה מתאים חיים לבנות יציב הרכבה הסלולר 3D ללא לגרדום מלאכותי

מתודולוגיה חדשנית זו מאפשרת לנו לבנות מכלילים תלת מימדיים, המותאמים לתאים בודדים רצויים, בתת פתרון חיץ מים המכיל פולימר הידרופילי לא ספציפי, על ידי יצירת מגע יציב בין תאים לתאים. בסרטון זה, נדגים כיצד אנו מתפעלים תאים בודדים רצויים ובונים הרכבות תאיות תלת-מימדיות ללא פיגום מלאכותי. כאן נראה את ההליך הניסיוני במדיום שלנו עם Dextran כדוגמה.

כדי להתחיל, לשמור על תאים אפיתל בלוטת החלב עכבר NAMRU עם חמישה מיליליטר של DMEM, המכיל 10%FBS ו 1%פניצילין-סטרפטומיצין, בבקבוק 25 ס"מ מעוקב במשך יומיים עד שלושה ימים. כאשר מוכן להמשיך, להשתמש שאפתן כדי להסיר את DMEM בתוספת ולהוסיף שלושה עד חמישה מיליליטר של PBS, כי הוא מחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס לשטוף את התאים. באמצעות שאפה, להסיר את כל PBS מן הבקבוק.

מוסיפים 1.5 מיליליטר של טריפסין שחומם מראש ב-37 מעלות צלזיוס. אינקובט באינקובטור CO2 ב 37 מעלות צלזיוס לפחות 1-2 דקות. לאחר מכן, להוסיף 3.5 מיליליטר של DMEM המכיל 10%FBS ו 1%פניצילין-סטרפטומיצין.

פיפטה למעלה ולמטה לערבב. מעבירים את ההשעיה התא לצינור צנטריפוגה 15 מיליליטר צנטריפוגה אותו ב 417 פעמים G במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שאף את המדיום.

הוסיפו חמישה מילימטרים של DMEM טרי המכיל 10%FBS ו-1%פניצילין-סטרפטומיצין. ואם נדרש, השתמש בפתרון cryopreservation כדי cryopreserve התאים כפי שמתואר על ידי הוראות היצרן. הראשון לערבב 10 מיליליטר של DMEM בתוספת 10%FBS ו 1%פניצילין-סטרפטומיצין עם 0.8 גרם של Dextran, כדי להכין 80 מיליגרם לכל פתרון מיליליטר דקסטרן.

לערבב 200 microliters של פתרון Dextran זה עם 200 microliters של השעיית התא שהוכן בעבר, כדי ליצור השעיה התא המכיל 40 מיליגרם למיליליטר דקסטרן מדיום. כדי להתחיל, להפעיל לייזר, שים לב כי השימוש בקרן לייזר עם אורך גל באזור אדום כמעט אינפרא אדום הוא היעיל ביותר. הבא לפתוח את התוכנה על ידי לחיצה כפולה על סמל התוכנה.

לחץ פעמיים על סמל המצלמה ושים לב שהצג המתאים יצץ. לאחר מכן לחץ פעמיים על הסמלים עבור דיודה פולטת אור, המוקד להתאים, ואת השלב נע כדי לפתוח את הצגים שלהם גם כן. ראשית שני מרחבי זכוכית על מגלשת הזכוכית של המכסה התחתון.

העבר 20 microliters, Dextran שהוכן בעבר בתוספת מתלים תא על החלקת זכוכית כיסוי התחתון. לאחר מכן מקם את מחוון הזכוכית העליון על הרווחים המכסים את מתלי התא. מניחים את תא המדגם על העדשה המטרה התחתונה עם 10 microliters של מים מזוקקים עבור מיקרוסקופ טבילה במים.

חבר את עדשת המטרה העליונה בחלק העליון של תא המדגם באמצעות 10 microliters של מים מזוקקים. לאחר מכן, לחץ על לחצן ההפעלה בחלון התאורה של המיקרוסקופ כדי להפעיל את ה-LED. לחץ על לחצני הכיוון בחלון מיקום המטרה כדי להתאים את המרחק בין המדגם לבין עדשת המטרה התחתונה עד שהוא בפוקוס.

הגדר את העוצמה של כל קרן לייזר ל-1500 מילי-וואט בחלון ההטמקה של האות. לאחר מכן, לחץ על שני סמלי הלייזר כדי להקרנת קרני הלייזר במיקום אחד ולמקם שני. לחץ על לחצני הכיוונים בחלון מיקום המדגם כדי להזיז את שלב הדגימה עד שתא נלכד במיקום אחד.

לחץ וגרור את הסמן המציין מיקום שני עד שתא אחר נלכד במיקום 2. כדי להתחיל, טפל בתא בודד, כך שהוא יהיה במגע עם תא אחר. שמור על מצב זה למשך 300 שניות, כך שהתא ייחשף ללייזר למשך 300 שניות.

הקלט את ציר ה- x-y. השמן תא אחר והעבר אותו לשני התאים הראשונים כדי לבנות הרכבה שרירותית של תא דו-מימדי. לאחר מכן הזז את הבמה למעלה ולמטה כדי לבנות הרכבה סלולרית תלת-מימדית.

ודא שההרכבה עדיין יציבה גם לאחר כבה הלייזר. במחקר זה פולימרים מסיסים משמשים בבניית מכלי תא יחיד 3D. מבנה לדוגמה שנוצר באמצעות פינצטה אופטית קרן כפולה מוצג כאן.

אם הניסוי יצליח, המכלולים התאיים הללו יישארו יציבים גם לאחר כבה הלייזר. מתודולוגיה חדשה זו היא לבניית מכלילים תאיים תלת מימדיים במדיום מים עם פולימר הידרופילי טבעי. הוא צפוי מאוד להתחיל בבניית סוג כזה של מכלול סלולרי מהדור הבא עם כמה מה כלים רבי עוצמה בתחום הרפואה הרגנרטיבית והנדסת רקמות.