באתרו מיקרוסקופיה לקביעת בזמן אמת של מורפולוגיה תא חד בBioprocesses
5 בדצמבר 2019
צילום אופטי במכשיר מיקרוסקופ באתרו פותחה כדי לפקח על גודל של תאים בודדים ישירות בתא ההשעיה. מדידה בזמן אמת מתבצעת על ידי צימוד sterilizable הבדיקה צילום אופטי לניתוח תמונה אוטומטית. שינויים מורפולוגיים מופיעים בתלות במצב הגדילה ובתנאי הטיפוח.
שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח של הטרוגניות האוכלוסייה באמצעות הערכה מורפולוגית של התאים. במיקרוסקופיה של situ מאפשרת חקר תנאי טיפוח, תפוקות תהליכים ואיכות המוצר. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא מדידה במקום, המספק נתונים בזמן אמת ללא דגימה או להביא סיכון לזיהום.
במיקרוסקופיה של situ, יחד עם זיהוי תמונה אוטומטי, ניתן לספק מידע נוסף אודות מבנים תאיים, צורה והתגנונות תאים מעבר לגודלם. אפשר גם למדוד ריכוזי תאים. השיטה הוכיחה להיות כלי אמין.
שום שיטה חלופית אינה מספקת את אותו מידע בזמן כה קצר ובמאמץ נמוך להכנת מדגם. השיטה הותאמה לביו-מעבדים ומיקרואורגניזמים שונים, פטריות סיסיביות SEG, מיקרו אלרגיה ושמרים. הגשוש משמש בשילוב עם מחשב.
החומרה מורכבת מבדיקה מוט יחיד עם מצלמת CCD ברזולוציה גבוהה. תאים העוברים דרך רווח מדידה מתכוונן תצלמו על-ידי המצלמה. האור נכנס לפער מול המצלמה, כלומר התאורה היא על ידי שידור.
הגדר את פרמטרי החומרה באמצעות ריכוזי תאים המשתרעים על-פני הטווח הצפוי. התחל לבצע הכנות למדידות לא מקוונות. השתמש במד עובי כדי להתאים את רווח המדידה.
לאחר מכן סובבו את אגוז בורג החללית כדי להגדיר את פער המדידה ל-5 או פי 10 מהקטר המרבי הצפוי של התא. במחשב, פתח את תוכנת בקר הבדיקה. בתוכנה, בחר את הבדיקה הרצויה ולעבור לפעולות סעיף.
לאחר מכן הקש Connect. לאחר מכן, עבור אל הכרטיסיה בקרת בדיקה ופתח אותה. התחל הזרמת וידאו על-ידי לחיצה על לחצן ההפעלה.
תקן את הגשוש חצובה ובצע את השלבים הבאים עבור כל מדידה. עבוד עם הגשוש ותרסס אתנול בפער המדידה. יש לנגב בזהירות כל אבק או לכלוך באמצעות נייר אופטי.
במחשב, השתמש בתצוגה חיה כדי לבדוק כי הזכוכית של החיישן הוא ללא חלקיקים. לאחר מכן, מקם נייר אופטי יבש בפער המדידה להתמקדות. סובב את בורג הכריכה כדי להזיז את המוקד באופן ידני.
הפסק להתמקד כאשר סיבים בודדים של הנייר בפער המדידה נראים בבירור. עכשיו, קבל צינור מלא במרק תרבות. טובלים את המיקרוסקופ במרק, כך שהפער מכוסה לחלוטין בהשעיית תאים.
השתמש בברגים מחייבים כדי לכוונן את המוקד על התאים. לאחר התמקדות זו נעשית, לא לשנות את זה שוב במהלך הניסוי. חזור לתוכנה לניסוי.
עבור לתפריט מפעיל. תחת תפריט מפעיל, הגדר את קצב המסגרות. הרץ אחד מומלץ למדידות לא מקוונות.
משם, עבור לשדה מסגרות לכל גורם מפעיל והגדר אותו לפי הצורך עבור סטטיסטיקה טובה. הנה, בערך 200. כמו כן, עבור לתפריט כללי.
שם, בחר את הספריה שבה יישמרו התמונות. התחל רכישת תמונה באמצעות לחצן התחל רכישת גורם מפעיל של תמונה. הזז בעדינות את הצינור כדי לגרום לזרימה בפער המדידה.
השתמש בתמונות מההפעלה הראשונה של הניסוי כסט אימונים. יש את תוכנת קוד פתוח פיג'י מוכן ושחרר את התמונות מהניסוי לתוך החלון שלה. לאחר שתסיים, בחר נתח ולאחר מכן לחץ על כלים ולאחר מכן על מנהל ההשקעות.
לאחר מכן, בחרו כלי בחירה. בתמונה, החלט על חלקיק כדי להוסיף ביאורים בפוקוס. צייר עיגול סביבו בעזרת כלי הבחירה.
לחץ על הוסף כדי להוסיף את הביאור למנהל ההשקעות. לאחר מכן, בחרו כלי מברשת ובחרו גודל פיקסל מתאים. השתמש בכלי המברשת כדי למקד את הבחירה.
המשך לסמן את כל האובייקטים המעניינים באותו אופן בכ- 15 תמונות. שמור את הקבצים המבארים ולהשתמש בהם כסט אימונים. כאשר אלגוריתם הזיהוי מאומן ומוכן, השתמש בו כדי להמחיש תוצאות.
במנתח התוצאות, עבור אל קובץ ואחריו ייבוא קובץ. שם, בחר את קובץ התוצאות הרצוי. המשך על-ידי לחיצה על לחצן צור תרשים.
בחר תרשים תפוצה. זה יציג את ההתפלגות המורפולוגית של התרבות. חזור אל יצירת תרשים כדי לבחור התוויית רגישות.
המידע המוצג יכול לסייע בקביעת מספר התאים שיש לנתח כדי להשיג את הדיוק הרצוי. בצע מדידות מקוונות לאחר השלמת מדידות לא מקוונות. למדידות מקוונות, חבר את הגשוש ישירות לביו-ריירקטור.
לאחר ההתחברות, יש לעקר כראוי את ההרכבה. בחר פיקוח בלוח המחוונים. יש כפתור הפעלה כדי להתחיל רכישת תמונה ולחצן עצירה כדי לסיים אותו.
לחץ על לחצן ההפעלה. בביו-ריירקט, התחילו לחיסון התרבות. המצלמה תלכוד וידאו של התאים ותזהה אותם באופן אוטומטי לניתוח.
הניטור מספק נתונים מקוונים של גדלי תאים וצורות של מורולוגיות תאים שונות במהלך התסיסה כולה. ניתן לעצב את התוצאות בזמן אמת בדרכים שונות וגם לייצא אותן לניתוח נוסף. חלקה זו של התפלגויות מצטברות של קוטר תא S.Cerevisiae נוצרת מנתונים שנותחו באמצעות טכניקה זו.
הוא מדגים את זיהוי התאים האוטומטי מסוגל להבחין בין תאים ניצנים ותאים שאינם ניצנים. העקומה המוצקה היא ההתפלגות במהלך הטיפוח בשלוש שעות. העקומה המנוקדת היא התפלגות של אותו טיפוח בשבע שעות.
העקומה המקווקות מייצגת נתונים שנאספו ב- 13 שעות. הליך הביאור גוזל זמן רב, אך הוא המפתח להשגת הדיוק הרצוי עבור זיהוי התא. בהליך זה, אם זמני המדידה קצרים יותר מדינמיקת התהליך, ניתן להשתמש במדידה בזמן אמת לבקרת פרוצס.
טכניקה זו סוללת את הדרך לשימוש במדידת הטרוגניות האוכלוסייה כפי פרמטר תהליך לגידול מיקרוביאלית מהצעדים המוקדמים של פיתוח תהליכים לקנה מידה של ייצור.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מכשיר מיקרוסקופיה פוטו-אופטי in situ פותח כדי לנטר את גודלן של תאים בודדים ישירות בתמיסת התאים. טכניקה זו מאפשרת מדידה בזמן אמת של שינויים מורפולוגיים בתאים בהתבסס על מצב הצמיחה ותנאי הגידול שלהם.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- ביולוגיה של התא
- טכניקות מיקרוסקופיה
- דימיון בזמן אמת
רקע
- הטרוגניות של האוכלוסייה היא קריטית להבנת התנהגות תאית.
- מיקרוסקופיה in situ מספקת תובנות לגבי תנאי הגידול ואיכות המוצר.
- זיהוי תמונות אוטומטי משפר את איסוף הנתונים.
- השיטה ממזערת סיכוני זיהום הקשורים לדגימה.
מטרת המחקר
- להערכת מאפיינים מורפולוגיים של תאים בזמן אמת.
- להערכת ההשפעה של תנאי גידול שונים על גודל התאים וצורתם.
- לספק כלי מהימן למדידת ריכוזי תאים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- מכשיר מיקרוסקופיה פוטו-אופטית in situ
- ניתוח תמונות אוטומטי
- ניטור בזמן אמת של תאים בודדים
- הערכה של שינויים מורפולוגיים
תוצאות עיקריות
- איסוף נתונים בזמן אמת ללא סיכוני זיהום.
- יכולת למדוד אגלומרציה ומבנה של תאים.
- הערכה מהימנה של גודל התאים וריכוזם.
- תובנות לגבי השפעת תנאי הגידול על מורפולוגיית התאים.
מסקנות
- השיטה שפותחה יעילה לחקר דינמיקה של תא בודד.
- מיקרוסקופיה in situ יכולה לשפר משמעותית את הבנתנו לגבי תהליכים תאיים.
- טכניקה זו היא כלי בעל ערך עבור חוקרים בביולוגיה של התא.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מיקרוסקופיה בzaman-אמת in situ מאפשרת ניטור ישיר, נטול זיהומים, של מורפולוגיה של תאים בודדים והטרוגניות של אוכלוסיות בתהליכים ביולוגיים. יכולת זו מספקת תובנות שניתן ליישם בנוגע למצב התא, לתנאי התהליך ולאיכות המוצר, ובכך תומכת בביטחון חיזוי בנקודות תפנית קריטיות של גילוי ופיתוח. שילוב של ניתוח תמונה אוטומטי עם מודלים של רשתות עצביות משפר עוד יותר את האמינות והיכולת להרחבה (scalability) של הערכות מורפולוגיות במערכות מיקרוביאליות מגוונות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר הערכה כמותית של מורפולוגיית התאים כמדד תפקודי להפחתת סיכונים ביולוגיים.
- תומך בזיהוי של עקה תאית מושרית-תהליך ומעברים במצב הצמיחה הרלוונטיים לתיקוף המטרה.
- מקל על בדיקה מהירה של השערות בנוגע להשפעת תנאי הגידול על הפנוטיפ של התאים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק התפלגויות סטנדרטיות וניתנות לשחזור של גודל ומורפולוגיה של תאים בודדים לצורך פיתוח בדיקות.
- מספק פלטיים כמותיים בזמן אמת המתאימים לסריקה בשפיות גבוהה ולאופטימיזציה של תהליכים.
- מפחית את הטיפול הידני בדגימות, ובכך ממזער את הסיכון לזיהום ומגביר את היעילות התפעולית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מאפשר ניטור של הטרוגניות האוכלוסייה כסמן ביולוגי תרגומי לעקביות התהליך.
- תומך ברצף מפיתוח תהליך מוקדם ועד לקנה מידה של ייצור, על ידי מתאם של נתונים מורפולוגיים עם פעילות מטבולית והצטברות מוצר.
- משפר החלטות קידום מותאמות סיכון באמצעות אספקת תובנות מורפולוגיות בזמן אמת, הספציפיות לאורגניזם.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
פלטפורמה זו למיקרוסקופיה in situ משלבת שלבים החל מגילוי מוקדם, דרך פיתוח תהליכים ועד לייצור, ומאפשרת ניטור ובקרה רציפים של מורפולוגיית תאים ודינמיקה של אוכלוסיות.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות ובבירור מסלולים על ידי קישור שינויים מורפולוגיים לתנאי הגידול ולמצב התא.
- סריקה: מספקת נתונים מורפולוגיים כמותיים הניתנים לשחזור, לצורך מוכנות הבדיקה והערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מספקת ניתוח תמונות אוטומטי מבוסס רשת עצבית להשוואה סטטיסטית חזקה של אוכלוסיות תאים.
- מחקר תרגומי: מתאימה ניטור מורפולוגי לסמנים ביולוגיים רלוונטיים לתהליך, לצורך המשכיות שלב הפיתוח הפרה-קליני והייצור.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה ניתנת להרחבה ולהתאמה לאורגניזמים שונים, לניטור ואופטימיזציה מתמשכים של התהליך.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: משפר את הביטחון החזוי ואת תיקוף המטרה באמצעות כימות של הטרוגניות האוכלוסייה ושינויים מורפולוגיים.
- ערך תפעולי: מייעל את זרימות העבודה באמצעות ניתוח אוטומטי בזמן אמת והפחתה של התערבות ידנית.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס להחלטות המשך או עצירה (go/no-go) ולהתאמות בתהליך באמצעות נתונים ברי-ביצוע בתדירות גבוהה.
- השפעה על פורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון ובקידום של מספר תהליכים ביולוגיים ואורגניזמים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות באנוטציה של תמונות ובאימון רשתות נוירונים לצורך התאמה לסוגי אורגניזמים ספציפיים.
- דורש חומרת מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה ותשתית תוכנה אנליטית תואמת.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי אנוטציה ואנליזה כדי להבטיח שחזוריות.
- התאמה לסוגי תאים או לתהליכים חדשים עשויה לדרוש סטים נוספים של נתוני אימון עם אנוטציה.
- תהליך האנוטציה הוא ממושך אך קריטי להשגת הדיוק הרצוי בזיהוי התאים.
