Co-immunoprecipitation Assay באמצעות חלבונים גרעיניים אנדוגני מתאי תרבותי בתנאים ובשפתיים

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום ההיפוקסי, כגון אינטראקציות אנדוגניות ומקוריות בין גורמי שעתוק לבין רגולטורי השעתוק שלהם בתנאים היפוקסיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהתאים ההיפוקסיים נקצרים בתנאים היפוקסיים והשברים הגרעיניים משמשים למשקעים חיסוניים. פרוטוקול זה משתמש בתאי כליה עובריים אנושיים 293A הגדלים בארבע צלחות של 10 סנטימטרים.

זרע שלוש עד חמש פעמים 10 עד שישית תאים למנה ב-10 מיליליטר של מדיום הנשר המותאם של דולבקו בתוספת 10% FBS, L-גלוטמין, סודיום פירובט, פניצילין וסטרפטומיצין. תרבית התאים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס 5% פחמן דו חמצני. עשרים וארבע שעות לאחר הזריעה, כאשר התאים הגיעו למפגש של 80 עד 90%, הכניסו שתי מנות לתת-תא ההיפוקסיה בתא הכפפות של החממה עם 1% חמצן ו-5% פחמן דו חמצני ב-37 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות.

שמור את שתי המנות האחרות בנורמוקסיה. ביום שלפני קצירת התאים שטופלו בהיפוקסיה, יש לאזן מראש את DPBS לתנאים היפוקסיים על ידי הנחת בקבוק ריאגנט זכוכית חשוף של 100 מיליליטר מלא ב-DPBS בתת-תא ההיפוקסיה למשך 24 שעות. כשעה לפני קצירת התאים, הנח קופסת קרח המכילה קרח בתא העיבוד של תא הכפפות, שאוזן ל-1% חמצן ו-5% פחמן דו חמצני.

העבירו את הבקבוק המכיל את ה-DPBS ההיפוקסי המאוזן מראש מתת-תא ההיפוקסיה לתא העיבוד והניחו אותו על קרח. ארבע שעות לאחר הטיפול בהיפוקסיה, העבירו את התאים מתת-תא ההיפוקסיה לתא העיבוד שאוזן מראש ל-1% חמצן ו-5% פחמן דו חמצני. הסר את מדיום התרבות על ידי שאיפה ובעזרת פיפטה של 10 מיליליטר, שטוף את התאים פעם אחת עם 10 מיליליטר DPBS היפוקסיים מאוזנים מראש כקרח.

בעזרת פיפטה של חמישה מיליליטר, הוסף 5 מיליליטר של DPBS מאוזן מראש קר כקרח ועקר את התאים על ידי גירוד בעזרת מגרד תאים. הטה את לוחית תרבית התאים, אסוף את התאים המנותקים באמצעות פיפטה של 10 מיליליטר והעביר את תרחיף התא לצינור חרוטי של 15 מיליליטר. שמור את צינור התאים על קרח.

פתח את הדלת בין תאי העיבוד והחיץ בתא הכפפות, ששניהם אוזנו מראש ל-1% חמצן ו-5% פחמן דו חמצני. העבירו את הצינורות החרוטיים של 15 מיליליטר על קרח המכילים תאים שטופלו בהיפוקסיה מתא העיבוד לתא החיץ. פתח את דלת תא החיץ והסר את התאים לחלוטין מתא הכפפות.

גלולה גם את התאים ההיפוקסיים וגם את התאים הנורמוקסיים על ידי צנטריפוגה ב-1000 פעמים גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. ערכת מיצוי גרעיני תשמש להליך זה. התחל בהשעיה עדינה של כל כדור תא ב-500 מיקרוליטר של מאגר ליזה NL, בתוספת קוקטייל מעכב פרוטאז 1X ב-DTT מולארי של 0.1 על ידי פיפטינג למעלה ולמטה מספר פעמים.

הוסף 25 מיקרוליטר של תמיסת חומר ניקוי NP לתרחיף התא ולמערבולת למשך 10 שניות במהירות מרבית. צנטריפוגה ב 1000 כפול 10 גרם בארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. הצילו גם את הסופרנטנט וגם את הגלולה הגרעינית.

לאחר איסוף ואחסון הסופרנטנט כמתואר בפרוטוקול הטקסט, השעו מחדש את גרעיני התאים המכילים גלולה ב-500 מיקרוליטר של מאגר ליזה NL, בתוספת קוקטייל מעכב פרוטאז 1X ו-0.1 DTT מולארי על ידי מערבולת למשך חמש שניות במהירות מרבית. השעו מחדש את הגלולה הגרעינית ב-50 מיקרוליטר של מאגר מיצוי NX1, בתוספת קוקטייל מעכב פרוטאז 1X על ידי פיפטינג של הגלולה למעלה ולמטה מספר פעמים. דגירה על קרח למשך 30 דקות.

כל חמש דקות מערבולת למשך 10 שניות במהירות מרבית. צנטריפוגה בטמפרטורה של 12, 000 x גרם בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. אוספים את הסופרנטנט ומעבירים למכשירי מיני דיאליזה בנפח מרבי של 100 מיקרוליטר ליחידה להתפלה.

מכסים את מכשירי המיני דיאליזה ומניחים אותם במכשיר ציפה. הכניסו את מכשיר הציפה לכוס המכילה 500 מיליליטר של מאגר דיאליזה מקורר מראש. היזהר להימנע ממגע ישיר עם העור או משאיפת מאגר הדיאליזה, מכיוון שהוא מכיל PMSF.

דוגרים בארבע מעלות צלזיוס תוך ערבוב עדין במשך 30 דקות. לאחר 30 דקות, אספו את הדגימות מפינת מכשירי המיני דיאליזה והעבירו לצינורות מיקרו-צנטריפוגות חדשים של 1.5 מיליליטר. צנטריפוגה ב -12 אלף פעמים גרם בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.

יש לשים 25 מיקרוליטר מכל סופרנטנט לתוך צינור צנטריפוגה של 1.5 מיקרוליטר ולאחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס. הכן את חרוזי הספרד של החלבון AG לשימוש במערכת החיסון. הכניסו 50 מיקרוליטר של חרוזים לכל אחד מארבעה צינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר והוסיפו 500 מיקרוליטר של מאגר DPBS לכל צינור.

גלולה את החרוזים על ידי צנטריפוגה. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את החרוזים ב-100 מיקרוליטר של מאגר TBS. הוסף שני מיקרוליטרים של נוגדן חד שבטי נגד ARNT של עכבר או אימונוגלובולין G של עכבר שהוכן על ידי בנייה מחדש של 0.7 מיליגרם של IgG של עכבר ב-500 מיקרוליטר של מאגר TBS.

קח את צינורות המיקרו-צנטריפוגה המכילים את החרוזים לחדר קירור. מניחים אותם במסובב צינור ודוגרים ב -10 סל"ד למשך שעתיים. לאחר שעתיים, גלו את החרוזים על ידי צנטריפוגה והשליכו את הסופרנטנטים.

לדלל 200 מיקרוגרם של ליזאט החלבון הגרעיני שהוכן קודם לכן ב-800 מיקרוליטר של מאגר משקעים חיסוני. דגרו את הליזאט עם החרוזים המצומדים לנוגדנים בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת, גלו את החרוזים על ידי צנטריפוגה ב -3000 פעמים גרם למשך שתי דקות בארבע מעלות צלזיוס.

השליכו את הסופרנטנט. הוסף מיליליטר אחד של TBS קר כקרח המכיל 0.2% NP-40 לכל צינור וסובב כלפי מטה. באופן זה יש לשטוף את החרוזים שלוש פעמים עם TBS קר כקרח המכיל 0.2% NP-40.

מרתיחים את החרוזים ב -50 מיקרוליטר של מאגר דגימת Laemmli בחום של 95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. צנטריפוגה את החרוזים ב -10 אלף פעמים גרם בארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. אוספים את הסופרנטנט וזורקים את החרוזים.

רמות הביטוי בלוקליזציה תת-תאית של מרכיבי קומפלקס HIF-1 לאחר טיפול בהיפוקסיה נבדקו בתאי HEK293A. כצפוי, רמות HIF-1a הכוללות היו מווסתות על ידי היפוקסיה בעוד שרמות ARNT בסך הליזטים התאיים לא השתנו באופן משמעותי. בנוסף, היפוקסיה גרמה להצטברות גרעינית של HIF-1a ו-ARNT.

ניסויי קו-אימונופרספיטציה בוצעו באמצעות תמציות גרעיניות מתאי HEK293A שנחשפו לתנאים נורמוקסיים או היפוקסיים. כפי שמוצג כאן, HIF-1a הועבר יחד עם ARNT מהתמציות הגרעיניות של תאי HEK293A היפוקסיים, מה שמצביע על כך ש-HIF-1a מקיים אינטראקציה עם ARNT בתנאים היפוקסיים. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום ההיפוקסיה לחקור אינטראקציות חלבון גרעיני אנדוגניות ואת התנאים ההיפוקסיים שלהן.