קביעת חלוקה למחיצות של קרום פלזמה חלבונים הקשורים באופן עקיף

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בביולוגיה של התא, כולל פענוח מסלולי איתות תאים. אז היתרון העיקרי של הטכניקה הזו הוא שהיא למעשה לא דורשת גישות מיקרוסקופיות מתוחכמות. הוא גם מהיר מאוד ולכן שמיש לתצפית בזמן אמת על התפלגות החלבון בתאים.

ההערכה והכימות של חלוקת הממברנה של חלבון הקשור היקפי מסובכת עקב עקיפה של אור הגורמת לערבוב של קרום פלזמה ופלואורסצנטיות ציטופלזמית תחת המיקרוסקופ. התחל הליך זה בהכנת חומר ביולוגי כמתואר בפרוטוקול הטקסט. מכתים את החומר המוכן בצבע FM 4-64 על ידי מריחת פרוטוקול צביעה המתאים לחומר הנחקר.

עבור תאי טבק BY-2, יש לצבוע 200 מיקרוליטר של תרחיף תאים עם 0.2 מיקרוליטר של תמיסת FM 4-64 של 10 מילי-מולרית בדימתיל סולפוקסיד. כדי ללכוד חתך קונפוקלי משווני אחד לכל תא אחד, הגדר סריקה דו-ערוצית רציפה עבור הכרומופור המשמש כתג החלבון ועבור FM 4-64. הגדר גם רזולוציה אופטית גבוהה יותר.

הגדרה לדוגמה היא יעד טבילה בשמן פי 63 עם צמצם מספרי של 1.3 וגודל תמונה של 1, 024 על 1, 024 פיקסלים. התקן את Fiji ImageJ Distribution ואת ציוד המאקרו ההיקפי הנדרש. בפיג'י, בחר תוספים, לאחר מכן פקודות מאקרו, ולאחר מכן התקן בתפריט הראשי וציין את הנתיב לקובץ שהורדת עם ציוד המאקרו ההיקפי של ImageJ.

התקן את תוכנת R Project ואת החבילות הנדרשות. הפעל את ממשק המשתמש הגרפי R, בחר חבילות, ולאחר מכן התקן חבילות בתפריט הראשי, וציין את המאגר הקרוב ביותר וכן את החבילה ggplot2 להתקנה. הורד את הציוד ההיקפי של חבילת R.

התקן אותן על-ידי בחירת חבילות ולאחר מכן התקן חבילות מקבצים מקומיים. עבד את התמונות הקונפוקליות של הסמן הציטופלזמי. לשם כך, ייבא את התמונות לפיג'י באמצעות תוספים ולאחר מכן ביופורמטים, ולאחר מכן מייבא ביופורמטים מתפריט פיג'י עם הגדרות ברירת המחדל.

הפעל את המאקרו אפשרויות ייבוא עבור הגדרת ניתוח. הפעל את המאקרו על ידי בחירת אותו פריט לאחר לחיצה על תפריט החלבון ההיקפי של כלי התפריט. הגדר את הערך המתאים בפיקסל רדיוס טשטוש גאוס.

זה משפיע על החלקת התמונה והפחתת הרעש. ערך נמוך מספיק ואינו גורם לאובדן מידע על התמונה. כעת הגדר ערך בפרופיל השדה: רוחב קו פיקסל.

קו עבה יותר גורם להחלקה גבוהה יותר של עקומות הפרופיל. מומלץ להשתמש בערך ברירת מחדל של 10 פיקסלים. הגדר כותרת תמונה, ניתוח לפי ההגדרה של מפרידים לדוגמה ופריטים מיוצאים.

לחץ על OK. בדוק את ניתוח הכותרת בחלון הדו-שיח הבא ולחץ על אישור או אחורה כדי לאפס. לאחר מכן, בצע בחירה ליניארית על פני אזור קרום הפלזמה בתמונות המעובדות ומדוד את פרופילי הקרינה. לשם כך, בחר את הקו הישר של הכלי פיג'י מסרגל הכלים של פיג'י.

לחץ על התמונה וגרור קו על פני אזור קרום הפלזמה. הקו חייב להתחיל בחלל החוץ-תאי וצריך להיות בניצב לקרום הפלזמה. בחר אזורים עם שכבה עבה והומוגנית יותר של ציטופלזמה קליפת המוח.

האורך האופטימלי של הבחירה הליניארית הוא חמישה עד 10 מיקרון. הפעל את המאקרו לקחת פרופיל על ידי לחיצה על כלי לקחת פרופיל בסרגל הכלים של פיג'י. המדידה האוטומטית של פרופילי הקרינה בשני הערוצים תבוצע, והנתונים יוצגו בחלון התוצאות.

על פי שונות האות האינדיבידואלית, קח מספרים מייצגים של הפרופילים עבור כל תא. הפעל את מאקרו נתוני פרופיל העלילה להדמיה גרפית של הפרופילים הנמדדים. הגדר את הפרמטר בחלון הדו-שיח של המאקרו המופעל.

השאר את תיבת הסימון השתמש בסינון עבור נתוני קלט לא מסומנת. ציין אם יש ליצור את העלילה מנתונים אחרונים בחלון התוצאה מקובץ CSV יחיד או מכל קבצי ה- CSV בספרייה שצוינה על ידי לחיצה על לחצן האפשרויות המתאים. ציין אילו גורמי קיבוץ ישמשו עבור ההתוויה על-ידי בחירת תיבות הסימון המתאימות.

בחר את הגורם I אם כל הפרופילים צריכים להיות מוצגים בעלילות ייחודיות. השאר את תיבות הסימון לא מסומנות אם יש להתוות את כל הנתונים בתרשים יחיד. לחץ על OK. ציין את הנתיב ואת שם הקובץ לשמירת התוצאות או לייבוא נתונים בסופו של דבר בחלון הדו-שיח הבא.

אשרו את הניתוח בלחיצה על 'אשר' בחלונות הדו-שיח, המציגה את קוד R שבוצע. הפעל את מאקרו הגדרת סינון הפרופילים אם לחלק מהפרופילים המתווים יש אותות מוגזמים במרחב החוץ-תאי או התוך-תאי. עקוב אחר הגדרת הפרמטרים בחלון הדו-שיח של המאקרו המופעל.

עבור כל ערוץ, הגדר את סף העוצמה המתאים בקובץ, הסר מדידות עם אות חוץ-תאי או תוך-תאי מוגזם. ציין את האזור שבו יוחל סף העוצמה בשדה בקואורדינטות X נמוכות או גדולות מ- ולאחר מכן לחץ על אישור. הפעל שוב את המאקרו של נתוני פרופיל ההתוויה כאשר תיבת הסימון השתמש בסינון עבור קלט נתונים שנבחרה. כעת הוסף את הנתונים מהקובץ שנשמר בעבר.

ודא שכל הפרופילים החריגים הוסרו בהצלחה, אחרת, שפר את פרמטרי הסינון. הפעל את מאקרו מודל היצירה כדי ליצור מודל של קרום הפלזמה והתפלגות הקרינה הציטופלזמית על סמך נתוני הכיול. לאחר הגדרת הפרמטרים בחלון הדו-שיח של המאקרו המופעל כמפורט בפרוטוקול הטקסט, לחץ על אישור. ציין את הנתיב והשם של קובץ הקלט בחלונות הדו-שיח הבאים ואשר את הניתוח על ידי לחיצה על אישור בחלון הדו-שיח המציג את קוד R שבוצע.

לאחר מכן, עבדו את התמונות של התאים המבטאים את החלבון המעניין. ייבא את התמונות והגדר את הניתוח כמו קודם. ההחלקה ורוחב הקו צריכים להיות זהים.

המשך למדוד את הפרופילים. בדוק את דיוק הפרופילים על ידי התוויה, והגדר את הסינון במידת הצורך כמתואר קודם לכן. הפעל את חישוב מאקרו ההתפלגות לחישוב חלוקת חלבון בין קרום הפלזמה לציטופלזמה.

ציין נתוני קלט ומקורות מודל ובסופו של דבר הגדר סינון נתונים. השאר את תיבת הסימון מופעלת להסרת תוצאות עם שונות שיורית גדולה יותר מאשר אם רצוי סינון תוצאות. ציין את הסף של השונות השיורית המקסימלית המותרת שיכולה להיות בלתי מוסברת על ידי פירוק האות של מדידת הפרופיל הבודדת.

בחר גורמי קיבוץ לדוגמה, שעשויים לשמש ליצירת עלילת תיבה. לחץ על OK, ציין את נתיבי הקלט או הפלט ואשר את הניתוח על-ידי לחיצה על OK בחלון הדו-שיח המציג את קוד R שבוצע. מוצגת כאן תמונה של תא מוכתם FM 4-64 המבטא חלבון צמחי, הקשור לקרום הפלזמה באמצעות N-myristoylation ואינטראקציה אלקטרוסטטית לפוספואינוזיטידים.

אינטראקציות אלה הופרעו באופן ניסיוני על ידי וורטמנין. החשיבות של N-myristoylation נבדקה על ידי מוטציה בגליצין במיקום חומצת האמינו השנייה המשמשת כאתר N-myristoylation. ההשפעה של הסרת שתי יכולות הקישור של קרום הפלזמה נבדקה על ידי חיתוך של תחום ה-N-terminal של החלבון.

תרשים הקופסה המתקבל מראה ירידה בזיקה של קרום הפלזמה לאחר מוטציה של אתר N-myristoylation ולאחר טיפול תרופתי. ההשפעה ההדדית שלהם דומה להשפעה של הסרת תחום ה-N-terminal. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע את השלבים העיקריים של הניתוח בסדר נכון וכיצד להגדיר את הפרמטרים שלהם.

בעקבות ניתוח זה, ניתן לבצע שיטה סטטיסטית כמו ANOVA להערכה סטטיסטית של הנתונים שהושגו. למרות ששיטה זו פותחה עבור תאי תרחיף צמחים, ניתן ליישם אותה גם על תאים או רקמות אחרות עם ממברנות פלזמה חלקות וניתנות להבחנה ברורה.