Name: קביעת חלוקה למחיצות של קרום פלזמה חלבונים הקשורים באופן עקיף (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-15T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: חקור שיטה חישובית לניתוח חלוקת חלבונים בקרום התא באמצעות פלואורסצנציה ותוכנת Fiji ImageJ. השיטה מאפשרת תצפית בזמן אמת ללא צורך במיקרוסקופיה מתקדמת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

פרויקט זה נתמך על ידי NPU, אני, LO1417 (משרד החינוך, נוער וספורט, של הרפובליקה הצ'כית).

<ol><li>Barbosa, I. C. R., Shikata, H., Zourelidou, M., Heilmann, M., Heilmann, I., Schwechheimer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+composition+and+a+polybasic+motif+determine+D6+PROTEIN+KINASE+polar+association+with+the+plasma+membrane+and+tropic+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Phospholipid composition and a polybasic motif determine D6 PROTEIN KINASE polar association with the plasma membrane and tropic responses.</a> Development. 143 (24), 4687-4700 (2016).</li>
<li>Kato, M., Aoyama, T., Maeshima, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23445487">The Ca2+-binding protein PCaP2 located on the plasma membrane is involved in root hair development as a possible signal transducer.</a> Plant J. 74 (4), 690-700 (2013).</li>
<li>Kubitscheck, U. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKubitscheck%2C+U+%22Fluorescence+Microscopy%3A+From+Principles+to+Biological+Applications%22">Fluorescence Microscopy: From Principles to Biological Applications</a>. , John Wiley & Sons. (2013).</li>
<li>Janecki, A. J., Janecki, M., Akhter, S., Donowitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+plasma+membrane+expression+of+a+fusion+protein+of+Na%2FH+exchanger+NHE3+and+green+fluorescence+protein+%28GFP%29+in+living+PS120+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Quantitation of plasma membrane expression of a fusion protein of Na/H exchanger NHE3 and green fluorescence protein (GFP) in living PS120 fibroblasts.</a> J Histochem Cytochem. 48 (11), 1479-1492 (2000).</li>
<li>Peitzsch, R. M., McLaughlin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+acylated+peptides+and+fatty+acids+to+phospholipid+vesicles%3A+pertinence+to+myristoylated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Binding of acylated peptides and fatty acids to phospholipid vesicles: pertinence to myristoylated proteins.</a> Biochemistry. 32 (39), 10436-10443 (1993).</li>
<li>Vosolsobě, S., Petrášek, J., Schwarzerová, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+plasticity+of+plasma+membrane+interaction+in+DREPP+family+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+-+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Evolutionary plasticity of plasma membrane interaction in DREPP family proteins.</a> Biochim Biophys Acta - Biomembr. 1859 (5), 686-697 (2017).</li>
<li>Bolte, S., Talbot, C., Boutte, Y., Catrice, O., Read, N. D., Satiat-Jeunemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FM-dyes+as+experimental+probes+for+dissecting+vesicle+trafficking+in+living+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">FM-dyes as experimental probes for dissecting vesicle trafficking in living plant cells.</a> J Microsc. 214 (2), 159-173 (2004).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>R Development Core Team. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22R%3A+A+language+and+environment+for+statistical+computing%22">R: A language and environment for statistical computing</a>. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2008).</li>
<li>Logan, D. C., Domergue, O., Teyssendier de la Serve, B., Rossignol, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+family+of+plasma+membrane+polypeptides+differentially+regulated+during+plant+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Int%22%5BJournal%5D)">A new family of plasma membrane polypeptides differentially regulated during plant development.</a> Biochem Mol Biol Int. 43 (5), 1051-1062 (1997).</li>
<li>Ide, Y., Nagasaki, N., Tomioka, R., Suito, M., Kamiya, T., Maeshima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+properties+of+a+novel%2C+hydrophilic+cation-binding+protein+associated+with+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Bot%22%5BJournal%5D)">Molecular properties of a novel, hydrophilic cation-binding protein associated with the plasma membrane.</a> J Exp Bot. 58 (5), 1173-1183 (2007).</li>
<li>Nagasaki-Takeuchi, N., Miyano, M., Maeshima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+plasma+membrane-associated+protein+of+Arabidopsis+thaliana+AtPCaP1+binds+copper+ions+and+changes+its+higher+order+structure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">A plasma membrane-associated protein of Arabidopsis thaliana AtPCaP1 binds copper ions and changes its higher order structure.</a> J Biochem. 144 (4), 487-497 (2008).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MDP25%2C+A+Novel+Calcium+Regulatory+Protein%2C+Mediates+Hypocotyl+Cell+Elongation+by+Destabilizing+Cortical+Microtubules+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">MDP25, A Novel Calcium Regulatory Protein, Mediates Hypocotyl Cell Elongation by Destabilizing Cortical Microtubules in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 23 (12), 4411-4427 (2011).</li>
<li>Qin, T., Liu, X., Li, J., Sun, J., Song, L., Mao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+microtubule-destabilizing+protein+25+functions+in+pollen+tube+growth+by+severing+actin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis microtubule-destabilizing protein 25 functions in pollen tube growth by severing actin filaments.</a> Plant Cell. 26 (1), 325-339 (2014).</li>
<li>Nagata, T., Nemoto, Y., Hasezawa, S. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0074769608624523">Tobacco BY-2 Cell Line as the &#34;HeLa&#34; Cell in the Cell Biology of Higher Plants.</a> Int Rev Cytol. 132, 1-30 (1992).</li>
<li>Hellens, R. P., Anne Edwards, E., Leyland, N. R., Bean, S., Mullineaux, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pGreen%3A+A+versatile+and+flexible+binary+Ti+vector+for+Agrobacterium-mediated+plant+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">pGreen: A versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Plant Mol Biol. 42 (6), 819-832 (2000).</li>
<li>Vermeer, J. E. M., Thole, J. M., Goedhart, J., Nielsen, E., Munnik, T., Gadella, T. W. J. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+phosphatidylinositol+4-phosphate+dynamics+in+living+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Imaging phosphatidylinositol 4-phosphate dynamics in living plant cells.</a> Plant J. 57 (2), 356-372 (2009).</li>
<li>Laňková, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+Dynamics+of+Plant+Plasma+Membrane+Proteins+with+Fluorescence+Recovery+and+Raster+Image+Correlation+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Microanal%22%5BJournal%5D)">Determination of Dynamics of Plant Plasma Membrane Proteins with Fluorescence Recovery and Raster Image Correlation Spectroscopy.</a> Microsc Microanal. 22 (2), 290-299 (2016).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

השיטה המתוארת כאן יוצר אומדן מדויק יותר של קרום פלזמה למחיצות חלבונים הקשורים באופן עקיף לעומת גישות אחרות מבוסס על מדידת עוצמות קרינה פלואורסצנטית5. השיפור העיקרי של שיטה זו הוא כי זה לוקח בחשבון את שבירת האור ואת עקרון הסופרפוזיציה של קרום הפלזמה, את האותות cytoplasmic. למרות התוצאות האלה שיטת מתאם עם התוצאות של שיטה פשוטה המבוססת על ההשוואה של עוצמת קרינה פלואורסצנטית במיקום קרום עם הממוצע cytoplasmic אות (כפי שמוצג בעבר6), היתרון העיקרי של שיטה זו הרומן היא הקביעה של הה...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/57837/determination-plasma-membrane-partitioning-for-peripherally">Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins</a>. The Affiliations section was updated.
One of the affiliations was updated from:
Department of Experimental Plant Biology, University of Science, Charles University
to:
Department of Experimental Plant Biology, Faculty of Science, Charles University

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/57837/determination-plasma-membrane-partitioning-for-peripherally">Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins</a>. The Affiliations section was updated.

Erratum: Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

באופן עקיף-הקשורים פלזמה-הממברנה חלבונים הם המרכיבים העיקריים של התא איתות המסלולים. אחד התפקידים הבסיסיים שלהם הוא שלהם האגודה קרום פלזמה ארעי, דיסוציאציה, וזה חשוב עבור אותות בין קרום פלזמה לבין הציטופלסמה. יכול להיות מצורף באופן עקיף-הקשורים קרום פלזמה חלבונים על קרום פלזמה השומנים עוגנים (N-myristoylation, S-acylation או prenylation) או על ידי השומנים מחייב תחומים (אינטראקציה עם מלחי phosphatidylinositol, חומצה phosphatidic, וכו).
קרום פלזמה מחייב מאפיינים של חלבונים אלה יכול להיות בדק ויוו, למשל, כאשר חלבון מתויג fluorescently שינה מוטגנזה של חומצות אמינו מפתח, או כאשר הוא מטופל עם מעכבי שונים המשפיעים השומנים איתות. חלוקות של חלבוני ממברנה פלזמה פריפריאלי בעיקר להיות מוערכים איכותית, במיוחד במקרים, כאשר חלוקה מחדש חלבון הוא ברור. השיטה הציג היא אופטימלית במצבים כאשר חלוקה מחדש של חלבון זה רק חלקי הערכה כמותית הוא הכרחי. בגישה בשימוש תכוף של מתי קרום פלזמה האגודה מוערך מן קונאפוקלית לייזר סריקה תמונות מיקרוסקופ כמו יחס של עוצמות קרינה פלואורסצנטית קרום הפלזמה, הציטופלסמה1,2, הוא פשוט, אבל לא . זה מדויק עוצמות קרינה פלואורסצנטית ב קרום פלזמה משקפים צירוף לינארי של קרום פלזמה, הציטופלסמה האות בשל תכונת עקיפה אור טכניקה מיקרוסקופית פלורסצנטיות מסוים של רכיבים אופטיים בשימוש3. כתוצאה מכך, האות cytoplasmic כלולה גם באיזור הממברנה. מסיבה זו, דפוס מכתימים FM 4-64 לא ניתן להשתמש כמסיכה עבור בחירת אות4ממברנה. יתר על כן, מדידות פשוטות של קרום אות במיקום המוגדר על-ידי FM 4-64 מכתים המרבי תמיד באופן שיטתי מגזים האות קרום פלזמה האמיתי של חלבון קרום פלזמה הקשורים באופן עקיף כתוצאה הסופרפוזיציה של ממברנה, cytoplasmic המתחם. המרבי של אותות שנצפה מתויג fluorescently חלבונים הקשורים באופן עקיף גם לא לשפה משותפת עם המרבי של דה מרקר קרום פלזמה (קרי, FM 4-64 styryl צבע), אבל הוא זז לכיוון הציטופלסמה. מגבלה נוספת היא מבוססת על העובדה FM שיא פליטת 4-64 היא רחבה יותר בהשוואה הפסגות פליטה ירוק ניאון חלבונים כמו GFP בשל אורך גל-התלות של שבירת אור3.
השיטה המתוארת כאן, האות חלבון מתויג מולבשת על ידי שתי פונקציות אמפירי המתארת את התפלגות היפותטי של קרום פלזמה ו אות ציטופלזמה, בהתאמה. זה פירוק האות מוחל על פרופילים פלורסצנטיות ליניארי שניתן להחיל על פני השטח תא בניצב קרום פלזמה בתמונות המקור, אשר רגיל, שני ערוצים מקטעים קונאפוקלית מתויג fluorescently חלבון להביע תאים עם FM 4-64 צבע תוויות.
הפונקציה הראשונה המשמש למדידות מתאר דיפרקציה של אות הציטופלסמה בקצה התא. קבלתו של פרופילי פלורסצנטיות שנרכשו בעבר נמדדו בתאים המבטאים סימן הפרוטאין. ציטופלזמה שתייגת על ידי כרומופור אותו כמו החלבון הקשורים באופן עקיף קרום פלזמה עניין. הפונקציה השנייה המתארת דיפרקציה של אות קרום פלזמה נגזרת של זריחה של FM 4-64. האות הזה מוערכת ראשית באמצעות פונקציה לפי עקומת גאוס אשר נמצא בשימוש עבור מידול משוער של אור עקיפה של המקור. שנית, מודל זה, חוקי עבור פליטת FM 4-64 אדום, מבחינה מתמטית כשהופכים את הטופס הרלוונטי עבור אורך גל פליטה של כרומופור להשתמש בתיוג של חלבונים הקשורים באופן עקיף של עניין-קרום פלזמה. שתי הפונקציות הן מנורמל עוצמת מירבית ועל ידי הממוצע מ 10% של הערכים הגבוהים ביותר עבור אות FM 4-64 ו אות cytoplasmic חלבון, בהתאמה. על ידי פירוק זה האות (שיטת המדידה מרובע לפחות לא לינאריות), היחס של קרום פלזמה לבין השבר הציטופלסמה של החלבון שנבדקו יכול להיות מוערך בקלות ובדייקנות. הממד ממשית של מקדם חלוקה למחיצות מחושב הוא בטווח של מיקרומטר, כי ריכוז עוצמה cytoplasmic מושווה ריכוז משטח על קרום פלזמה. הוא מגדיר את המרחק של קרום פלזמה אל הציטופלסמה, שבתוכו כמות זהה של חלבונים הוא מקומי כמו האזור הסמוך של קרום פלזמה. ערך זה שווה למחיצות המקדם K2 הציגה בעבר5. השיטה מהירה מאוד, הדורש יחיד רק מקטעים קונאפוקלית רכשה באמצעות סריקת מיקרוסקופ, לייזר קונפוקלי שגרתית, זה לא דורש שהמפתחות. הליבה ניתוח יושמה במארז נייד R ונכתב מאקרו נוספות של ImageJ כדי לספק ממשק משתמש גרפי להפעיל הניתוח של תיבות הדו-שיח אינטואיטיבי. תיאור מפורט יותר של השיטה ותוכנה (פורסם קודם לכן6) ניתן למצוא ב- http://kfrserver.natur.cuni.cz/lide/vosolsob/Peripheral/.
השיטה מתאימה תאים בודדים, protoplasts, רקמות, איפה קרום פלזמה של תאים בודדים ניתן להבחנה ברורה, המבטאת מבנה מתויג fluorescently של בדק חלבונים הקשורים באופן עקיף. כרומופור תואמת ל- FM צביעת 4-64 יש להשתמש. FM 4-64 פולט פלואורסצנטי אדום; לכן, יכול להיות מתויגת חלבון שנבדקו על-ידי קרינה פלואורסצנטית חלבון עם כחול, ירוק או צהוב פליטה (למשל, ה-GFP, CFP, YFP). שינוי יציב של חומר ביולוגי מומלץ מכיוון שהיא מאפשרת תצפיות ומלאכותית יותר לשחזור פחות חלבון הפצה. זה הכרחי כי החלבון שנבדקו יש התפלגות cytoplasmic יחסית הומוגנית. הלוקליזציה של חלבון את רשתית תוך-פלזמית או אחר תאיים קרום התא יכול לייצר תוצאות מלאכותי.
בנוסף, יש להשתמש באותו חומר ביולוגי לבטא סמן cytoplasmic עבור ההשוואה. תאים יכול להיהפך של chomophore חינם (זהה לזה המשמש חלבון היקפיים תיוג, למשל, ה-GFP חינם) או על ידי חלבון מתויג עניין עם קיבולת איגוד ביטל ממברנה. ממברנה איגוד קיבולת שאפשר לבטל, לדוגמה, על-ידי חיתוך של התחום מחייב ממברנה או מוטגנזה של חומצת אמינו מפתח residua (למשל, אתרים עבור N-myristoylation, S-acylation, או prenylation, וכו ').
עבור מיקרוסקופיה קונפוקלית סריקה, יש ליצור תאים על-ידי סמן קרום כמו צבען FM 4-64. אם FM 4-64 מכתים אינו מתאים חומר לימודי (עקב autofluorescence מפריעות, צבע עניים חדירה, וכו '), קרום פלזמה ניתן שכותרתו, לדוגמה, על ידי חלבון ממברנלי אינטגרלי פלזמה מתויג כדי (chomophore המתאים mCherry, RFP, וכדומה). זה חיוני כי דה מרקר יש לוקליזציה זניח בתאים ממברנה תאיים (endomembranes).
אם עובדים עם נוגדנים ודוגמאות קבוע, שניתן לתקן אנלוגי FM 4-64FX או קרום פלזמה תיוג על ידי נוגדנים נגד מטרה המתאים יכול לשמש. במקרה זה, זה חיוני כדי להעריך את התוצאות בזהירות רבה כי קיבוע הליכים יכול להוביל לאובדן סלקטיבי של חלבונים הציטופלסמה והן קרום פלזמה.

<table><tbody><tr><td>FM 4-64</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T13320</td><td>צבע ממברנת פלזמה</td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D4540 סיגמא</td><td>ממס צבע</td></tr><tr><td>ציוד רגיל (שקופיות מיקרוסקופיות, פיפטות, טיפים, צינורות)</td><td></td><td></td> <td>ציוד לתיוג תאים ומיקרוסקופיה</td></tr><tr>מיקרוסקופ <td></td><td></td><td></td><td>סריקת לייזר קונפוקלי</td></tr><tr><td>מחשב רגיל</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

קביעת חלוקה למחיצות של קרום פלזמה חלבונים הקשורים באופן עקיף

Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

שיטה זו מספקת גישה מהירה על הקביעה של קרום פלזמה חלוקת כל מתויג fluorescently שמעניינת קשורה חלבון באמצעות הפרופילים של עוצמת קרינה פלואורסצנטית על פני קרום פלזמה. קרינה פלואורסצנטית נמדד פרופילים מצוידים על ידי מודל עבור ממברנה והפצה פלורסצנטיות הציטופלסמה לאורך קו שהוחל בניצב הפריפריה התא. מודל זה נבנה מתוך הערכים עוצמת קרינה פלואורסצנטית בתאים הפניה לבטא סמן מתויג fluorescently הציטופלסמה ועם קרום פלזמה 4-64-שכותרתו ' FM. השיטה שניתן להחיל על סוגי תאים שונים, אורגניזמים; עם זאת, ניתן להעריך רק ממברנות פלזמה של תאים שאינם סמוכים. בשיטה זו מבוסס מיקרוסקופיה מהר מתאימה עבור ניסויים, שבה צפויים שינויים עדינים ולא דינמי של קרום פלזמה-הקשורים סמני ו צורך ניתן לכמת, לדוגמא, בניתוח של גירסאות מוטציה של חלבונים, מעכב טיפולים, האות התמרה חושית תצפיות. השיטה מיושמת בחבילה R בפלטפורמות כי זה משולב עם מאקרו של ImageJ המשמשת ממשק ידידותי למשתמש.

DREPP10 הוא חלבון צמחים ספציפיים הקשורים באופן עקיף-קרום פלזמה המשויך קרום פלזמה דרך של N-myristoylation יחד עם אינטראקציה אלקטרוסטטית עם מלחי phosphatidylinositol11, 12. DREPP תוארה רכיב של מכונות איתות הסידן בתא צמח ויפעל גם עם שלד התא13,14. בניסוי שהוצגו, הטבק פראי-סוג DREPP2, לגירסתו מוטנטים שאינם-myristoylated (Gly2 מוחלף על ידי Ala) היו מתויג...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לבצע ניתוח כמותי של הרמה של התאחדות קרום פלזמה מתויג fluorescently חלבונים הקשורים באופן עקיף. השיטה מבוססת על פירוק חישובית של קרום ומרכיב cytoplasmic של האות נצפו תאים עם תוויות עם סמן פלורסנט קרום פלזמה.

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בביולוגיה של התא, כולל פענוח מסלולי איתות תאים. אז היתרון העיקרי של הטכניקה הזו הוא שהיא למעשה לא דורשת גישות מיקרוסקופיות מתוחכמות. הוא גם מהיר מאוד ולכן שמיש לתצפית בזמן אמת על התפלגות החלבון בתאים.ההערכה והכימות של חלוקת הממברנה של חלבון הקשור היקפי מסובכת עקב עקיפה של אור הגורמת לערבוב של קרום פלזמה ופלואורסצנטיות ציטופלזמית תחת המיקרוסקופ. התחל הליך זה בהכנת חומר ביולוגי כמתואר בפרוטוקול הטקסט. מכתים את החומר המוכן בצבע FM 4-64 על ידי מריחת פרוטוקול צביעה המתאים לחומר הנחקר.עבור תאי טבק BY-2, יש לצבוע 200 מיקרוליטר של תרחיף תאים עם 0.2 מיקרוליטר של תמיסת FM 4-64 של 10 מילי-מולרית בדימתיל סולפוקסיד. כדי ללכוד חתך קונפוקלי משווני אחד לכל תא אחד, הגדר סריקה דו-ערוצית רציפה עבור הכרומופור המשמש כתג החלבון ועבור FM 4-64. הגדר גם רזולוציה אופטית גבוהה יותר.הגדרה לדוגמה היא יעד טבילה בשמן פי 63 עם צמצם מספרי של 1.3 וגודל תמונה של 1, 024 על 1, 024 פיקסלים. התקן את Fiji ImageJ Distribution ואת ציוד המאקרו ההיקפי הנדרש. בפיג'י, בחר תוספים, לאחר מכן פקודות מאקרו, ולאחר מכן התקן בתפריט הראשי וציין את הנתיב לקובץ שהורדת עם ציוד המאקרו ההיקפי של ImageJ.התקן את תוכנת R Project ואת החבילות הנדרשות. הפעל את ממשק המשתמש הגרפי R, בחר חבילות, ולאחר מכן התקן חבילות בתפריט הראשי, וציין את המאגר הקרוב ביותר וכן את החבילה ggplot2 להתקנה. הורד את הציוד ההיקפי של חבילת R.התקן אותן על-ידי בחירת חבילות ולאחר מכן התקן חבילות מקבצים מקומיים. עבד את התמונות הקונפוקליות של הסמן הציטופלזמי. לשם כך, ייבא את התמונות לפיג'י באמצעות תוספים ולאחר מכן ביופורמטים, ולאחר מכן מייבא ביופורמטים מתפריט פיג'י עם הגדרות ברירת המחדל.הפעל את המאקרו אפשרויות ייבוא עבור הגדרת ניתוח. הפעל את המאקרו על ידי בחירת אותו פריט לאחר לחיצה על תפריט החלבון ההיקפי של כלי התפריט. הגדר את הערך המתאים בפיקסל רדיוס טשטוש גאוס.זה משפיע על החלקת התמונה והפחתת הרעש. ערך נמוך מספיק ואינו גורם לאובדן מידע על התמונה. כעת הגדר ערך בפרופיל השדה: רוחב קו פיקסל.קו עבה יותר גורם להחלקה גבוהה יותר של עקומות הפרופיל. מומלץ להשתמש בערך ברירת מחדל של 10 פיקסלים. הגדר כותרת תמונה, ניתוח לפי ההגדרה של מפרידים לדוגמה ופריטים מיוצאים.לחץ על OK. בדוק את ניתוח הכותרת בחלון הדו-שיח הבא ולחץ על אישור או אחורה כדי לאפס. לאחר מכן, בצע בחירה ליניארית על פני אזור קרום הפלזמה בתמונות המעובדות ומדוד את פרופילי הקרינה. לשם כך, בחר את הקו הישר של הכלי פיג'י מסרגל הכלים של פיג'י.לחץ על התמונה וגרור קו על פני אזור קרום הפלזמה. הקו חייב להתחיל בחלל החוץ-תאי וצריך להיות בניצב לקרום הפלזמה. בחר אזורים עם שכבה עבה והומוגנית יותר של ציטופלזמה קליפת המוח.האורך האופטימלי של הבחירה הליניארית הוא חמישה עד 10 מיקרון. הפעל את המאקרו לקחת פרופיל על ידי לחיצה על כלי לקחת פרופיל בסרגל הכלים של פיג'י. המדידה האוטומטית של פרופילי הקרינה בשני הערוצים תבוצע, והנתונים יוצגו בחלון התוצאות.על פי שונות האות האינדיבידואלית, קח מספרים מייצגים של הפרופילים עבור כל תא. הפעל את מאקרו נתוני פרופיל העלילה להדמיה גרפית של הפרופילים הנמדדים. הגדר את הפרמטר בחלון הדו-שיח של המאקרו המופעל.השאר את תיבת הסימון השתמש בסינון עבור נתוני קלט לא מסומנת. ציין אם יש ליצור את העלילה מנתונים אחרונים בחלון התוצאה מקובץ CSV יחיד או מכל קבצי ה- CSV בספרייה שצוינה על ידי לחיצה על לחצן האפשרויות המתאים. ציין אילו גורמי קיבוץ ישמשו עבור ההתוויה על-ידי בחירת תיבות הסימון המתאימות.בחר את הגורם I אם כל הפרופילים צריכים להיות מוצגים בעלילות ייחודיות. השאר את תיבות הסימון לא מסומנות אם יש להתוות את כל הנתונים בתרשים יחיד. לחץ על OK. ציין את הנתיב ואת שם הקובץ לשמירת התוצאות או לייבוא נתונים בסופו של דבר בחלון הדו-שיח הבא.אשרו את הניתוח בלחיצה על 'אשר' בחלונות הדו-שיח, המציגה את קוד R שבוצע. הפעל את מאקרו הגדרת סינון הפרופילים אם לחלק מהפרופילים המתווים יש אותות מוגזמים במרחב החוץ-תאי או התוך-תאי. עקוב אחר הגדרת הפרמטרים בחלון הדו-שיח של המאקרו המופעל.עבור כל ערוץ, הגדר את סף העוצמה המתאים בקובץ, הסר מדידות עם אות חוץ-תאי או תוך-תאי מוגזם. ציין את האזור שבו יוחל סף העוצמה בשדה בקואורדינטות X נמוכות או גדולות מ- ולאחר מכן לחץ על אישור. הפעל שוב את המאקרו של נתוני פרופיל ההתוויה כאשר תיבת הסימון השתמש בסינון עבור קלט נתונים שנבחרה. כעת הוסף את הנתונים מהקובץ שנשמר בעבר.ודא שכל הפרופילים החריגים הוסרו בהצלחה, אחרת, שפר את פרמטרי הסינון. הפעל את מאקרו מודל היצירה כדי ליצור מודל של קרום הפלזמה והתפלגות הקרינה הציטופלזמית על סמך נתוני הכיול. לאחר הגדרת הפרמטרים בחלון הדו-שיח של המאקרו המופעל כמפורט בפרוטוקול הטקסט, לחץ על אישור. ציין את הנתיב והשם של קובץ הקלט בחלונות הדו-שיח הבאים ואשר את הניתוח על ידי לחיצה על אישור בחלון הדו-שיח המציג את קוד R שבוצע.לאחר מכן, עבדו את התמונות של התאים המבטאים את החלבון המעניין. ייבא את התמונות והגדר את הניתוח כמו קודם. ההחלקה ורוחב הקו צריכים להיות זהים.המשך למדוד את הפרופילים. בדוק את דיוק הפרופילים על ידי התוויה, והגדר את הסינון במידת הצורך כמתואר קודם לכן. הפעל את חישוב מאקרו ההתפלגות לחישוב חלוקת חלבון בין קרום הפלזמה לציטופלזמה.ציין נתוני קלט ומקורות מודל ובסופו של דבר הגדר סינון נתונים. השאר את תיבת הסימון מופעלת להסרת תוצאות עם שונות שיורית גדולה יותר מאשר אם רצוי סינון תוצאות. ציין את הסף של השונות השיורית המקסימלית המותרת שיכולה להיות בלתי מוסברת על ידי פירוק האות של מדידת הפרופיל הבודדת.בחר גורמי קיבוץ לדוגמה, שעשויים לשמש ליצירת עלילת תיבה. לחץ על OK, ציין את נתיבי הקלט או הפלט ואשר את הניתוח על-ידי לחיצה על OK בחלון הדו-שיח המציג את קוד R שבוצע. מוצגת כאן תמונה של תא מוכתם FM 4-64 המבטא חלבון צמחי, הקשור לקרום הפלזמה באמצעות N-myristoylation ואינטראקציה אלקטרוסטטית לפוספואינוזיטידים.אינטראקציות אלה הופרעו באופן ניסיוני על ידי וורטמנין. החשיבות של N-myristoylation נבדקה על ידי מוטציה בגליצין במיקום חומצת האמינו השנייה המשמשת כאתר N-myristoylation. ההשפעה של הסרת שתי יכולות הקישור של קרום הפלזמה נבדקה על ידי חיתוך של תחום ה-N-terminal של החלבון.תרשים הקופסה המתקבל מראה ירידה בזיקה של קרום הפלזמה לאחר מוטציה של אתר N-myristoylation ולאחר טיפול תרופתי. ההשפעה ההדדית שלהם דומה להשפעה של הסרת תחום ה-N-terminal. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע את השלבים העיקריים של הניתוח בסדר נכון וכיצד להגדיר את הפרמטרים שלהם.בעקבות ניתוח זה, ניתן לבצע שיטה סטטיסטית כמו ANOVA להערכה סטטיסטית של הנתונים שהושגו. למרות ששיטה זו פותחה עבור תאי תרחיף צמחים, ניתן ליישם אותה גם על תאים או רקמות אחרות עם ממברנות פלזמה חלקות וניתנות להבחנה ברורה.

determination-plasma-membrane-partitioning-for-peripherally

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנדוציטוזה מוסדרים מסדיר את שטח פני התא רמות הביטוי של רוב חלבונים בממברנה. כאן אנו מנצלים פריק, impermeant קרום biotinylation ריאגנטים למדוד את קצב endocytic של טרנספורטר דופאמין (DAT), חלבון הממברנה polytopic. השיטה מאפשרת גישה פשוטה למדידת קצב endocytic של רוב החלבונים פלזמה הממברנה.

מדידת חלבון ממברנה פלזמה חליפין Endocytic ידי Biotinylation הפיך

טכניקה לחקור את הרפסודה השומנים חלוקה של חלבונים ניאון על הממברנה של התאים החיים המתואר. הוא מנצל את הפער בזמנים דיפוזיה של חלבונים המצויים בתוך או מחוץ רפסודות שומנים בדם. הרכישה יכולה להתבצע באופן דינמי בתנאי בקרה, או אחרי כן התרופה.

קביעת רפסודה ליפידים חלוקת בדיקות fluorescently-מתוייגים בתאים חיים באמצעות מתאם ספקטרוסקופיה פלואורסצנטי (FCS)

כאן אנו מתארים שיטה חזקה לחלוקה של ממברנות פלזמה צמח לקרומים מסיסים עמידים וחומרי ניקוי חומרי ניקוי המבוססת על תערובת של ללא תווית וin vivo באופן מלא 15 N תרביות תאי thaliana ארבידופסיס שכותרתו. ההליך מיושם ללימודי proteomic השוואתיים להבין תהליכי איתות.

מטבולית תיוג וממברנה היפוך חלוקה לניתוח השוואתי של proteomic<em&gt; Thaliana ארבידופסיס</em&gt; תא תרבויות השעיה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לקביעת הכיוון והטופולוגיה של חלבוני ממברנה אינטגרליים בתאים חיים. פרוטוקול פשוט זה מסתמך על רגישות סלקטיבית לפרוטאז של כימרות בין החלבון המעניין ל-GFP.

קביעת טופולוגיה חלבון ממברנה באמצעות הקרינה הגנת פרוטאז (FPP)

חלבונים רבים מבצעים את תפקידם כאשר הם מחוברים למשטחי הממברנה. ניתן לדמות בעקיפין את הקישור של חלבונים חיצוניים על ממברנות ננו-דיסק על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים הולכה. אנו מראים כי הערימה האופיינית (רולו) של ננו-דיסקים הנגרמת על ידי הכתם השלילי נתרן פוספוטונגסטט נמנעת על ידי קשירה של חלבון חיצוני.

השיטה לחזות ולנתח חלבוני אינטראקצית ממברנה ידי הילוכים מיקרוסקופים אלקטרונים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול קרום המוח פרוקציה המייצג תהליך חסון לבודד חלבונים השייכים תאים סינפטית שונים.

קרום המוח Fractation: An<em&gt; אקס ויוו</em&gt; גישה כדי להעריך לוקליזציה חלבון subsynaptic

כאן אנו מציגים פרוטוקולים עבור ללא דטרגנט המגון בתרבית תאים בתרבית של מבוסס על חנקן קוויטציה עוקבות הפרדת חלבונים cytosolic ואת קרום מאוגד על-ידי ultracentrifugation. שיטה זו היא אידיאלית עבור ניטור חלוקה למחיצות של חלבוני ממברנה פריפריאלי בין מסיסים ושברים ממברנה.

קוויטציה חנקן, צנטריפוגה דיפרנציאלית מאפשר ניטור ההתפלגות של חלבוני ממברנה פריפריאלי בתאים בתרבית

מוצג כאן הוא פרוטוקול לקביעת המצב האוליגומרי של חלבוני קרום המשתמשת במערכת ננו חלקיקים קרום התא המקומי בשילוב עם מיקרוסקופ אלקטרונים.

מערכת חלקיקי קרום התא המקורי לניתוח אינטראקציה של חלבון-חלבון קרום

מאמר זה נועד להציג פרוטוקול כיצד לבנות מיקרוסקופ ספקטרוסקופיה של מתאם פלואורסצנטי (svFCS) של וריאציה נקודתית כדי למדוד דיפוזיה מולקולרית בקרום הפלזמה של תאים חיים.

ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטית של וריאציה נקודתית לניתוח דיפוזיה מולקולרית בקרום הפלזמה של תאים חיים

מאמר זה מציג פרוטוקול בידוד קרום פלזמה בקנה מידה קטן לאפיון קנדידה albicans ABC (קלטת מחייבת ATP) Cdr1, overexpressed ב Saccharomyces cerevisiae. תג כפול של מסוף C-מחשוף של פרוטאז עם מקשר של 16 שאריות בין Cdr1 לתג תוכנן כדי להקל על הטיהור והקרנת חומר הניקוי של Cdr1.

הכנת קרום פלזמה בקנה מידה קטן לניתוח קנדידה אלביקנס CDR1-mGFPHis

אנו מציגים שיטה חסכונית להערכת חדירות הממברנה הליפוזומלית עם רגישות ורזולוציה עדיפות על פני טכניקות קונבנציונליות. באמצעות תגובת החלפת ליגנד מכוסה חדשה, טכניקה זו מזהה שינויים המושרים על ידי פוספוליפאזA 2 בממברנות המודל. גישה נגישה זו, המשולבת בקלות עם ניתוחים סטנדרטיים, משפרת את הרזולוציה לחקר ביופיזיקה של ממברנות ואינטראקציות רעלים.

בדיקת חדירות קרום ליפוזום לחקירת ההשפעות של קבוצות פוספטידילינוזיטול פוספט על הפעולה הממברנוטרופית של ארס PLA2

חקור שיטה חישובית לניתוח חלוקת חלבונים בקרום התא באמצעות פלואורסצנציה ותוכנת Fiji ImageJ. השיטה מאפשרת תצפית בזמן אמת ללא צורך במיקרוסקופיה מתקדמת.

קביעת חלוקה למחיצות של קרום פלזמה חלבונים הקשורים באופן עקיף

גלה סרטונים נוספים