בחיי עיר ובחינת המתאם של צפיפות התאים ואת פליטת אור של חיידקים זוהרים

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביו-לומינסנציה. כגון, מציאת תנאי גידול אופטימליים לעוצמת אור מקסימלית של חיידקים ביולומינסנט וקביעת מנגנון הרגולציה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא ההתקנה הקלה, שניתן להשתמש בה עבור זנים ואורגניזמים שונים, כמו גם אפשרויות ההתאמה הפשוטות והמהירות.

ביצוע שיטה זו יכול לספק תובנה לגבי מאפייני אופרון לוקס. ניתן ליישם אותו גם על מערכות אחרות, כגון מערכות חיידקים, סביבתיים, דיווח או חיישנים. כדי להתחיל, הכינו תרבית לילה על ידי חיסון 100 מיליליטר של מדיום LB בקנמיצין, עם תאי E.coli BL21 שהפכו ממלאי גליצרול, או ישירות מצלחת טרנספורמציה.

דגרו על התרבית ב-37 מעלות צלזיוס, ו-120 סל"ד למשך הלילה. למחרת, יש לחסן 800 מיליליטר של מדיום קנמיצין LB עם 8 מיליליטר מתרבית הלילה. דגרו את התרבית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, ו -120 סל"ד בשייקר אינקובטור, עד שצפיפות התאים מגיעה ל- OD600 של 0.6 עד 0.8.

הפחיתו את טמפרטורת הדגירה ל-28 מעלות צלזיוס, וגרמו לביטוי חלבון על ידי הוספת IPTG של 0.1 מילי-מולרי. לאחר מכן התבונן בתאים עד שהם מתחילים לזרוח. לאחר הכנת המדיה על פי פרוטוקול הטקסט, פס את זני החיידקים הביו-לומינסצנטיים על לוחות אגר בינוניים של מי ים מלאכותיים, ודגרו אותם בטמפרטורה של 24 עד 30 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

הכינו תרבית לילה על ידי חיסון 100 מיליליטר של מדיום מי ים מלאכותיים עם מושבה אחת מהצלחת. לאחר מכן דגרו על התרבית בטמפרטורה של 24 עד 30 מעלות צלזיוס ו-120 סל"ד למשך הלילה. למחרת, חסנו 800 מיליליטר של מדיום מי ים מלאכותיים עם 8 מיליליטר של תרבית לילה.

דגרו על תאי החיידקים בטמפרטורה של 24 עד 30 מעלות צלזיוס, ו-120 סל"ד והתבוננו בתאים עד שהם מתחילים לזרוח. פס את זן החיידקים הביולוגי הרצוי, או זן E.coli מותאם על צלחת אגר, ודגירה על התרבית ב-28 מעלות צלזיוס למשך הלילה. יש לחסן 3 מיליליטר של מדיום עם מושבה אחת מצלחת הלילה, ולדגור על התאים בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס, ו-180 סל"ד למשך כשעה עד שעתיים.

מדוד את צפיפות התאים של דילול של אחד עד עשר של התרבית הנוזלית ב-650 ננומטר. לאחר מכן חשב את היחס והנפח עבור מיליליטר אחד של תרבית עם OD650 של 0.05. פיפטה את נפח התרבות המחושב והמדיום לצלחת 24 קירות שחורים עם תחתית זכוכית.

כדי להבטיח שווקטור ה-pET28a המכיל את כל אופרון הלוקס לא ילך לאיבוד, וזה מתבטא בזן ה-E.coli המותאם, הוסף מיקרוליטר אחד של קנמיצין ומיקרוליטר אחד של IPTG לדגימות. לאחר מכן הניחו מכסה על הצלחת, כדי למנוע אידוי במהלך המדידות. לבסוף, השתמש בקורא לוחות המוגדר ל-28 מעלות צלזיוס ובסקריפט שנמצא בפרוטוקול הטקסט, כדי לבצע מדידות ספיגה וביו-לומינסנציה כל 10 דקות, עם טלטול בין נקודות נתונים.

איור זה משווה מדידות OD650 של תאי E.coli BL21, תאי BL21 המכילים וקטור pET28a ריק, ותאי BL21 המכילים וקטור pET28a עם תוספת אופרון לוקס-ריב, אך ללא אינדוקציה. כל שלוש מדידות הייחוס לפליטת אור מראות עקומת צמיחה סיגמואידית עם שלבי צמיחה מעריכיים, אקספוננציאלים ונייחים, אך ללא פליטת אור, למעט הדגימה האחרונה, המציגה פליטת אור לאחר 300 דקות, עקב דליפה של מקדם T7. כאן, עקומות הצמיחה ועוצמות האור של אופרון הלוקס המתבטאות ב-E.coli, וזן החיידקים הביו-לומינסנצי, photobacterium mandapamensis 27561, הושוו ב-28 מעלות צלזיוס ב-LB, או מדיום מי ים מלאכותיים.

זן ה-E.coli המותאם ו-P.mandapamensis גדלים במדיום מי ים מלאכותיים, כמו גם במדיום LB, ושניהם מראים פליטת אור. אבל במדיום LB, P.Mandapamensis אינו פולט אור כלל. למרבה הפלא, זן ה-E.coli השונה מראה עוצמת אור מקסימלית גבוהה יותר מאשר החיידקים הביו-לומינסצנטיים.

בניסוי זה, ביטוי גנים של אופרון לוקס-ריב מבוסס E.coli נמדד במשך 24 שעות כדי לנתח את אורך חייו. פליטת האור נמשכה 19 וחצי שעות, הרבה יותר מזני החיידקים, שם נצפתה ירידה הדרגתית, וכתוצאה מכך פליטת אור נמוכה מאוד לאחר 10 שעות. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביו-לומינסנציה לחקור אופרון לוקס באורגניזמים מודלים, כגון E.Coli.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לעבוד עם חיידקים ביולומינסנטים.