ניתוח כמותי של שחבור חלופי Pre-mRNA בסעיפים מוח העכבר באמצעות ה-RNA בחיי עיר הכלאה Assay
August 26th, 2018
בחיי עיר הכלאה (איש) פרוטוקול המשתמשת oligonucleotides antisense קצר כדי לזהות דפוסים חלופיים pre-mRNA splicing בסעיפים מוח העכבר מתואר.
שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום שחבור קדם-mRNA חלופי. באופן ספציפי הוא מספק מערכת בדיקה חזקה ורגישה לבחינת דפוסי שחבור חלופיים באתרם בפרוסות רקמה. בשיטה זו ניתן לנתח שחבור חלופי בו זמנית בתת-סוגים רבים הכלולים במבנים ביולוגיים מורכבים כגון מוח עכבר.
היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא משתמשת בבדיקות צומת אקסון אנטי-סטטיות בהלם mRNA בהכלאה באתרה כדי לייצר אותות הכלאה ספציפיים לאיזופורמים. טכנולוגיית הגברת אותות בניין מגבירה את רגישות הזיהוי כדי לספק אותות היברידיזציה חזקים. האותות שזוהו היו הכללת אקסונים שנמלטו מבדיקות ספציפיות המשמשות לחישוב אחוז החיבור במדדים חיוניים באזורים אנטומיים שונים במוח העכבר.
במחקר זה NF1 exon 23a משמש כדוגמה להמחשת השימוש במערכת הבדיקה. עם זאת, ניתן להתאים את המערכת לניתוח דפוסי ביטוי של אקסונים חלופיים רבים. כדי להתחיל פרפיניזציה של מוח העכבר קטע D, מלאו שני כלי כביסה ב-250 מיליליטר קסילן.
ועוד שניים עם 250 מיליליטר של 100% אתנול בתוך מכסה אדים. הכנס את מגלשות הטישו למתלה כביסה. לאחר מכן, הניחו את מתלה הכביסה בכלי המכיל קסילן ודגרו למשך חמש דקות תוך הזזת המתלה למעלה ולמטה לפחות שלוש פעמים וחזרו על הפעולה עם צלחת הקסילן השנייה.
לאחר מכן מניחים את המדף בכלי המכיל אתנול ודוגרים במשך שתי דקות באותן תנועות למעלה ולמטה ואז חוזרים על הפעולה עם צלחת האתנול השנייה. לייבוש המגלשות, הזיזו את המתלה מצלחת האתנול השנייה והניחו אותו בתוך אינקובטור בחום של 60 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. השתמש בעט מחסום הידרופובי כדי לצייר מחסום של 0.75 אינץ' על 0.75 אינץ' סביב קטע הרקמה ולייבש באוויר במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר.
הפעל את תנור ההכלאה והגדר את הטמפרטורה על 40 מעלות צלזיוס. לאחר הרטבה מוחלטת של נייר לחות במים מזוקקים, הנח אותו במגש בקרת לחות. לאחר מכן הכנס את מגש בקרת הלחות לתנור ההכלאה.
לאחר הנחת השקופיות המיובשות על ספסל, יש לכסות לחלוטין את חלקי הרקמה בכל שקופית בחמש עד שמונה טיפות של תמיסת מי חמצן. דגירה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. הקש על השקופיות על נייר סופג, אחת בכל פעם כדי להסיר את תמיסת מי החמצן ולהכניס את השקופיות למתלה כביסה.
טבלו את המתלה בכלי כביסה המכיל מים תוך כדי הזזתו למעלה ולמטה שלוש עד חמש פעמים כדי לשטוף את המגלשות. מלאו זכוכית של ליטר אחד המונחת על פלטה חמה ב-700 מיליליטר של טיפול להסרת מטרה פי 1 וכסו אותה בנייר כסף. הכנס מדחום דרך מכסה נייר הכסף והפעל את הפלטה החמה, הגדר על טמפרטורה גבוהה למשך 10 עד 15 דקות.
לאחר שטמפרטורת מגיב האחזור מגיעה ל-98 מעלות צלזיוס, הגדר את הפלטה החמה לטמפרטורה נמוכה כדי לשמור על מצב רתיחה קל. לאחר מכן, הסר בזהירות את נייר הכסף והניח את המתלה בתוך הכוס. מכסים את הכוס בנייר כסף ודוגרים למשך 15 דקות.
השתמש במלקחיים כדי להעביר את המתלה מהכוס לכלי כביסה המכיל 200 מיליליטר מים מזוקקים ולדגור למשך 15 שניות. לאחר 15 שניות מניחים את המדף בכלי כביסה המכיל 100% אתנול ודוגרים למשך שלוש דקות. מוציאים את המדף מהכלי ומייבשים בחום של 60 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
לאחר הנחת השקופיות על מתלה כתמים, כסו את חלקי הרקמה בחמש טיפות פרוטאז 3 לכל שקופית. מניחים בזהירות את המתלה במגש בקרת הלחות ומכניסים את המגש לתנור ההכלאה ודוגרים בחום של 40 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר הוצאת המתלה מהמגש, הקש על השקופיות כדי להסיר עודפי נוזלים והכנס אותן למתלה כביסה.
הנח את המתלה בכלי כביסה המכיל מים מזוקקים והזיז את המתלה למעלה ולמטה שלוש עד חמש פעמים כדי לשטוף את המגלשות. כדי להתכונן להכלאה באתר, דגרו את הבדיקות והריאגנטים של AMP בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. הכנס את מגש בקרת הלחות לתנור ההכלאה והגדר על 40 מעלות צלזיוס.
לצורך הכלאת בדיקה, הסר את השקופיות ממתלה הכביסה והקש עליהן כדי להסיר עודפי נוזלים. הנח את השקופיות על מתלה כתמים. השתמש בעיפרון כדי לתייג את השקופיות עם שם הבדיקה.
הנח שלוש שקופיות רקמת מוח חתוכות סמוכות להכלאה עם שלוש בדיקות שונות של מיטוזה של סיבים עצביים מסוג 1 יחד. מכיוון שיש בדיקות ספציפיות לאיזופורמים שונים מאוד, אני משתמש בקטעי רקמה חתוכים סמוכים. זה קריטי שקטעים אלה יטופלו בדיוק אותו הדבר בשלבי הכלאה, הגברה וזיהוי אותות כדי להבטיח את הדיוק של אחוז החיבור בחישוב.
כסו את חלקי הרקמה בארבע טיפות בדיקה לכל קטע, שקופית אחת בכל פעם כדי למנוע התייבשות של החלקים. לאחר מכן הנח את מתלה הכתמים במגש בקרת הלחות והכנס אותו לתנור 40 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. לאחר מכן, הניחו מתלה כביסה בכלי כביסה מלא ב -200 מיליליטר של מאגר כביסה 1X.
לאחר מכן הקש על כל שקופית, אחת בכל פעם על מגבת נייר כדי להסיר עודפי נוזלים. והכנס מיד כל שקופית למתלה הכביסה. דגרו בטמפרטורת החדר למשך שתי דקות בכלי מלא במאגר כביסה טרי תוך הזזת המתלה למעלה ולמטה שלוש עד חמש פעמים ולאחר מכן חזרו על השטיפה בכלי חדש.
לאות ampלהגבר, הקש על כל שקופית כדי להסיר עודפי מאגר כביסה והנח אותם על מתלה כתמים. כסו את חלק הרקמה בכל שקופית בארבע טיפות של AMP אפס ריאגנט. לאחר מכן, הניחו את המתלה במגש בקרת הלחות, הכניסו את המגש לתנור ודגרו בחום של 40 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
שטפו את השקופית פעמיים עם מאגר כביסה כפי שנעשה בעבר בניסוי זה. חזור על שלב הגברת האות עם ריאגנטים של AMP אחד עד שש כמתואר בפרוטוקול הטקסט ושטוף את השקופיות לאחר כל שלב. לזיהוי אותות, הסר את מאגר הכביסה העודף מהשקופיות על ידי הקשה והנח אותם על מתלה כתמים.
לאחר מכן, ערבבו שני מיקרוליטרים של B אדום מהיר עם 120 מיקרוליטר של A אדום מהיר בצינור מיקרו צנטריפוגה. הוסף את התמיסה לחלקי הרקמה בכל שקופית כדי לכסות אותם במלואם. הנח את מתלה הכתמים במגש בקרת הלחות, כסה את המגש ודגר במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן הסר את התמיסה והכנס את השקופיות למתלה כביסה. הנח את המתלה בכלי כביסה המכיל מי ברז כדי לשטוף את המגלשות וחזור על הכביסה. לאחר הכביסה השנייה, הקש על נייר סופג כדי להסיר עודפי מים.
לאחר מכן, הניחו את המדף בכלי המכיל תמיסת צביעה של 50% המטוקסילין. הזז את המתלה למעלה ולמטה מספר פעמים. ודוגרים שתי דקות בטמפרטורת החדר.
מעבירים את המתלה לכלי כביסה המכיל מי ברז. הזיזו את המתלה למעלה ולמטה חמש פעמים וחזרו על הכביסה עד שהשקופיות יתבהרו, בעוד קטעי הרקמה נשארים סגולים. לאחר מכן העבירו את המדף לכלי המכיל 0.02% מי אמוניה.
הזז את המתלה למעלה ולמטה פעמיים עד ארבע פעמים עד שהחלקים הופכים לכחולים. שוטפים את השקופיות במי ברז שלוש עד חמש פעמים בכלי המכתים. לאחר מכן, הניחו את המתלה בתוך חממה ודגרו למשך 15 דקות בחום של 60 מעלות צלזיוס לייבוש השקופיות.
כשהוא יבש לחלוטין, הוסף טיפה אחת של אמצעי הרכבה על כל שקופית כדי לכסות את הפרוסה. לאחר מכן, הנח בזהירות כיסוי בגודל 24 על 50 מילימטר מעל חלקי הרקמה בכל שקופית. לאחר ייבוש השקופיות באוויר למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, המשך באיסוף הנתונים.
כדי לחשב את האחוז המחובר, או ערך ה-PSI עבור אקסון 23a, נספרים מספר התאים והנקודות בשלושה תת-אזורים של קליפת המוח, וההיפוקמפוס CA3. בדיקת הכלאה של RNA באתרה מבוצעת בחלקי מוח של עכברים מסוג CD1 באמצעות שלוש בדיקות ספציפיות שונות ל-NF1. נקודות מנוקבות אדומות שנצפו בקטעי קליפת המוח וההיפוקמפוס, מצביעות על אותות חיוביים על ידי NF1 כולל, ספציפי להכללה ודילוג על בדיקות ספציפיות.
לאחר מכן נספרים אותות ה-ISH משלושת הבדיקות ומשמשים לחישוב PSI. בדיקת הכלאת RNA באתרה מבוצעת בקליפת המוח של עכברים שחורים מסוג 6J ועכברים מוטנטיים שחורים C57 6J שבהם אקסון 23a כלול בכל סוגי התאים. נקודות מנוקבות אדומות שנצפו בקליפת המוח של עכברים שחורים מסוג 6J שחורים, מצביעות על אותות חיוביים על ידי NF1 כולל, הכללה ספציפית ודילוג על בדיקות ספציפיות.
בעכברים מוטנטיים שחורים C57 6J, אותות דומים מתקבלים על ידי בדיקות ספציפיות להכללה והכללה של NF1. עם זאת, לא מזוהה אות בעת שימוש בדילוג על בדיקה ספציפית, מה שמצביע על כך ששתי בדיקות המכוונות להכללה או דילוג של אקסונים הן ספציפיות ביותר. מכיוון שתיוג רב צבעוני על אותן שקופיות רקמה עדיין אינו זמין להליך זה, נעשה שימוש בבדיקות שונות בשקופיות הרקמה השונות.
כדי להשיג את ערכי השחבור המדויקים באחוזים, חשוב להשתמש בשקופיות חתוכות סמוכות ולטפל בשקופיות בדיוק באותו אופן לאורך הליך זה. משלימים הליך זה הם אמצעים כמו אימונוהיסטוכימיה, שניתן לבצע כדי לענות על שאלות נוספות הנוגעות ללוקליזציה ותפקוד של איזופורמים שחבור המתבטאים באופן דיפרנציאלי.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
מאמר זה מתאר פרוטוקול של הכלאה in situ (ISH) המשתמש באוליגונוקלאוטידים קצרים אנטי-סנס לזיהוי דפוסי חיבור אלטרנטיבי של pre-mRNA בחלקי מוח עכבר. שיטה זו מאפשרת ניתוח בו זמני של דפוסי חיבור בתת-סוגים שונים בתוך מבנים ביולוגיים מורכבים.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- נוירומדע
- גנטיקה
- ביולוגיה מולקולרית
רקע
- חיבור אלטרנטיבי של pre-mRNA הוא קריטי ליצירת מגוון חלבונים.
- הבנת דפוסי החיבור יכולה לספק תובנות לגבי תפקוד המוח והפרעותיו.
- טכניקות הכלאה in situ חיוניות לחקר החיבור בהקשרים רקמות.
- מחקר זה מתמקד בחלקי מוח עכבר כדי לחקור וריאציות בחיבור.
מטרת המחקר
- לפתח מבחן רגיש לזיהוי חיבור אלטרנטיבי in situ.
- לנתח דפוסי חיבור באזורי מוח שונים.
- לשפר את ההבנה של מנגנוני החיבור במוח.
שיטות ששימשו
- הכלאה in situ באמצעות אוליגונוקלאוטידים קצרים אנטי-סנס.
- חקירות אקסון נגד סטטיות לסימנים ספציפיים לאיזופורם.
- טכנולוגיית הגברת אותות להגברת רגישות הזיהוי.
- ניתוח של אחוזי הכללה והחיבור של האקסונים באזורים אנטומיים שונים.
תוצאות עיקריות
- אותות הכלאה חזקים הושגו באמצעות השיטה שפותחה.
- דפוסי חיבור אלטרנטיביים זוהו בהצלחה בחלקי מוח עכבר.
- הטכניקה מאפשרת ניתוח בו זמני של אירועי חיבור מרובים.
- התוצאות תורמות להבנת המורכבות של החיבור ברקמות עצביות.
מסקנות
- פרוטוקול ה-ISH מספק כלי חשוב לחקר חיבור אלטרנטיבי.
- הממצאים משפרים את הידע על מנגנוני החיבור במוח.
- שיטה זו יכולה לסייע במחקר נוסף בתנאים נוירולוגיים הקשורים לחיבור.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This method enables spatially resolved quantification of alternative splicing events in complex tissues, addressing a critical gap in target validation where bulk RNA approaches mask cellular heterogeneity. By providing isoform-specific signals at single-cell resolution in anatomically defined brain regions, it supports mechanistic de-risking of splicing-dependent targets in neuroscience drug discovery. The ability to calculate percent spliced in (PSI) values from exon inclusion and skipping signals offers a quantitative, reproducible metric for assessing target engagement and pathway modulation in preclinical models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking specific splice isoforms to cell-type-specific expression patterns in disease-relevant brain regions.
- Operational Value: Provides a robust, sensitive assay system for examining alternative splicing patterns in situ within tissue slices, reducing reliance on dissociated cell models that lose spatial context.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Uses shock anti-static exon junction probes to generate isoform-specific hybridization signals, enabling simultaneous analysis of multiple subtypes within complex biological structures.
- Operational Value: Signal amplification technology increases detection sensitivity, producing robust signals suitable for quantitative imaging and automated analysis workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates disease-relevant system analysis by mapping splicing patterns across anatomical areas such as cortex and hippocampus, supporting biomarker discovery for neuropsychiatric indications.
- Operational Value: Enables parallel processing of adjacently cut tissue sections under identical conditions, ensuring data accuracy for cross-sectional comparisons in preclinical studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery biology phase, where spatially resolved splicing data informs target selection and mechanistic understanding before assay development for high-throughput screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing cell-type-specific alternative splicing patterns that may be obscured in bulk tissue analyses.
- Screening: Generates quantitative, spatially resolved readouts (e.g., PSI values) that can inform assay design for splicing-modulating compounds.
- Analytics: Enables calculation of percent spliced in from exon inclusion and skipping signal counts, providing a normalized metric for comparing conditions across brain regions.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity by validating splicing changes in anatomically defined regions relevant to disease models.
- Enterprise Reuse: The probe-based approach is adaptable to multiple alternative exons, positioning it as a reusable platform for splicing analysis across diverse targets and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking specific splice isoforms to defined anatomical locations, increasing confidence in target-disease relationships.
- Operational Value: Standardized protocol with built-in controls (e.g., adjacently cut slides, identical processing) enhances reproducibility across sites and users.
- Strategic Value: Supports better go/no-go decisions by providing spatially resolved efficacy and mechanism data early in the discovery pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated splicing expression in disease-relevant neural circuits.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA in situ hybridization, tissue sectioning, and quantitative image analysis for punctate dot counting.
- Dependent on hybridization ovens, humidity control trays, and reagent systems for probe hybridization, signal amplification, and detection (e.g., Fast Red).
- Necessitates standardization across teams for slide preparation, probe incubation, and washing steps to ensure comparability of PSI calculations.
- Adaptation to new exons requires design and validation of exon junction-specific probes, with sensitivity to target sequence accessibility.
- Practical limitation: Multi-color labeling is not currently available, requiring sequential analysis on separate slides, which increases tissue sectioning and processing demands.
