Name: ניתוח כמותי של שחבור חלופי Pre-mRNA בסעיפים מוח העכבר באמצעות ה-RNA בחיי עיר הכלאה Assay (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: למדו לזהות שחבור חלופי של pre-mRNA במוח העכבר באמצעות היברידיזציה in situ עם בדיקות exon junction ספציפיות לאיזופורם. שיטה זו מאפשרת ניתוח רגיש של תבניות שחבור במבנים עצביים מורכבים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי איגוד הלב האמריקני [מענק הסיוע 0365274B כדי מרגשת], מכון הסרטן הלאומי [GI נבג P50CA150964 ל ז. ו.], מכוני הבריאות הלאומיים [Office של מחקר תשתית משותפת מכשור גרנט S10RR031845 כדי מיקרוסקופ אור הדמיה המתקן ב אוניברסיטת קייס ווסטרן ריזרב], סין מלגת המועצה [עד X.G.]. המחברים תודה ריצ'רד לי אור מיקרוסקופ הדמיה הליבה על עזרתו עם מגלשה סריקה.

כל הניסויים המתוארים כאן המערבות עכברים אושרו על ידי התיק Western Reserve אוניברסיטת מוסדיים חיה על עצמך ועל שימוש הוועדה. הכותרת של פרוטוקול 2016-0068 (PI: הואה לו) הוא תפקיד של שחבור חלופי pre-mRNA בפיתוח חוליות".
הערה: המידע של כל ציוד, ריאגנטים, אספקה בשימוש פרוטוקול זה נכללת טבלה של חומרים.
1. מכינים פורמלין פרפין קבוע משובצים קטעים (FFPE)
<ol><li>
המתת חסד 1 CD1 עכבר ועכבר C57BL/6J 1 מאת נקע בצוואר הרחם. בזהירות לחתוך את הגולגולת עם מספריים כירורגיים וחדים. מסירים את המוח עם סקופ. הערה: עכברים זכר בן 5 חודשים CD1 ועכברים בת 3 חודשים C57BL/6J זכר היו בשימוש, הראה תוצאות דומות.<ol>
<li>לשטוף את המוח עם PBS. לתקן את זה. עם פתרון המכיל 10% פורמלין בטמפרטורת החדר (RT) אחר 30 אבני על ידי לשים את כל המוח ב- 50 מ של הפתרון פורמלין.</li>
		<li>שנה הפתרון תיקון ל- PBS, דגירה המוח ב- PBS בן לילה ב 4 º C. מייבשים, להטביע את המוח עם קסילן, פרפין באמצעות הליכים סטנדרטיים18.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
השימוש של מיקרוטום לחתוך רקמות מוטבע למקטעים 5 מיקרומטר. לשים רצועת פראפין באמבט מים RT הראשון, ולאחר מכן באמבט מים 45 ° C כדי להפיץ את הסרט.
	<ol>
<li>כאשר קמטים, קפלי ברצועת הכלים נעלמים, מיד הר מקטעים בשקופיות זכוכית. האוויר יבש השקופיות בן לילה RT. אופים שקופיות עבור h 1 ב 60 מעלות צלזיוס לפני השימוש.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. דגימה רעלני
<ol><li>
Deparaffinize רקמה מקטעים. לבצע את הפעולות הבאות בברדס fume.
	<ol>
<li>למלא כביסה שתי מנות (איור 1 א') 250 מ של קסילן טריים ושתיים עם 250 מ של 100% אתנול. להוסיף שקופיות רקמה לתוך מתלה כביסה (איור 1 א') מקום השטיפה לארון תקשורת במנות כביסה בעקבות הסדר וזמן הדגירה המצוין בטבלה 1.</li>
		<li>במהלך כל הדגירה, להרים את מתלה הכביסה למעלה ולמטה יותר מ 3 פעמים בצלחת כביסה. לאחר כל דגירה, להעביר במהירות את מתלה הכביסה לתוך המנה הכביסה הבא כדי למנוע את קטעי רקמה מתייבשת.</li>
		<li>לאחר השלמת השלבים דגירה, הסר את מתלה הכביסה עם מגלשות המנה כביסה. מקום ארון התקשורת חממה 60 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות או עד השקופיות יבשים לחלוטין.</li>
	</ol>
</li>
	<li>צייר מחסום 0.75'' x 0.75'' סביב סעיף הרקמה עם עט הידרופובי המכשול. האוויר יבש המכשול למשך 3 דקות ב- RT.</li>
	<li>
Pretreat פרוסות
	<ol>
<li>להכין ראגנטים וציוד<ol>
<li>להדליק את התנור הכלאה (איור 1B) ולהגדיר את הטמפרטורה עד 40 ° צלזיוס 30 דקות לפני השימוש.</li>
			<li>הרטיבו את הנייר humidifying (איור 1E) עם מים מזוקקים לחלוטין והניחו אותה במגש בקרת לחות (איור 1D, משמאל). השאר את המגש בקרת לחות בתנור הכלאה.</li>
			<li>הכינו 700 מ"ל של ריאגנטים אחזור יעד טרי 1 x על-ידי הוספת 630 מ ל dH2O 70 מ של 10 x יעד אחזור ריאגנטים.</li>
		</ol>
</li>
		<li>החל מימן על-חמצני.<ol>
<li>לשים את השקופיות deparaffinized על הספסל. להוסיף 5-8 טיפות מי חמצן מקטע לכסות לגמרי את הרקמה. תקופת דגירה של 10 דקות ב- RT.</li>
			<li>הקש על השקופיות על פיסת נייר סופג כדי להסיר הפתרון מימן על-חמצני, שקופית אחת בכל פעם. מיד להוסיף את השקופית לתוך מתלה כביסה ולהעביר את המדף אל צלחת כביסה מלאים dH2O.</li>
			<li>לשטוף את השקופיות על-ידי העברת ארון התקשורת למעלה ולמטה במים מזוקקים למשך שלוש עד חמש פעמים. להעביר את מתלה הכביסה צלחת כביסה מלאים מים מזוקקים ושקופיות לשטוף עוד פעם אחת.</li>
		</ol>
</li>
		<li>לבצע אחזור היעד<ol>
<li>במקום גביע זכוכית 1000 מ על פלטה חמה. להוסיף 700 מ"ל של טרי 1 x יעד אחזור ריאגנטים כשהספל ומכסים אותו עם נייר כסף. הכנס מדחום כשהספל לכיסוי רדיד (איור 1C). להדליק את הכיריים ולהגדיר גבוה למשך 10-15 דקות.</li>
			<li>כאשר הטמפרטורה של ריאגנטים אחזור מגיע 98 ° C, מעבר לשליטת טמפרטורה הכיריים בגובה נמוך כדי לשמור על החום הגדול מתון. לא להרתיח יותר מ 15 דקות.</li>
			<li>בינתיים, בזהירות פתח את רדיד האלומיניום, לשים את מתלה הכביסה עם פרוסות בתוך ההנהלה לאחזור. מכסה את הספל שוב, תקופת דגירה של 15 דקות.</li>
			<li>שימוש מלקחיים להסיר את המתלה הספל על צלחת כביסה מלאים 200 מ של dH2O ולשטוף 15 s.</li>
			<li>. לא ידענו על צלחת כביסה המכיל 100% אתנול טריים ותנו לשבת 3 מינימלית להסיר את השקופיות, נייבש אותם חממה 60 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.</li>
		</ol>
</li>
		<li>החלת פרוטאז השלישי<ol>
<li>מקם את השקופיות על המדף הכתם (איור 1D, נכון). להוסיף 5 טיפות פרוטאז השלישי כדי לכסות את הרקמה. בזהירות לשים ארון התקשורת במגש בקרת לחות (איור 1D, שמאלה), הכנס את המגש לתנור הכלאה 40 ° C. תקופת דגירה של 30 דקות.</li>
			<li>להסיר את המדף שקופיות, להחזיר את המגש לתנור. הקש על השקופיות כדי להסיר את עודפי הנוזל, שקופית אחת בכל פעם. להוסיף את השקופית מתלה כביסה ואת המקום המדף בקערה כביסה מלא dH2O. מהלך המתלה למעלה ולמטה כדי לשטוף את השקופיות עבור 3 - 5 פעמים.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. איש Assay
<ol><li>
להכין חומרים
	<ol>
<li>לחמם 50 x שטיפת מאגר חממה 40 ° C עבור מינימלית 20 מיקס 2.94 L של dH2O ו- 60 מ של 50 x שטיפת מאגר לעשות 1 x מאגר לשטוף.</li>
		<li>להכין 50% Hematoxylin מכתימים פתרון על-ידי הוספת 100 מ של hematoxylin של גיל אני 100 מ של dH2O. הכן 0.02% (w/v) אמוניה מים על-ידי הוספת מ 1.43 ל 1 N אמוניה מימית 250 מ של dH2O. לערבב טוב במיכל.</li>
		<li>לשים את הגששים ואת המגבר 0-6 ריאגנטים ב RT 30 דקות לפני השימוש. השאר את המגש בקרת לחות בתנור הכלאה 40 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הליך איש הערה: כדי לבדוק הביטוי של Nf1 שחבור איזופורמים ולחשב את אחוז משולבים (PSI) ערך עבור אקסון 23a, שלושה רגשים איש שונים המכוונות אקסון isoform כלול 23a, אקסון לא נכלל 23a isoform או שניהם איזופורמים הם משומשים (איור 2 ). הגששים משמשים על מקטעי רקמת adjacently לחתוך. כדי להבטיח את הדיוק של החישוב, זה קריטי כי הסעיפים רקמות שלושה מטופלים בדיוק בשלבי גילוי הכלאה, הגברה ושידור.<ol>
<li>בדיקה הכלאה.<ol>
<li>הסר את השקופיות מתלה הכביסה והקש על הנוזל העודף מהשקופיות. מקם את השקופיות בארון הכתם.</li>
			<li>השתמשי בעיפרון לתייג את השקופיות עם שם בדיקה. לשים את השקופיות רקמת המוח adjacently לחתוך שלושה שהוכלא יחד עם שלושה רגשים Nf1 שונים (איור 2). לבצע את השלבים הבאים באותו סדר של שקופיות.</li>
			<li>להוסיף 4 טיפות בדיקה כדי לכסות את הרקמה. אישור בכל פעם כדי למנוע את הסעיפים מתייבשת. מקום המדף הכתם במגש בקרת לחות והוספתו לתוך התנור 40 מעלות צלזיוס במשך שעתיים.</li>
			<li>לשטוף את השקופיות פעמיים עם שטיפה מאגר. עבור כל כביסה, למלא את הצלחת מכתימים 200 מ ל 1 x שטיפת מאגר ולמקם מתלה כביסה בתוכו. הקש על עודף נוזל על מגבת נייר שקופית אחת בכל פעם והוספתו במהירות לתוך המדף כביסה. . לא ידענו שקופית למעלה ולמטה לתוך המנה עבור 3 – 5 פעמים למשך 2 דקות ב- RT.</li>
			<li>לשימוש לשטוף את השני, מאגר שטיפת טריים.</li>
		</ol>
</li>
		<li>הגברה של האות.<ol>
<li>הקש על המאגר שטיפת עודפי מהשקופיות ומניחים בארון הכתם. להוסיף 4 טיפות של המגבר 0 כדי לכסות את הרקמה. למקם ארון התקשורת הכתם במגש בקרת לחות, להכניס אותו לתנור למשך 30 דקות ב- 40 מעלות צלזיוס.</li>
			<li>לשטוף את השקופיות פעמיים עם שטיפה מאגר כמתואר לעיל.</li>
			<li>חזור על שלב זה עם המגבר 1 – 6 בעקבות את ההזמנה ואת תנאי בטבלה 2. לשטוף את השקופיות פעמיים אחרי כל שלב הכלאה.</li>
		</ol>
</li>
		<li>אות זיהוי<ol>
<li>הקש על המאגר שטיפת עודפי מהשקופיות ומניחים בארון תקשורת הכתם. להוסיף 2 µL של מהר אדום B µL 120 מהר אדום (יחס יצירת) צינור microcentrifuge. לערבב היטב ולהוסיף כדי כיסוי מלא סעיף הרקמה. הערה: הנפח הכולל של אדומה / מיקס B מבוססת על המספר והגודל של רקמות מקטעים. עבור אזור 0.75'' x 0.75'', 120 µL הוא מספיק עבור מקטע אחד. לערבב בתוך 5 דקות והימנע חשיפה של המיקס לקרני השמש או אור UV.</li>
			<li>לסגור את המגש, תקופת דגירה של 10 דקות-RT. להסיר את הפתרון פח אשפה מיד להכניס את השקופיות מתלה כביסה ו למקם ארון התקשורת צלחת כביסה מלאים במי ברז. לשטוף שוב עם מים מהברז.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Counterstaining של השקופיות
	<ol>
<li>הסר את מתלה הכביסה של מי ברז, הקש במהירות על נייר סופג כדי להסיר את עודף מים. להכניס ארון התקשורת hematoxylin 50% מכתים פתרון ולהעביר מיד את המדף לאורך מספר פעמים. תקופת דגירה של 2 דקות ב- RT.</li>
		<li>העברת המדף שקופית בחזרה לתוך המנה מי ברז. רחץ 3 – 5 פעמים על-ידי נע מעלה ומטה ארון התקשורת ושינוי טריים מי ברז עד השקופיות הופכים ברורים, בעוד ברקמות המוח להישאר סגול.</li>
		<li>. לא ידענו על תבשיל המכיל מים אמוניה 0.02% . לא ידענו למעלה ולמטה 2 – 3 פעמים עד הרקמות כחולות לשטוף את השקופיות 3 – 5 פעמים עם מים מהברז טריים בקערה מוכתמים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הרכבה של הדגימות
	<ol>
<li>להעביר המדף שקופיות מתוך קערה מכתימים חממה 60 מעלות צלזיוס, תקופת דגירה של פחות 15 דקות עד השקופיות יבשים לחלוטין.</li>
		<li>מקום 40 µL של הרכבה בינונית בשקופית ובזהירות הצב coverslip 24 מ"מ x 50 מ"מ על סעיף הרקמה. שקופיות אוויר יבש למשך 30 דקות ב- RT.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. איסוף נתונים וניתוח
הערה: השתמש סורק שקופיות כדי לסרוק את התמונות בהגדלה X 40.
<ol><li>
פקדים חיוביים ושליליים
	<ol>
<li>עבור ניסוי, כוללים פקדים חיוביים ושליליים (איור 3). כפקד חיובי טוב, אות צריך להיות גלוי כנקודות punctate ב- 20-40 X הגדלה.</li>
		<li>השתמש עכבר (Mm) 1ZZ - PPIB - כפקד חיובי. המכשיר הזה מטרות הגן משק בית משותף PPIB. . באמת, נקודה אחת על כל התאים 20 הצגת הרקע מכתים לכל 20 X מיקרוסקופ שדה מקובל.</li>
		<li>השתמש החללית DapB-1ZZ כפקד שלילי. המכשיר הזה מטרות dapB של גנים חיידקיים. הגששים שליטה אלה שימשו איש רבים מבחני19.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
אות זיהוי וניתוח של כמו דפוסי ביטוי של אקסון Nf1 23a
	<ol>
<li>כמו האותות הכלאה מסומנות נקודות punctate, ספרו את הנקודות באופן ידני. מספר הנקודות הוא מתואם עם הרמה של התרשימים שמזוהה על-ידי בדיקה ספציפית. שימו לב כי מספר הנקודות יכול גם להיות מנותח על ידי תוכנות ImageJ או SpotStudio.</li>
		<li>להשתמש שלושה רגשים hybridize המכילים אקסון 23a, אקסון שחסרים 23a איזופורמים או Nf1 הכולל תעתיקים (איור 2). הגששים 3 אין אפשרות להשתמש בו זמנית, להשתמש בשלושת המקטעים של רקמת המוח סמוכים כדי hybridize על כל בדיקה.<ol>
<li>כדי לחשב אחוזים או, אבל בארט (PSI) עבור אקסון 23a, לספור את מספר תאים ונקודות באזורי מוח שונים. עבור כל אזור בעל עניין, לספור תאים יותר מ-400 מכמה תתי אזורים כמצוין באיור4.</li>
			<li>איסוף הנתונים מאזורים המשנה זהה עבור כל אחד משלושת רגשים. לחשב PSI במספר הנקודות בכל תא עם החללית הכללה אקסון 23a / (מספר של נקודות בכל תא עם אקסון 23a הכללה בדיקה + מספר נקודה לכל תא עם exon23a דילוג על בדיקה) x 100%.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Wang, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+isoform+regulation+in+human+tissue+transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes.</a> Nature. 456, 470-476 (2008).</li>
<li>Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+surveying+of+alternative+splicing+complexity+in+the+human+transcriptome+by+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing.</a> Nature Genetics. 40, 1413-1415 (2008).</li>
<li>Cieply, B., Carstens, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+roles+of+alternative+splicing+factors+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+RNA%22%5BJournal%5D)">Functional roles of alternative splicing factors in human disease.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 6, 311-326 (2015).</li>
<li>Xiong, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+splicing.+The+human+splicing+code+reveals+new+insights+into+the+genetic+determinants+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA splicing. The human splicing code reveals new insights into the genetic determinants of disease.</a> Science. 347, 1254806(2015).</li>
<li>Shirai, Y., Watanabe, M., Sakagami, H., Suzuki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+splice+variants+in+the+5%27UTR+of+Gtf2i+expressed+in+the+rat+brain%3A+alternative+5%27UTRs+and+differential+expression+in+the+neuronal+dendrites%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Novel splice variants in the 5'UTR of Gtf2i expressed in the rat brain: alternative 5'UTRs and differential expression in the neuronal dendrites.</a> Journal of Neurochemistry. 134, 578-589 (2015).</li>
<li>Cui, Y., Liu, J., Irudayaraj, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+quantification%3A+in+situ+analysis+of+transcriptome+and+pre-mRNA+alternative+splicing+at+the+nanoscale%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+Nanomedicine+and+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Beyond quantification: in situ analysis of transcriptome and pre-mRNA alternative splicing at the nanoscale.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9, (2017).</li>
<li>Trifonov, S., Yamashita, Y., Kase, M., Maruyama, M., Sugimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamic+acid+decarboxylase+1+alternative+splicing+isoforms%3A+characterization%2C+expression+and+quantification+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glutamic acid decarboxylase 1 alternative splicing isoforms: characterization, expression and quantification in the mouse brain.</a> BMC Neuroscience. 15, 114(2014).</li>
<li>Hollander, D., Naftelberg, S., Lev-Maor, G., Kornblihtt, A. R., Ast, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+Are+Short+Exons+Flanked+by+Long+Introns+Defined+and+Committed+to+Splicing%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">How Are Short Exons Flanked by Long Introns Defined and Committed to Splicing?</a> Trends in Genetics. 32, 596-606 (2016).</li>
<li>Cassidy, A., Jones, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developments+in+in+situ+hybridisation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Developments in in situ hybridisation.</a> Methods. 70, 39-45 (2014).</li>
<li>Meshorer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+and+neuritic+mRNA+translocation+under+long-term+neuronal+hypersensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing and neuritic mRNA translocation under long-term neuronal hypersensitivity.</a> Science. 295, 508-512 (2002).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope%3A+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope+for+in+situ+detection+of+transcriptionally+active+human+papillomavirus+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">RNAscope for in situ detection of transcriptionally active human papillomavirus in head and neck squamous cell carcinoma.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2014).</li>
<li>Zhu, H., Hinman, M. N., Hasman, R. A., Mehta, P., Lou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+neuron-specific+alternative+splicing+of+neurofibromatosis+type+1+pre-mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of neuron-specific alternative splicing of neurofibromatosis type 1 pre-mRNA.</a> Molecular and Cellular Biology. 28, 1240-1251 (2008).</li>
<li>Hinman, M. N., Sharma, A., Luo, G., Lou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurofibromatosis+type+1+alternative+splicing+is+a+key+regulator+of+Ras+signaling+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Neurofibromatosis type 1 alternative splicing is a key regulator of Ras signaling in neurons.</a> Molecular and Cellular Biology. 34, 2188-2197 (2014).</li>
<li>Nguyen, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurofibromatosis+type+1+alternative+splicing+is+a+key+regulator+of+Ras%2FERK+signaling+and+learning+behaviors+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Neurofibromatosis type 1 alternative splicing is a key regulator of Ras/ERK signaling and learning behaviors in mice.</a> Human Molecular Genetics. 26, 3797-3807 (2017).</li>
<li>Zhou, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hu+proteins+regulate+alternative+splicing+by+inducing+localized+histone+hyperacetylation+in+an+RNA-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Hu proteins regulate alternative splicing by inducing localized histone hyperacetylation in an RNA-dependent manner.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, E627-E635 (2011).</li>
<li>Sharma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-mediated+histone+modifications+regulate+alternative+splicing+in+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Calcium-mediated histone modifications regulate alternative splicing in cardiomyocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, E4920-E4928 (2014).</li>
<li>Adzemovic, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+Analysis+in+the+Rat+Central+Nervous+System+and+Peripheral+Lymph+Node+Tissue+Sections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2016).</li>
<li>Shokry, I. M., Callanan, J. J., Sousa, J., Tao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+In+Situ+Hybridization+using+Oligonucleotide+Probes+on+Paraformaldehyde-prefixed+Brain+of+Rats+with+Serotonin+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2015).</li>
<li>Erben, L., He, M. X., Laeremans, A., Park, E., Buonanno, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Ultrasensitive+In+Situ+Hybridization+Approach+to+Detect+Short+Sequences+and+Splice+Variants+with+Cellular+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">A Novel Ultrasensitive In Situ Hybridization Approach to Detect Short Sequences and Splice Variants with Cellular Resolution.</a> Molecular Neurobiology. , (2017).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

תקשורת זו מדווחת על השימוש BaseScope איש RNA לבדוק דפוסי ביטוי בסעיפים מוח העכבר. הוכח שבצומת הזה תחושה אנטי אקסון-אקסון רגשים קצרים יותר נוקלאוטידים 50 ניתן לייעד אקסון הכללה ולהקפיץ איזופורמים robustly, במיוחד. יתר על כן, האותות וכתוצאה מכך יכול לשמש כדי לחשב PSI של אקסון חלופית.
כמה וריאציות נבדקו במסגרת ההליך. לדוגמה, מקטעי רקמת קפוא שנוצר על ידי חלוקתה cryostat היו נבדקו והוכחה יעילותן כדי להצליח לשימוש בפרוטוקול איש זה. במקרה זה, עם זאת, הצעד deparaffinization 2.1 השתנה ל ניקוי של OCT עם...

חלופי splicing (AS) הוא תהליך נפוץ המתרחשת במהלך ההבשלה pre-mRNA. בתהליך זה, אקסון ניתן לכלול באופן שונה ב- mRNA בוגר. לכן, דרך AS, אחד הגנים ניתן להפיק רבות mRNAs את הקוד עבור מוצרי חלבונים שונים. ההערכה היא כי 92-94% של גנים אנושיים לעבור חלופי splicing1,2. חלופה חריג שחבור דפוסי נבעה מוטציות גנטיות נקשרו למספר רב של מחלות, כולל נוירודגנרטיביות, ניוון חולים myotonic וסרטן3,4. לפיכך חיוני לחקור ולהבין טוב יותר מנגנונים רגולטוריים splicing חלופיים, בניסיון למצוא טיפולים חדשים של מחלות אנושיות.
כפי מוסדר לעתים קרובות אופנה ייחודיים לסוג התא. חשוב לקבוע הדפוס ביטוי כמו של גן מסוים במערכת הביולוגית נתון. עם זאת, זה הופך מסובך כאשר איבר מורכב המכיל סוגים רבים ושונים של תאים, כמו במוח או בלב, הוא למד. במקרה זה, הוא הבחירה האידיאלית של מערכת assay RNA בחיי עיר הכלאה (איש) באמצעות רקמות סעיפים אז הדפוס ביטוי כמו של גן מסוים ניתן להבחין סוגי תאים רבים בו זמנית. אכן, אקסון ספציפיים הגששים שימשו להערכת רמות הביטוי של6,5,חלופי אקסון7. עם זאת, גישה זו אינה מתאימה עבור כמו ניתוח דפוס מהסיבות הבאות. שיטות איש הראשון, המקובלת בדרך כלל להשתמש יותר מ 300 הגששים bp, בעוד הגודל הממוצע של חוליות exons פנימי (אקסון לא הראשון או האחרון) הוא 170 נוקלאוטידים8,9. שנית, בעת בדיקה ספציפית אקסון לבחון את התבנית splicing של אקסון חלופי פנימי, isoform mRNA היחיד שזיהה את המכשיר הוא אחד המכיל את אקסון, תוך isoform mRNA בלי אקסון לא ניתן לאתרם. לפיכך, חישוב האחוזים משולבים (PSI) ערך עבור אקסון חלופי הוא מסובך. יתר על כן, איש פלורסנט קונבנציונלי משלבת לעיתים קרובות איש עם immunostaining, אשר מפחית את יעילות הזיהוי ואת החוסן. לדוגמה, במחקר שחקרה את מפגינות שחבור isoform מיתוג של אצטילכולין אסטראז (AChE) mRNA, digoxigenin סופחה החללית איש וזוהה באמצעות נוגדן anti-digoxigenin. לחלופין, בדיקה התווית על-ידי ביוטין זוהה על ידי המספר המשלים של phosphatase אלקליין/streptavidin מצע phosphatase אלקליין10. אף שיטה משתמשת בכל אסטרטגיה הגברה כדי להגביר את הרגישות של זיהוי. כתוצאה מכך, זה מאתגר כדי לזהות תעתיקים mRNA באים לידי ביטוי ברמות נמוכות. לפיכך, מערכת assay איש פשוט יותר ועוצמתי יותר יש צורך לנתח בתור ביטוי דפוסי בחיי עיר.
BaseScope לאחרונה פותחה על הפלטפורמה של RNAscope, ומבוססת בסיס, בשימוש נרחב מערכת assay איש. שתי מערכות assay מעסיקים טכנולוגיה במטרה ההגברה מגביר את הרגישות של זיהוי11,12. מה שמבדיל את אחד מהשני הוא האורך של רצף המטרה, אשר הוא קצר ככל נוקלאוטידים 50 עבור BaseScope, 300-1000 נוקלאוטידים עבור RNAscope. לכן ניתן הגששים עיצוב שכוונו אקסון-אקסון צמתי כדי לזהות איזופורמים mRNA חלופיים ספציפיים. במחקר הנוכחי, הליך הוקמה כדי לבחון ההקלדה דפוסי ביטוי של נוירופיברומטוזיס 1 (Nf1) אקסון 23a, אקסון חלופי בהרחבה למד באותה מעבדה13,14,15 , 16 , 17, בסעיפים מוח העכבר. התוצאות מדגימים כי BaseScope הינה מערכת אידיאלי ללמוד דפוסי ביטוי של אקסון 23a Nf1 באתרו בתוך. מערכת זו assay יכול להיות מותאם כדי לנתח כמו דפוסי ביטוי של exons אלטרנטיביים רבים, הוא מייצג כלי רב עוצמה חדשה בלימודי בשם

<table><tbody><tr><td><חזק>ציוד</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>היברידיזציה תנור</td><td>מתקדם לאבחון תאים</td><td>241000ACD</td><td></td></tr><tr><td>מגש בקרת לחות (עם מכסה)</td> <td>אבחון תאים מתקדם</td><td>310012</td><td></td></tr><tr><td>מתלה כתמים</td><td>310017</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מתקדם פלטה חמה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>1160049SH</td><td></td></tr><tr><td>אימפריאל III חממה לשימוש כללי</td><td>מעבדה-קו</td><td>302</td><td></td></tr><tr><td>סורק שקופיות</td><td>Leica</td><td>SCN400</td><td></td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>< ערכת טיפול מקד>ים חזקה</חזקה></td><td>אבחון תאים מתקדם</td><td>322381</td><td></td></tr><tr><td>מי חמצן</td><td>אבחון תאים מתקדם</td><td>2000899</td><td></td></tr><tr><td>פרוטאז III*</td><td>אבחון תאים מתקדם</td><td>2000901</td><td></td></tr><tr><td>אחזור מטרה 10x</td><td>אבחון תאים מתקדם</td><td>2002555</td><td></td></tr><tr><td>ערכת ריאגנטים לזיהוי BaseScope</td><td>אבחון תאים מתקדם</td><td>332910</td><td></td></tr><tr><td>AMP 0</td><td>אבחון תאים מתקדם</td><td>2001814</td><td></td></tr><tr><td>AMP 1</td><td>אבחון תאים מתקדם</td><td>2001815</td><td></td></tr><tr><td>AMP 2</td><td>אבחון תאים מתקדם</td><td>2001816</td><td></td></tr><tr><td>AMP 3</td><td>אבחון תאים מתקדם</td><td>2001817</td><td></td></tr><tr><td>AMP 4</td><td>אבחון תאים מתקדם</td><td>16229B</td><td></td></tr><tr><td>AMP 5-RED</td><td>אבחון תאים מתקדם</td><td>16229C</td><td></td></tr><tr><td>AMP 6-RED</td><td>אבחון תאים מתקדם</td><td>2001820</td><td></td></tr><tr><td>מהיר RED-A</td><td>אבחון תאים מתקדם</td><td>2001821</td><td></td></tr><tr><td>מהיר RED-B</td><td>אבחון תאים מתקדם</td><td>16230F</td><td></td></tr><tr><td>50x מאגר שטיפה</td><td>אבחון תאים מתקדם</td><td>310091</td><td></td></tr><tr><td>בדיקה בקרה שלילית- עכבר DapB-1ZZ</td><td>אבחון תאים מתקדם</td><td>701021</td><td></td></tr><tr><td>בדיקה בקרה חיובית- עכבר (מ"מ)-PPIB-1ZZ</td><td>אבחון תאים מתקדם</td><td>701081</td><td></td></tr><tr><td>בקרת שקופיות-עכבר 3T3 גלולת תאים</td><td>מתקדמת</td><td>310045</td><td></td></tr><tr><td><חזק>שם</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק></td><td><חזק>מספר קטלוגי</חזק></td><td><חזק>הערות</ חזק</td></tr><tr><td>><חזק>אספקה אחרת</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>נייר לחות</td><td>מתקדם אבחון תאים</td><td>310015</td><td></td></tr><tr><td>מתלה כביסה</td><td>אמריקאי מאסטר טק מדעי</td><td>9837976</td><td></td></tr><tr><td>שטיפת כלים</td><td>אמריקאי מאסטר טק מדעי</td><td>LWS20WH</td><td></td></tr><tr><td>מחסום הידרופובי</td><td>מעבדה וקטורית</td> עט <td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>זכוכית שקופיות</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>כיסוי זכוכית, 24 מ"מ x 50 מ"מ</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12--545-F</td><td></td></tr><tr><td><חזק>שם</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק></td><td><חזק>מספר קטלוגי</חזק></td><td><חזק>הערות</חזק</td></tr><tr><td>><חזק>כימיקלים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אמוניום הידרוקסיד</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>002689</td><td></td></tr><tr><td>100% אתנול (EtOH)</td><td>Decon Labs</td><td>2805</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת פורמלדה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>SF94-4</td><td></td></tr><tr><td>המטוקסילין I</td><td>אמריקאי מאסטר טק סיינטיפיק</td><td>17012359</td><td></td></tr><tr><td>הרכבה מעבדות וקטור בינוני</td><td></td><td>H-5000</td><td></td></tr><tr><td>קסילן</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>173942</td><td></td></tr></tbody></table>

ניתוח כמותי של שחבור חלופי pre-mrna בסעיפים מוח העכבר באמצעות ה-rna בחיי עיר הכלאה assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

חלופי splicing (AS) מתרחשת אצל יותר מ-90% של גנים אנושיים. למשמעות הביטוי אקסון spliced לחילופין מוסדר לעתים קרובות אופנה ייחודיים לסוג התא. כביטוי דפוסי מנותחים בדרך כלל על ידי RT-PCR ו- RNA-seq באמצעות דגימות RNA מבודדים מתוך אוכלוסיה של תאים. בחיי עיר בחינת כמו דפוסי ביטוי עבור מבנה ביולוגי מסוים יכול להתבצע על ידי RNA בחיי עיר הכלאה (איש) משתמש ספציפי אקסון הגששים. עם זאת, השימוש המסויים איש הוגבלה בגלל exons חלופית הם בדרך כלל קצרים מדי בשביל עיצוב ספציפי אקסון הגששים. בדו ח זה, השימוש BaseScope, טכנולוגיה פיתחה לאחרונה מעסיקה oligonucleotides antisense קצר ב- RNA איש, מתואר לנתח כמו דפוסי ביטוי בסעיפים מוח העכבר. אקסון 23a של נוירופיברומטוזיס מסוג 1 (Nf1) משמש דוגמא כדי להמחיש כי אקסון קצר-אקסון צומת הגששים להפגין אותות חזקים הכלאה עם ירידה לפרטים גבוה בניתוח RNA איש על חלקים במוח העכבר. חשוב מכך, אותות מזוהה עם הגששים הכללה דילוג ספציפיים או אקסון יכול לשמש באופן אמין לחשב את אחוז משולבים בערכים Nf1 אקסון 23a הביטוי תחומים אנטומיים שונים של מוח העכבר. נסיוני ואת שיטת חישוב עבור כמו ניתוח מוצגים. התוצאות מצביעות על כי BaseScope מספק כלי חדש חזק כדי להעריך בתור ביטוי דפוסי בחיי עיר.

איש BaseScope בוצע באמצעות העכבר שלושה זנים: CD1 פראי סוג עכברים, C57BL/6J פראי סוג עכברים ועכברים Nf123aIN/23aIN מוטציה ברקע C57BL/6J, ב אקסון אילו 23a נכלל כל סוגי תאים כתוצאה מכך מהונדסים splice באתר מוטציות14,15.
כצעד ראשון, המערכת assay איש נבדקה באמצעות החברה מסופקים ריאגנטים: שקופיות שיש תאים 3T3, ואת שלילי חיובי איש רגשים. כפי שמוצג <strong c...

בחיי עיר הכלאה (איש) פרוטוקול המשתמשת oligonucleotides antisense קצר כדי לזהות דפוסים חלופיים pre-mRNA splicing בסעיפים מוח העכבר מתואר.

ניתוח כמותי של שחבור חלופי Pre-mRNA בסעיפים מוח העכבר באמצעות ה-RNA בחיי עיר הכלאה Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום שחבור קדם-mRNA חלופי. באופן ספציפי הוא מספק מערכת בדיקה חזקה ורגישה לבחינת דפוסי שחבור חלופיים באתרם בפרוסות רקמה. בשיטה זו ניתן לנתח שחבור חלופי בו זמנית בתת-סוגים רבים הכלולים במבנים ביולוגיים מורכבים כגון מוח עכבר.היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא משתמשת בבדיקות צומת אקסון אנטי-סטטיות בהלם mRNA בהכלאה באתרה כדי לייצר אותות הכלאה ספציפיים לאיזופורמים. טכנולוגיית הגברת אותות בניין מגבירה את רגישות הזיהוי כדי לספק אותות היברידיזציה חזקים. האותות שזוהו היו הכללת אקסונים שנמלטו מבדיקות ספציפיות המשמשות לחישוב אחוז החיבור במדדים חיוניים באזורים אנטומיים שונים במוח העכבר.במחקר זה NF1 exon 23a משמש כדוגמה להמחשת השימוש במערכת הבדיקה. עם זאת, ניתן להתאים את המערכת לניתוח דפוסי ביטוי של אקסונים חלופיים רבים. כדי להתחיל פרפיניזציה של מוח העכבר קטע D, מלאו שני כלי כביסה ב-250 מיליליטר קסילן.ועוד שניים עם 250 מיליליטר של 100% אתנול בתוך מכסה אדים. הכנס את מגלשות הטישו למתלה כביסה. לאחר מכן, הניחו את מתלה הכביסה בכלי המכיל קסילן ודגרו למשך חמש דקות תוך הזזת המתלה למעלה ולמטה לפחות שלוש פעמים וחזרו על הפעולה עם צלחת הקסילן השנייה.לאחר מכן מניחים את המדף בכלי המכיל אתנול ודוגרים במשך שתי דקות באותן תנועות למעלה ולמטה ואז חוזרים על הפעולה עם צלחת האתנול השנייה. לייבוש המגלשות, הזיזו את המתלה מצלחת האתנול השנייה והניחו אותו בתוך אינקובטור בחום של 60 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. השתמש בעט מחסום הידרופובי כדי לצייר מחסום של 0.75 אינץ' על 0.75 אינץ' סביב קטע הרקמה ולייבש באוויר במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר.הפעל את תנור ההכלאה והגדר את הטמפרטורה על 40 מעלות צלזיוס. לאחר הרטבה מוחלטת של נייר לחות במים מזוקקים, הנח אותו במגש בקרת לחות. לאחר מכן הכנס את מגש בקרת הלחות לתנור ההכלאה.לאחר הנחת השקופיות המיובשות על ספסל, יש לכסות לחלוטין את חלקי הרקמה בכל שקופית בחמש עד שמונה טיפות של תמיסת מי חמצן. דגירה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. הקש על השקופיות על נייר סופג, אחת בכל פעם כדי להסיר את תמיסת מי החמצן ולהכניס את השקופיות למתלה כביסה.טבלו את המתלה בכלי כביסה המכיל מים תוך כדי הזזתו למעלה ולמטה שלוש עד חמש פעמים כדי לשטוף את המגלשות. מלאו זכוכית של ליטר אחד המונחת על פלטה חמה ב-700 מיליליטר של טיפול להסרת מטרה פי 1 וכסו אותה בנייר כסף. הכנס מדחום דרך מכסה נייר הכסף והפעל את הפלטה החמה, הגדר על טמפרטורה גבוהה למשך 10 עד 15 דקות.לאחר שטמפרטורת מגיב האחזור מגיעה ל-98 מעלות צלזיוס, הגדר את הפלטה החמה לטמפרטורה נמוכה כדי לשמור על מצב רתיחה קל. לאחר מכן, הסר בזהירות את נייר הכסף והניח את המתלה בתוך הכוס. מכסים את הכוס בנייר כסף ודוגרים למשך 15 דקות.השתמש במלקחיים כדי להעביר את המתלה מהכוס לכלי כביסה המכיל 200 מיליליטר מים מזוקקים ולדגור למשך 15 שניות. לאחר 15 שניות מניחים את המדף בכלי כביסה המכיל 100% אתנול ודוגרים למשך שלוש דקות. מוציאים את המדף מהכלי ומייבשים בחום של 60 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.לאחר הנחת השקופיות על מתלה כתמים, כסו את חלקי הרקמה בחמש טיפות פרוטאז 3 לכל שקופית. מניחים בזהירות את המתלה במגש בקרת הלחות ומכניסים את המגש לתנור ההכלאה ודוגרים בחום של 40 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר הוצאת המתלה מהמגש, הקש על השקופיות כדי להסיר עודפי נוזלים והכנס אותן למתלה כביסה.הנח את המתלה בכלי כביסה המכיל מים מזוקקים והזיז את המתלה למעלה ולמטה שלוש עד חמש פעמים כדי לשטוף את המגלשות. כדי להתכונן להכלאה באתר, דגרו את הבדיקות והריאגנטים של AMP בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. הכנס את מגש בקרת הלחות לתנור ההכלאה והגדר על 40 מעלות צלזיוס.לצורך הכלאת בדיקה, הסר את השקופיות ממתלה הכביסה והקש עליהן כדי להסיר עודפי נוזלים. הנח את השקופיות על מתלה כתמים. השתמש בעיפרון כדי לתייג את השקופיות עם שם הבדיקה.הנח שלוש שקופיות רקמת מוח חתוכות סמוכות להכלאה עם שלוש בדיקות שונות של מיטוזה של סיבים עצביים מסוג 1 יחד. מכיוון שיש בדיקות ספציפיות לאיזופורמים שונים מאוד, אני משתמש בקטעי רקמה חתוכים סמוכים. זה קריטי שקטעים אלה יטופלו בדיוק אותו הדבר בשלבי הכלאה, הגברה וזיהוי אותות כדי להבטיח את הדיוק של אחוז החיבור בחישוב.כסו את חלקי הרקמה בארבע טיפות בדיקה לכל קטע, שקופית אחת בכל פעם כדי למנוע התייבשות של החלקים. לאחר מכן הנח את מתלה הכתמים במגש בקרת הלחות והכנס אותו לתנור 40 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. לאחר מכן, הניחו מתלה כביסה בכלי כביסה מלא ב -200 מיליליטר של מאגר כביסה 1X.לאחר מכן הקש על כל שקופית, אחת בכל פעם על מגבת נייר כדי להסיר עודפי נוזלים. והכנס מיד כל שקופית למתלה הכביסה. דגרו בטמפרטורת החדר למשך שתי דקות בכלי מלא במאגר כביסה טרי תוך הזזת המתלה למעלה ולמטה שלוש עד חמש פעמים ולאחר מכן חזרו על השטיפה בכלי חדש.לאות ampלהגבר, הקש על כל שקופית כדי להסיר עודפי מאגר כביסה והנח אותם על מתלה כתמים. כסו את חלק הרקמה בכל שקופית בארבע טיפות של AMP אפס ריאגנט. לאחר מכן, הניחו את המתלה במגש בקרת הלחות, הכניסו את המגש לתנור ודגרו בחום של 40 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.שטפו את השקופית פעמיים עם מאגר כביסה כפי שנעשה בעבר בניסוי זה. חזור על שלב הגברת האות עם ריאגנטים של AMP אחד עד שש כמתואר בפרוטוקול הטקסט ושטוף את השקופיות לאחר כל שלב. לזיהוי אותות, הסר את מאגר הכביסה העודף מהשקופיות על ידי הקשה והנח אותם על מתלה כתמים.לאחר מכן, ערבבו שני מיקרוליטרים של B אדום מהיר עם 120 מיקרוליטר של A אדום מהיר בצינור מיקרו צנטריפוגה. הוסף את התמיסה לחלקי הרקמה בכל שקופית כדי לכסות אותם במלואם. הנח את מתלה הכתמים במגש בקרת הלחות, כסה את המגש ודגר במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר מכן הסר את התמיסה והכנס את השקופיות למתלה כביסה. הנח את המתלה בכלי כביסה המכיל מי ברז כדי לשטוף את המגלשות וחזור על הכביסה. לאחר הכביסה השנייה, הקש על נייר סופג כדי להסיר עודפי מים.לאחר מכן, הניחו את המדף בכלי המכיל תמיסת צביעה של 50% המטוקסילין. הזז את המתלה למעלה ולמטה מספר פעמים. ודוגרים שתי דקות בטמפרטורת החדר.מעבירים את המתלה לכלי כביסה המכיל מי ברז. הזיזו את המתלה למעלה ולמטה חמש פעמים וחזרו על הכביסה עד שהשקופיות יתבהרו, בעוד קטעי הרקמה נשארים סגולים. לאחר מכן העבירו את המדף לכלי המכיל 0.02% מי אמוניה.הזז את המתלה למעלה ולמטה פעמיים עד ארבע פעמים עד שהחלקים הופכים לכחולים. שוטפים את השקופיות במי ברז שלוש עד חמש פעמים בכלי המכתים. לאחר מכן, הניחו את המתלה בתוך חממה ודגרו למשך 15 דקות בחום של 60 מעלות צלזיוס לייבוש השקופיות.כשהוא יבש לחלוטין, הוסף טיפה אחת של אמצעי הרכבה על כל שקופית כדי לכסות את הפרוסה. לאחר מכן, הנח בזהירות כיסוי בגודל 24 על 50 מילימטר מעל חלקי הרקמה בכל שקופית. לאחר ייבוש השקופיות באוויר למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, המשך באיסוף הנתונים.כדי לחשב את האחוז המחובר, או ערך ה-PSI עבור אקסון 23a, נספרים מספר התאים והנקודות בשלושה תת-אזורים של קליפת המוח, וההיפוקמפוס CA3. בדיקת הכלאה של RNA באתרה מבוצעת בחלקי מוח של עכברים מסוג CD1 באמצעות שלוש בדיקות ספציפיות שונות ל-NF1. נקודות מנוקבות אדומות שנצפו בקטעי קליפת המוח וההיפוקמפוס, מצביעות על אותות חיוביים על ידי NF1 כולל, ספציפי להכללה ודילוג על בדיקות ספציפיות.לאחר מכן נספרים אותות ה-ISH משלושת הבדיקות ומשמשים לחישוב PSI. בדיקת הכלאת RNA באתרה מבוצעת בקליפת המוח של עכברים שחורים מסוג 6J ועכברים מוטנטיים שחורים C57 6J שבהם אקסון 23a כלול בכל סוגי התאים. נקודות מנוקבות אדומות שנצפו בקליפת המוח של עכברים שחורים מסוג 6J שחורים, מצביעות על אותות חיוביים על ידי NF1 כולל, הכללה ספציפית ודילוג על בדיקות ספציפיות.בעכברים מוטנטיים שחורים C57 6J, אותות דומים מתקבלים על ידי בדיקות ספציפיות להכללה והכללה של NF1. עם זאת, לא מזוהה אות בעת שימוש בדילוג על בדיקה ספציפית, מה שמצביע על כך ששתי בדיקות המכוונות להכללה או דילוג של אקסונים הן ספציפיות ביותר. מכיוון שתיוג רב צבעוני על אותן שקופיות רקמה עדיין אינו זמין להליך זה, נעשה שימוש בבדיקות שונות בשקופיות הרקמה השונות.כדי להשיג את ערכי השחבור המדויקים באחוזים, חשוב להשתמש בשקופיות חתוכות סמוכות ולטפל בשקופיות בדיוק באותו אופן לאורך הליך זה. משלימים הליך זה הם אמצעים כמו אימונוהיסטוכימיה, שניתן לבצע כדי לענות על שאלות נוספות הנוגעות ללוקליזציה ותפקוד של איזופורמים שחבור המתבטאים באופן דיפרנציאלי.

quantitative-analysis-alternative-pre-mrna-splicing-mouse-brain

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

בשל האופי החולף של mRNA מראש, זה יכול להיות קשה לבודד...

שיטה מהירה תפוקה גבוהה עבור Ribonucleoproteins מיפוי (RNPs) על mRNA מראש אדם

סרטון זה מדגים את הזיהוי של סינתזת RNA של קולטני סרוטונין באמצעות בדיקות אוליגונוקלאוטידים ברקמת מוח של חולדות המושפעות מתסמונת סרוטונין. הפרוטוקול כולל טיפול מקדים ברקמות, הכלאת בדיקה וזיהוי אנזימטי כדי לדמיין ולכמת את ביטוי ה-RNA של קולטני סרוטונין במיקרוסקופ.

הכלאה באתרה באמצעות בדיקות אוליגונוקלאוטידים לחקר ביטוי RNA בחלקי מוח של חולדות

מקור: Jolly, S., et.al. שילוב של פלואורסצנציה כפולה  בהכלאה באתר עם תיוג חיסוני לזיהוי ביטוי של שלושה גנים במקטעי מוח של עכברים. J. Vis. Exp. (2016). סרטון זה מדגים את השימוש בפלואורסצנציה כפולה בהכלאה באתרה כדי לדמיין את הביטוי של שתי מטרות RNA במקטעי מוח של עכברים. הפרוטוקול כולל זיהוי רציף של RNA באמצעות בדיקות המסומנות בפלואורסצאין איזותיוציאנט ודיגוקסיגנין, ואחריו הגברת אות אנזימטית להגברת הרגישות. הקרינה המתקבלת מאפשרת ניתוח לוקליזציה משותפת של רנ"א המטרה בתוך הרקמה.

 ביצוע הכלאה של פלואורסצנציה כפולה באתרה לאיתור ביטוי גנים במקטעי מוח של עכבר

הוכח כי ויסות שחבור חלופי תורם למעבר אפיתל-מזנכימלי (EMT), תוכנית תאית חיונית בתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים. כאן אנו מתארים שיטה המשתמשת במודל EMT הניתן להשראה לזיהוי שחבור חלופי במהלך EMT.

איתור של אלטרנטיבי שחבור במהלך המעבר אפיתל- mesenchymal

RNA in situ hybridization (ISH) מאפשר הדמיה של RNA בתאים וברקמות. כאן אנו מראים כיצד ניתן להשתמש בהצלחה בשילוב של RNAscope ISH עם אימונוהיסטוכימיה או צבעים היסטולוגיים כדי לזהות mRNAs הממוקמים באקסונים בחלקים של מוחות עכברים ובני אדם.

איתור של Axonally המותאם למקום mRNAs בסעיפי מוח באמצעות ברזולוציה גבוהה<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה

לוקליזציה של ביטוי גנים לסוגי תאים ספציפיים יכולה להיות מאתגרת בשל היעדר נוגדנים ספציפיים. כאן אנו מתארים פרוטוקול לזיהוי משולש בו זמנית של ביטוי גנים על ידי שילוב של RNA פלואורסצנטי כפול הכלאה באתרו עם צביעה חיסונית.

שילוב קרינה זוגית<em&gt; באתרו</em&gt; כלאה עם Immunolabelling עבור איתור של הביטוי של שלושה גנים בסעיפי מוח עכבר

כאן אנו מתארים פרוטוקול שנועד לבחון את ההשפעה של שחבור סוטה על עמידות לתרופות בגידולים מוצקים דם ממאירות. למטרה זו, נתחנו את פרופילי transcriptomic דגמים הוריים ועמידים במבחנה באמצעות RNA-seq והקמתי שיטה המבוססת qRT-PCR כדי לאמת גני מועמדים.

שימוש-רצף RNA כדי זיהוי וריאנטים אחוי Novel הקשורות עמידות לתרופות ב<em&gt; במבחנה</em&gt; מודלי סרטן

כאן הצגנו מרבב תא יחיד mRNA שיטת רצף לביטוי גנים פרופיל ברקמות עובריים העכבר. השיטה המבוססת על droplet בודדת של תא mRNA (scRNA-Seq) בשילוב עם אסטרטגיות ריבוב יכולה לפרופיל תאים בודדים מדגימות מרובות בו זמנית, אשר מפחית באופן משמעותי את עלויות החומרים וממזער את השפעות האצווה הנסיוניות.

מרבב תא יחיד mRNA ניתוח הרצף של העכבר תאים עובריים

שחבור חלופי (AS) ופוליאדנילציה חלופית (APA) מרחיבים את מגוון האיזופורמים של שעתוק ותוצרים. כאן אנו מתארים פרוטוקולים ביואינפורמטיים לניתוח מבחני RNA-seq בתפזורת ו-3' של ריצוף קצה כדי לזהות ולהמחיש AS ו-APA המשתנים בין תנאי ניסוי.

זיהוי שחבור חלופי ופוליאדנילציה בנתוני RNA-seq

הקמנו מבחן הכלאה דופלקס באתרו למיפוי איזופורמים של קולטני אינסולין IR-A ו-IR-B במקלעת הכורואיד של העכבר, תוך התגברות על מגבלות השיטות המסורתיות. גישה ברזולוציה גבוהה זו חושפת ביטוי ספציפי לאיזופורמים, ומציעה תובנות חדשות לגבי איתות אינסולין במוח וטיפולים ממוקדי איזופורמים פוטנציאליים להפרעות נוירולוגיות.

הדמיה מדויקת של קולטני אינסולין A ו-B במוח עכברים עם בדיקת היברידיזציה של RNA באתרו

פרוטוקול זה מספק צינור חישובי יעיל לכימות תמלילי משפרים מתהווים. על ידי שילוב נגישות כרומטין, תכונת כרומטין ונתוני שעתוק, הוא מאפשר זיהוי מדויק וניתוח ספציפי לגדיל של פעילות משפר באזורים תוך-גניים מורכבים, תוך שהוא נשאר נגיש לחוקרים ללא הכשרה ביואינפורמטית נרחבת.

צינור חישובי לכימות RNA משפר אינטרגני/תוך-גני בתאי גזע עובריים של עכבר

למדו לזהות שחבור חלופי של pre-mRNA במוח העכבר באמצעות היברידיזציה in situ עם בדיקות exon junction ספציפיות לאיזופורם. שיטה זו מאפשרת ניתוח רגיש של תבניות שחבור במבנים עצביים מורכבים.

ניתוח כמותי של שחבור חלופי Pre-mRNA בסעיפים מוח העכבר באמצעות ה-RNA בחיי עיר הכלאה Assay

גלה סרטונים נוספים