ייצור והדמיה של חיידקי Spheroplasts ו- Protoplasts כדי לאפיין פפטיד מיקרוביאלית לוקליזציה

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הפפטידים האנטי-מיקרוביאלי לגבי האם פפטידים מתמקמים או מתמקמים על פני קרום התא. שימוש בספרופלסטים ופרוטופלסטים מאפשר הדמיה וניתוח של לוקליזציה של פפטידים במערכת מודל רלוונטית מבחינה פיזיולוגית ללא אתגרי הרזולוציה בהם נתקלים בהדמיית תאי חיידקים. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי פפטידים אנטי-מיקרוביאליים, ניתן ליישם אותה גם על חומרים פעילים אחרים בממברנה כגון פפטידים חודרים לתאים.

יש להכין ספרופלסט E.coli גרם שלילי ופרוטופלסט B.megaterium גרם חיובי בארון בטיחות ביולוגי או במכסה זרימה למינרי בטכניקה סטרילית מתאימה. אם תרצה, זני חיידקים יכולים להכיל פלסמיד עמיד לאנטיביוטיקה, וניתן להכין ספרופלסטים ופרוטופלסטים על ספסל מעבדה פתוח. בסרטון זה מכינים ספרופלסטים ופרוטופלסטים על ספסל מעבדה פתוח באמצעות זני חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה.

כדי להקים תרבית לילה, השתמש בקצה מיקרופיפטה סטרילי כדי להעביר מושבת חיידקים בודדת מצלחת תרבית אגר מוצקה לצינור תרבית של 14 מיליליטר, המכיל שניים עד שלושה מיליליטר של מרק סויה טריפטיקז של שלושה אחוזים, TSB, למשך דגירה של 16 עד 21 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם טלטול. להכנת ספרופלסט E.coli גרם שלילי, יש לדלל את תרבית הלילה ביחס של 1 ל-100, ו-25 מיליליטר TSB בבקבוק של 250 מיליליטר, ולהחזיר את החיידקים לחממה הרועדת למשך 2.5 שעות נוספות. כאשר התמיסה הגיעה לצפיפות אופטית של 0.5 עד 0.8 ב-600 ננומטר, יש לדלל את התרבית ביחס של 1 עד 10 ב-TSB טרי בבקבוק חדש של 250 מיליליטר למשך דגירה שנייה של 2.5 שעות עם ריכוז אפקטיבי סופי של 60 מיקרוגרם למיליליטר צפלקסין.

לייצר חוטי תא בודדים באורך של כ-50 עד 150 מיקרומטר, כפי שמוצג במיקרוסקופ אור בהגדלה של פי 1000. צנטריפוגה, תמיסת החיידקים לקצירת החוטים ולסילוק הסופרנטנט. שוטפים את החוטים בתוספת עדינה של מיליליטר אחד של סוכרוז מולארי 0.8, תוך הקפדה לא להפריע לגלולה.

לאחר דקה אחת השליכו את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור, והוסיפו את הריאגנטים המצוינים בסדר המתאים לחוטים. לאחר עשר דקות בטמפרטורת החדר, הוסיפו בהדרגה מיליליטר אחד של תמיסה A במשך תקופה של דקה, תוך כדי סיבוב עדין של התמיסה ביד. דגרו את התמיסה למשך ארבע דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן פצלו את תרחיף החוטים לשני אליקוטים שווים בין שני צינורות חרוטיים של 15 מיליליטר המכילים שבעה מיליליטר של תמיסה של ארבע מעלות צלזיוס B.לאחר מכן, גלולה את החוטים על ידי צנטריפוגליזציה, והשתמש בפיפט אסירולוגי כדי להסיר בזהירות את כל המיליליטר מלבד אחד עד שניים של הסופרנטנט מבלי להפריע לכדורים.

השתמש במיקרופיפטה p1000 כדי להשעות בעדינות את הכדורים. בדוק כמות קטנה של הדגימה להיווצרות ספרופלסט על ידי מיקרוסקופ אור. לאחר מכן ניתן לאחסן את הספרופלסט במינוס 20 מעלות צלזיוס עד שבוע או עד שהם עברו שלושה מחזורי הפשרה.

להכנת פרוטופלסטים גראם חיוביים של B.megaterium, יש לדלל את תרבית החיידקים הלילה ביחס של 1 ל-1000 ב-100 מיליליטר של שלושה אחוז TSB בבקבוק של 250 מיליליטר לדגירה של 4.5 שעות ב-37 מעלות צלזיוס עם טלטול. כאשר התרבית הנוזלית מגיעה לצפיפות אופטית של 0.9 עד 1.0 ב-600 ננומטר, פצלו את החיידקים בין שני צינורות חרוטיים של 50 מיליליטר לצנטריפוגה שלהם, והשתמשו בפיפט אסיריולוגי כדי להפריד את הסופרנטנטים. השעו מחדש את הכדורים ב-2.5 מיליליטר של מדיום פרוטופלסט לכל צינור, ומשכו את המתלה לצינור חרוטי יחיד לתרבית בבקבוק של 125 מיליליטר.

הוסף לתרבית מיליליטר אחד של חמישה מיליגרם למיליליטר ליזוזים למשך שעה של דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם טלטול. ניטור צמיחת הפרוטופלסט תחת מיקרוסקופ האור וציון אי סדרים, כגון חיידקים המופיעים כמוטות נפוחים במקום כדורים. בתום הדגירה, העבירו את המתלה לצינור חרוטי של 15 מיליליטר לצנטריפוגה, והשעו מחדש את הגלולה בחמישה מיליליטר של מדיום פרוטופלסט.

לאחר מכן ניתן לאחסן את הפרוטופלסט במינוס 20 מעלות צלזיוס עד שבוע או עד שהם עברו שלושה מחזורי הפשרה בהקפאה. להדמיה של הספרופלסט או הפרוטופלסט העבירו חמישה מיקרוליטר מהמתלה המעניין לשקופית זכוכית מצופה פולי ליזין, ואחריה שני מיקרוליטרים של fitc המסומנים 100 עד 200 פפטיד מיקרוביאלי מיקרו-מולרי או AMP. לאחר דגירה של שלוש דקות מוגנת מאור, הוסף לדגימה מיקרוליטר אחד של תבנית ממברנה מתאימה לדגירה נוספת של שלוש דקות בחושך.

בסוף הדגירה מכסים את הספרופלסט או הפרוטופלסט המסומנים בהחלקת כיסוי זכוכית, ואטומים את החלקה עם הלק. כדי לדמות את התאים, הפעל את המיקרוסקופ הקונפוקלי ואת הלייזר המתאים ובחר את המטרה 63x, ולאחר מכן השתמש בתוכנת ההדמיה המתאימה כדי להשיג תמונות מחסנית Z מרוכבות של שמונה סיביות 512 על 512 המורכבות מפרוסות של 0.5 מיקרומטר של כל תא חיידקי מעניין. כדי להמחיש לוקליזציה של ה-AMP המסומן פלואורסצנטית, פתח את תמונות מחסנית Z המרוכבות בתוכנית ניתוח הדמיה מתאימה ואתר את הפרוסה המרכזית ביותר של הספרופלסט או הפרוטופלסט הראשון המעניין.

הניחו אזור עניין עגול אחד בקוטר 0.3 מיקרומטר על הממברנה, אחד במרכז התא ואחד הרחק מהתא כדי למדוד את הקרינה ברקע, תוך הקפדה על הימנעות מפיקסלים רוויים. לאחר מכן ניתן לחשב את עוצמת הקרינה הממוצעת בכל אזור עניין על ידי התוכנה. מגבלות הרזולוציה של מיקרוסקופי אור קונבנציונליים מקשות על ההבחנה אם אותות פפטיד המסומנים באופן פלואורסצנטי נובעים מהממברנה או מהחלל התוך-תאי בחיידקים רגילים.

כאשר האותות מתמקמים לקרום ייראו חופפים לחלל התוך תאי. לעומת זאת, הגודל המוגדל של הספרופלסט והפרוטופלסט בהשוואה לחיידקים רגילים, מביא לרזולוציה ברורה בין סמן הממברנה לחלל התוך תאי. מה שמקל על ההבחנה בלוקליזציה של פפטידים.

לדוגמה, ניתן לדמיין את הלוקליזציה לממברנה והטרנסלוקציה על פני קרום התא של פפטיד מסומן פלואורסצנטי הן ב-E.coli spheroplast והן ב-B.megaterium protoplast, על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונפוקלית כפי שהודגם זה עתה. מיקום אזורי העניין על הממברנה והחלל התוך-תאי של הספרופלסט או הפרוטופלסט וברקע, מאפשר לחשב את היחס בין עוצמת הקרינה של הפפטיד התוך-תאי לעוצמת הקרינה של הפפטיד על הממברנה של כל ספרופלסט או פרוטופלסט המקיים אינטראקציה עם AMP. לדוגמה, ניתן להשתמש בשיטה זו כדי להמחיש את האינטראקציות של מוטציה של פפטיד מיקרוביאלי שמקורו בהיסטון עם E.coli spheroplast ו-B.megaterium protoplasts.

בניסוי זה ה-AMP הדגים דפוס לוקליזציה דומה בשני זני החיידקים. הדגשת הטרנסלוקציה המופחתת ביחס לפפטיד מסוג הבר. בסופו של דבר, טכניקה זו מאפשרת לחוקרים לחקור דפוסי לוקליזציה של פפטידים ברמת התא הבודד.

מציע תובנות לגבי מנגנון הפעולה של פפטיד מעניין. בנוסף לאפשר לחוקרים לאסוף מספר גדול יותר של תמונות לאפיון שיטתי של מנגנוני פפטיד, תמונות של ספרופלסטים ופרוטופלסטים גדולים יותר ניתנות לניהול לניתוח כמותי יותר מאלו של תאי חיידקים קטנים יותר.