פלטפורמה Microphysiologic שומן אנושי: דחוקה שומן לבן
15 באוגוסט 2018
שומן לבן (וואט) יש ליקויים קריטי הדגמים תרבות הראשי הנוכחי שלה, הפרעה מטבולית מחקרים ופיתוח תרופתי. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצר מערכת microphysiological אדיפוז מאת וואט sandwiching בין גליונות של תאי סטרומה. מבנה זה מספק פלטפורמה יציבה וניתנת להתאמה לתרבות וואט העיקרי.
שיטה פורצת דרך זו מאפשרת לנו, לראשונה, לשמור על שומן חי ובריא ex vivo במשך מספר שבועות רצופים לחקר הביולוגיה של השומן. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהרקמה נשארת יציבה במשך שמונה שבועות בתרבית תוך סיכום המיקרו-סביבה השומית כולל תאי התמיכה הסטרומלית הטבעיים של השומן שמסביב. התחל בזריעת ASC במפגש של כ-80% בצלחות תרבית רקמות.
עבור כל באר SWAT רצויה, זרע באר תרבית רקמה קונבנציונלית אחת ובאר אחת בגודל המתאים על צלחת פלסטיק מצופה תרבית רקמות PNIPAAm. שמור על ה-ASC במדיום תרבית שלם ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך שישה עד שמונה ימים, והחלף את המדיום כל יומיים. עשרים וארבע שעות לפני זריעת ה-SWAT, עטפו את שפת דיסק הבוכנה של כל בוכנה למנגנון הזריעה של SWAT לפחות פעמיים עם סרט מעבדה כדי למנוע דליפה של תמיסת הג'לטין.
בארון בטיחות ביולוגית מחוטא באתנול, רססו על מתלה צינור חרוטי של 15 מיליליטר המכיל צינורות חרוטיים ריקים ולא מכוסים של 15 מיליליטר, כמו גם כל בוכנה עטופה בסרט עם 70% אתנול, והניחו כל בוכנה לתוך צינור ריק בזמן החיטוי. רססו כ-6.3 מנקי מתכת והניחו אותם על המתלה יחד עם זוג מלקחיים מחוברים. לאחר מכן סגור את אבנט הארון והפעל את אור ה-UV כדי להקל על ייבוש ועיקור למשך הלילה של חומרי מנגנון הזריעה.
כאשר התאים מגיעים ל-100% מפגש ומפגינים דפוס מפוספס, הוסף 0.75 גרם אבקת ג'לטין ל-10 מיליליטר HBSS. ולאזן את ה-pH של התמיסה עם 100 מיקרוליטר נתרן הידרוקסיד. הוסיפו את הג'לטין לאמבטיית מים בטמפרטורה של 75 מעלות צלזיוס ונערו את השפופרת בחוזקה כל חמש דקות, עד שהאבקה תתמוסס לתמיסה.
מסננים את תמיסת הג'לטין ההומוגנית דרך פילטר מזרק ומורחים את הג'לטין על הבוכנות. הקצוות המודבקים של הבוכנות ישמשו כתבנית בזמן שהג'לטין מתמצק. כאשר הג'לטין התמצק, פתחו את הסרט והשתמשו במלקחיים המחוברים כדי להסיר את הג'לטין מהקצה החיצוני של הבוכנה, תוך הקפדה שהג'לטין שנותר במרכז הבוכנה יהיה מפולס לחלוטין, כדי למקסם את המגע עם יריעת ה-ASC.
לאחר הסרת הג'לטין מכל הבוכנות, יש למרוח בעדינות כל בוכנה על לוחית ASC מצופה PNIPAAm באמצעות מנקי המתכת כדי להכביד על הבוכנות. לאחר דגירה של שעה וחצי בטמפרטורת החדר, העבירו את הצלחות לאמבט מי קרח למשך שעה וחצי נוספות כדי להשלים את הניתוק של יריעת התא ממשטח הצלחת המצופה PNIPAAm. לאחר מכן, נקו את החלק התחתון של הלוחות המצופים PNIPAAm כדי להסיר מים לא סטריליים.
עם קבלת רקמת השומן האנושית, הוסף מדיום תרבית תאים קרים לצינור מיקרו-צנטריפוגה אחד של 1.5 מיליליטר לכל תרבית לזריעה. ושטפו חלקים גדולים מרקמת השומן שלוש פעמים ב-PBS סטרילי, והסירו כמה שיותר PBS בין השטיפות. לאחר הכביסה האחרונה, השתמש במלקחיים ובסכין גילוח סטרילי כדי לטחון גס את הרקמה, להסיר כמה שיותר כלי דם ופאשיה עד שהתמיסה מקבלת עקביות נוזלית סמיכה עם כמה שפחות מקטעים בודדים גלויים של רקמת שומן לבנה.
לאחר שהושגה עקביות רקמה תקינה, השתמש בקצה מיקרו-פיפטה P1000 שונה כדי להעביר את הנפח המתאים של רקמה טחונה לכל צינור של 1.5 מיליליטר שהוכן בעבר ולערבב בקצרה את הרקמה הטחונה עם המדיום בתוך הצינורות. לאחר מכן, החלף את המדיום בכל תרבית ASC בנפח אחד של תמיסת רקמת שומן לבנה, והעביר בעדינות את בוכנות הג'לטין לתערובת רקמת השומן הלבנה על לוחות ה-ASC הבסיסיים. בדוק את החד-שכבות בלוחות המצופים PNIPAAm תחת מיקרוסקופ כדי לאשר ניתוק תאי ולהזיז את הלוחות אל פני השטח של גוש חום של 37 עד 40 מעלות צלזיוס בארון הבטיחות הביולוגית.
לאחר מכן הוסף שניים עד שלושה מיליליטר של מדיום תרבית מחומם כדי לדגור על התאים ולהקל על המסת הג'לטין. לאחר 30 דקות הסר בעדינות את הבוכנות משטח הצלחת, כסה את התרבויות במכסי הצלחת המתאימים והניח את הצלחות בחממת תרבית התאים. כאשר הג'לטין נוזל לחלוטין, שאפו והחליפו את מדיום תרבית התאים בנפח המתאים של מדיום M199 נטול פנול אדום בתוספת אינסולין, דקסמתזון ואנטיביוטיקה.
במשך 7.5 שבועות של תרבית, אשכולות ה-SWAT נשארים מאובטחים במקומם על החד-שכבתי עם שינויים מורפולוגיים קלים בלבד שנצפו באדיפוציטים בודדים. צביעה אדומה צלולה של נילוס של אשכולות אדיפוציטים חד-עיניים לאחר שבועיים של תרבית מוכיחה כי התאים הם אכן אדיפוציטים עם ממברנות שלמות, ולא חפץ, ציסטות או אדיפוציטים מתים. צביעת פרופידיום יודיד של SWAT בן 53 יום וצביעה אדומה שמן O של תרביות SWAT בנות 51 יום מאשרים כי האדיפוציטים שומרים על כדאיות גם בנקודות זמן מתקדמות.
אימונוציטוכימיה מדגימה את ביטוי החלבון הצפוי המתאים ולוקליזציה של סמני שומן בוגרים בתוך ה-SWAT ו-PCR כמותי מצביע על ביטוי של גנים מרכזיים של אדיפוציטים ברמת השעתוק. הערכת התפקוד האנדוקריני של בזיליקום מצביעה על הפרשת לפטין בזיליקום מתרביות ה-SWAT כפי שזוהה על ידי ELISA, ושחרור גליצרול מסוגל גם להיגרם בתגובה לגירוי כימי. השתלת שומן בתרבית SWAT חושפת מרבצי שומן גלויים בבירור ומשוחזרים בקלות 10 ימים לאחר ההשתלה שמכתימים את סמני השומן האנושיים אך לא העכברים.
לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך כחמש שעות אם היא מבוצעת כראוי. חשוב לזכור לעבד את הרקמה הראשונית במהירות כדי למזער את מוות התאים. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו PCR כמותי בזמן אמת, צביעה חיסונית או בדיקות פונקציונליות כדי לענות על שאלות נוספות לגבי האופן שבו אדיפוציטים מגיבים לתרופות או רעלים שונים.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע תרבית SWAT כפלטפורמה יציבה ואמינה למחקר השומן שלך. אל תשכח שעבודה עם רקמה אנושית ראשונית עלולה להיות מסוכנת, וכי יש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון לבישת PPE מתאים וטיפול ברקמה מתחת לארונות בטיחות ביולוגית בעת ביצוע הליך זה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול חדש לתחזוקה של רקמת שומן לבנה (WAT) בתרבית, המאפשר מחקר ממושך של ביולוגיה של רקמת שומן. השיטה מאפשרת לרקמה להישאר חיונית ויציבה למשך מספר שבועות, תוך חיקוי הדוק של הסביבה המיקרוסקופית הטבעית שלה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- ביולוגיה של רקמת השומן
- מערכות מיקרו-פיזיולוגיות
- פיתוח פרמקולוגי
רקע
- למודלים הנוכחיים של תרביות ראשוניות של WAT יש מגבלות משמעותיות.
- שמירה של רקמה שומנית ex vivo היא קריטית למחקרים מטבוליים.
- התאים הסטרומליים המקיפים את הרקמה ממלאים תפקיד חיוני ביציבותה.
- השיטות הקיימות אינן תומכות בתרבית ארוכת טווח של WAT.
מטרת המחקר
- פיתוח פלטפורמה יציבה וסתגלנית לתרבית ראשונית של WAT.
- שיפור ההבנה של הביולוגיה של רקמת השומן באמצעות תקופות תרבית ממושכות.
- הקלה על מחקר פראמקולוגי של רקמת שומן.
שיטות שהשתמשו בהן
- זריעת תאי סטרומה של רקמת שומן (ASC) בצפיפות של כ-80% კონפלואנס.
- שימוש בצלחות לתרבית רקמה מצופות ב-PNIPAAm לצורך זריעת SWAT.
- שמירה על תנאי תרבית של 37 °C ו-5% CO2.
- החלפת המדיום בכל יומיים במהלך תקופת התרבית.
תוצאות עיקריות
- המערכת המיקרו-פיזיולוגית של רקמת השומן נותרת יציבה במשך שמונה שבועות.
- המערכת משחזרת בהצלחה את המיקרו-סביבה הטבעית של רקמת השומן.
- מאפשרת את חקר הביולוגיה של רקמת השומן בסביבה מבוקרת.
- מדגימה את הפוטנציאל ליישומים פרמקולוגיים.
מסקנות
- שיטה זו מהווה התקדמות משמעותית בתרבית רקמה שומנית.
- היא מספקת פלטפורמה אמינה למחקרי מטבוליזם עתידיים.
- הגישה עשויה לשפר את פיתוח התרופות המכוונות לרקמה שומנית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פלטפורמת ה-SWAT נותנת מענה לפער קריטי במחקר של רקמת שומן על ידי מתן אפשרות לתרבית ראשונית ארוכת טווח של רקמת שומן לבנה אנושית, ובכך היא גוברת על מגבלת החיוניות של שבועיים הקיימת במודלים הנוכחיים. יכולת תרבית ממושכת זו תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים בתהליך גילוי תרופות על ידי שימור ארכיטקטורת הרקמה הטבעית, אינטראקציות סטרומליות ותפקוד פיזיולוגי למשך עד שמונה שבועות. הפלטפורמה מגבירה את הביטחון החזוי בהערכה פרה-קלינית של התערבויות מטבוליות ופארמקולוגיות המכוונות לרקמת שומן.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות במיקרו-סביבה של רקמת שומן רלוונטית לבני אדם, השומרת על ECM שלם ועל מגעים בין-תאיים.
- ערך תפעולי: מספק מערכת הניתנת לשחזור לצורך תיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות בדיקות הפרשת leptin ושחרור glycerol לאורך מספר שבועות.
- ערך מדעי: תומך בסריקה פנוטיפית של תרכובות המשפיעות על חיוניות אדיפוציטים, הצטברות ליפידים ותפקוד אנדוקריני בהקשר של רקמה יציבה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר מדדים כמותיים ברמת הרקמה, כגון צביעת Oil Red O וויזואליזציה של אדיפוציטים באמצעות Nile red, לצורך הערכת התגובה לתרכובות.
- ערך תפעולי: מספק תרביות סטנדרטיות וניתנות להרחבה עם מדדי חיות עקביים המאפשרים תהליכי סינון בעלי תוכן גבוה (high-content screening).
- ערך מדעי: מאפשר ניתוח של תגובה למנה ומסלול זמן של תרופות מועמדות על תפקוד רקמת שומן שלמה ללא ארטיפקטים של דה-דיפרנציאציה.
מחקר תרגומי וטרום-קליני
- ערך מדעי: שומר על הפרופיל התעתוקי של רקמת שומן אנושית ועל התאוששות לאחר קסנוטרנספלנטציה, ובכך תומך בהלימה של ביומרקרים תרגומיים ובמידול רלוונטי למחלה.
- ערך תפעולי: מאפשר הערכה אורכית של השפעות תרכובות משלבי הגילוי המוקדמים ועד לשלבים הפרה-קליניים תוך שימוש באותה פלטפורמת רקמה.
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית על ידי שימור האינטראקציה (crosstalk) הטבעית בין האדיפוציטים לספרומה, שהיא קריטית לניתוח מסלולים מטבוליים.
שילוב תהליכי עבודה ופייפליין
שיטת ה-SWAT משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לאופטימיזציה של תרכובות מובילות, על ידי אספקת מערכת רקמת שומן יציבה ורלוונטית לבני אדם לבדיקה איטרטיבית של תרכובות ולבירור מנגנוני פעולה.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות של מסלולים ספציפיים לרקמת שומן באמצעות שמירה על שלמות הרקמה ומדדים תפקודיים לאורך תקופת תרבית ממושכת.
- סריקה: מאפשר מוכנות לבדיקות עם חיוניות תאי אדיפוציטים ומדדי אגירת ליפידים ניתנים לשחזור, הניתנים לזיהוי באמצעות צביעות סטנדרטיות ובדיקות הפרשה.
- אנליטיקה: מספק פלטים כמותיים הכוללים ביטוי גנים, לוקליזציה של חלבונים, בדיקת ELISA ללפטין ושחרור גליצרול לצורך ניתוח השוואתי של תנאים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ממצאי הגילוי לרציפות פרה-קלינית באמצעות שימור סממנים של אדיפוציטים אנושיים ויכולת לשיתול זנוגרפטי.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר לבדיקות איטרטיביות של תרכובות, מטרות ונקודות זמן מרובות ללא צורך בבידוד חוזר של הרקמה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי באמצעות שימור של מיקרו-מבנה רקמת שומן טבעי ויציבות תפקודית לטווח ארוך.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה ויכולת שחזור באמצעות פרוטוקול מוגדר לזריעת תאי סטרומה ושכובת רקמה (sandwiching).
- ערך אסטרטגי: שיפור בקבלת החלטות לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) על ידי הפחתת נשירה בשלבים מאוחרים כתוצאה מהשפעות בלתי צפויות של רקמת השומן.
- השפעה על תיק הפיתוח (Portfolio): תיעדוף תרכובות מותאם סיכון המבוסס על מעורבות מאומתת של רקמת השומן ופרופילי בטיחות מטבוליים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול ברקמת שומן אנושית ראשונית ובתרבית של תאי סטרומה של רקמת שומן.
- תלוי בלוחיות מצופות PNIPAAm, במערכת ליציקת ג'לטין ובסבב עבודה של הדיסוציאציה תחת בקרת טמפרטורה.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של נהלי קיצוץ הרקמה, הזריעה והחלפת המצע להשגת תוצאות עקביות.
- כולל שיקולי התאמה עבור מאגרי שומן שונים ושונות בין תורמים ביכולת התמיכה של תאי הסטרומה.
- מוגבל על ידי הדרישה לרקמה אנושית טרייה וטיפול בחומר ראשוני תחת רמת בטיחות ביולוגית.
![הדמיה וכימות של רקמות שומן חום ובז' בעכברים באמצעות [18F]FDG מיקרו-PET/MR הדמיה](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F62460.jpg%3Fv%3D2026-08-11T08%253A27%253A22.161Z&w=384&q=75)
