Name: חיים תא הדמיה של TGF-β/Smad3 איתות לשביל במבחנה , In Vivo באמצעות מערכת הכתב אדנו (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: למדו הדמיה תאית חיה של מסלול האיתות TGF-β/Smad3 באמצעות מערכת דיווח אדנו-ויראלית. שיטה זו מאפשרת מעקב בזמן אמת בתאי סרטן שד ובמודלים חיים, ותורמת לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים הלאומי לבריאות, המועצה למחקר רפואי (NHMRC) H-JZ. TMBW הוא הנמען של פרס לתארים מתקדמים אוסטרליה מן הממשלה האוסטרלית ו אן הנדרסון הטען את המלגה הבריאות רוטרי אוסטרלי בשותף עם סיבובי של Templestowe, דיין לריפוי.

ניסויים בבעלי חיים כל אושרו על ידי אוניברסיטת מלבורן חיה ועדת האתיקה.
הערה: פרוטוקול רצף, בנייה, דור עבור adenoviral המומנט pCMV-Td-עד תום, pAd-CMV-GFP ו p-לוק12לספירה-CAGA/Td-טום כבר שתואר לעיל11,12, 13. כל כיווני זמינים מסחרית.
1. וירוס כייל נוגדנים נחישות שימוש במינון 50%-ראגנטים זיהומיות (TCID50)
<ol><li>להכין 1 x 106 תאים HEK293A 10 מ"ל של DMEM + 10% FBS מדיה.</li>
	<li>זרע µL 100 של השעיה תא לתוך כל טוב של צלחת תרבות תא 96-ובכן שטוח התחתונה.</li>
	<li>להכין 1 מ"ל של בטחונות לדילול המניות וירוס שלם בינוני. להוסיף µL 11 של וירוס מדולל כל טוב של עמודה 1.</li>
	<li>ביצוע דילולים 10-fold טורי ישירות בצלחת טוב 96 על-ידי ערבוב µL 11 של וירוס מדולל עם 100 µL תא השעיה עד לדילול הסופי של 1 x1012 מתמלאת. למרות תאים שאינם מחסידי בשלב זה, מספר התאים מועברים בין בארות נשאר קבוע.</li>
	<li>פיפטה 11 µL של כל דילול לתוך כל עמודה החל הדילול הגבוהה של 104. להחליף טיפים פיפטה כל דילול להגבלת צולבות על נגיפים.</li>
	<li>הוסף µL 11 של מדיה מווירוסים מלאה כדי עמודה 12 כפקד שלילי.</li>
	<li>תקופת דגירה צלחת של 7-10 ימים ב 37 ° C עם 10% CO2.</li>
	<li>באמצעות מיקרוסקופ, ציון מספר בארות בכל עמודה מציג סימנים של אפקטים cytopathic או ציטוטוקסיות. שקול חיובי טוב אם יש סימן לזיהום קיים.</li>
	<li>לחשב את השבר של בארות חיובי עבור כל דילול באמצעות את ריד, Muench השיטה הסטטיסטית (1938)14.</li>
	<li>לחשב את המרחק פרופורציונלית (PD) באמצעות: (A-50)/(A-B), כאשר A הוא אחוז התגובה לעיל או שווה ל- 50% ו- B הוא התגובה אחוז מתחת ל 50%.</li>
	<li>לחשב באמצעות TCID50 : 10X-PD, כאשר X הוא הדילול נותן מענה גדול מ-50%.</li>
	<li>לחשב כייל ויראלי מלהשתמש הבאות: (0.011 x TCID50) PFU/mL</li>
</ol>2. אדנו MOI נחישות
<ol><li>זרע 1.0-1.5 x 10 תאים5 מד א-MB-231 עם 500 μL DMEM תרבות המדיה המכילה 5% FBS ב כל טוב של 12 טוב צלחת (35% תא confluency, וולס 6 סה כ).</li>
	<li>לחשב את נפחי Ad-CMV-Td-טום המניות הדרושות 0, 250, 500, 2500, 5000 MOI באמצעות בעקבות הנוסחה: MOI = (נפח [μL] x PFU/μL) / מספר של תאים. Ad-CMV-Td-טום עם כייל עונה 1 פרק 1010 (PFU/mL), אמצעי האחסון להידבקות בווירוס MOIs הנדרשים הם 0, 3.75, 7.5, 37.5 ו- 75 μL בהתאמה.</li>
	<li>להדביק את התאים עם נפחי Ad-CMV-Td-טום סעיף 2.2 מחושב על ידי ישירות pipetting מניות ויראלי לתוך הבארות עם ערבוב יסודי.</li>
	<li>מקם את הצלחת בחממה ב 37 ° C עם 10% CO2 במשך 24 שעות ביממה.</li>
	<li>מסיר את המדיה מן הבארות, לתקן מיד את התאים עם 500 μL של 10% פורמלין במשך 5 דקות.</li>
	<li>האחות של פורמלין מבארות ולשטוף וולס עם μL 500 ל- PBS פעם אחת.</li>
	<li>כתם גרעין התא עם 500 μL של פתרון Hoechst במשך 5 דקות.</li>
	<li>הסר את הפתרון Hoechst ולשטוף הבארות עם 500 μL PBS 3 פעמים.</li>
	<li>התמונה החלבון Td-עגבניה, גרעין התא אות באמצעות 200 X הגדלה על מיקרוסקופ זריחה. לרגש חלבון Td-עגבניות-554 nm ו לצבוע Hoechst-352 ננומטר.</li>
	<li>ניתוח תמונות באמצעות ImageJ כדי לקבוע את העבודה ש-MOI הדרושים עבור 100% זיהום של עגבניות Td-15.</li>
</ol>3. התמרה חושית כפול-אדנו בתאים יחיד בשידור חי
<ol><li>זרע 1.0-1.5 x 10 תאים5 מד א-MB-231 עם 500 μL DMEM תרבות המדיה המכילה 5% FBS ב כל טוב של 12 טוב צלחת (35% תא confluency, וולס 2 סה כ).</li>
	<li>להדביק תאים עם 75 μL של Ad-CMV-GFP (כייל נוגדנים = 5 x 109 PFU/mL) ו- 7.5 μL של Ad-CAGA12-Td-טום (כייל נוגדנים = 5 x 1010 PFU/mL) כדי להשיג 2,500 למשרד הפנים, אשר ניתן להשיג 100% זיהום חיוביות.</li>
	<li>יטפל בתאים עם או בלי μL 0.25 של TGF-β לכל טוב (10 mg/mL במלאי, 5 ng/μL כמו הריכוז הסופי) מיד לאחר אדנו זיהום.</li>
	<li>מקם את הצלחת בחממה ב 37 ° C עם 10% CO2 במשך 24 שעות ביממה.</li>
	<li>התמונה תאים חיים עם שלב ניגודיות פלורסצנטיות מיקרוסקופ. לרגש GFP-470 nm וחלבון Td-עגבניות-554 ננומטר.</li>
	<li>לתקן תאים, כתם גרעין התא כפי שמתואר צעדים 1.6 - 1.9.</li>
	<li>התמונה החלבון Td-עגבניות ואת Hoechst כתם באמצעות מיקרוסקופ זריחה. לרגש את צבען Hoechst-352 ננומטר.</li>
	<li>שימוש ImageJ, לחשב שאחוז חיובי GFP ו- Td-עגבניות תאים15.</li>
</ol>4. איתות התא יחידה בשידור חי, ריפוי פצעים Assay
<ol><li>זרע 4-5 x 10 תאים5 מד א-MB-231 1 מ ל DMEM תרבות המדיה המכילה 5% FBS ב כל טוב של 6 טוב צלחת (50% תא confluency, וולס 2 סה כ).</li>
	<li>להדביק את התאים עם 22.5 μL של Ad-CAGA12-Td-טום (כייל נוגדנים = 5 x 1010 PFU/mL, MOI = 2,500).</li>
	<li>מקם את הצלחת בחממה ב 37 ° C עם 10% CO2 במשך 24 שעות ביממה.</li>
	<li>לגרד שני קווים מצטלבים על השכבה תא של מכל קידוח באמצעות טיפ פיפטה P200.</li>
	<li>מסיר את המדיה הישנה מבארות והחלף 2 מ"ל של טרי 5% FBS מדיה עם או בלי μL 0.5 של TGF-β לכל טוב (10 mg/mL במלאי, 5 ng/μL כמו ריכוז סופי).</li>
	<li>מקם את הצלחת בחממה ב 37 ° C עם 10% CO2 במשך 5 דקות, תמונות של אזורים שנבחרו הפצע באמצעות 100 X הגדלה במיקרוסקופ ניגוד שלב.</li>
	<li>מקם את הצלחת בחממה ב 37 ° C עם 10% CO2 במשך 24 שעות ביממה.</li>
	<li>קח תמונות של סגירת הפצע על האזורים כמו בעבר.</li>
	<li>לתקן את התאים, כתם גרעין התא, כפי שמתואר צעדים 1.6 - 1.9 והמחש Td-עגבניות אות אזור הפצע ואזור ללא פציעה באמצעות 200 X הגדלה על מיקרוסקופ זריחה.</li>
	<li>לכמת את אחוז תאים חיוביים Td-עגבניות הפצע ואזור ללא פציעה באמצעות תוכנת ImageJ15.</li>
</ol>5. במבחנה לוציפראז Assay
<ol><li>להכין השעיה תא של 3-5 x 10 תאים4 מד א-MB-231 1 מ"ל של המדיה DMEM המכילה 5% FBS.</li>
	<li>להדביק תאים הבולם עם 2.5 μL של Ad-CAGA12- לוק (כייל נוגדנים = 5 x 1010 PFU/mL, MOI = 2,500).</li>
	<li>זרע התאים הנגועים 96. ובכן צלחת-µL תאים/100 3000/טוב....</li>
	<li>מקם את הצלחת בחממה ב 37 ° C עם 10% CO2 במשך 24 שעות ביממה.</li>
	<li>להסיר את המדיה הישנה מבארות ולהחליף עם 100 µL של 5% טרי FBS מדיה עם או בלי μL 0.1 של TGF-β לכל טוב (1 mg/mL במלאי, 1 ng/μL כמו הריכוז הסופי), נוכחות או היעדרות של 0.17 μL של TGF-β מעכב לכל טוב (7 mg/mL במלאי 12 ng/μL כמו ריכוז סופי) (לא פורסם הרומן TGF-β ליגנד מלכודת חלבון, צ'ן. et al., עבודה).</li>
	<li>מקם את הצלחת בחממה ב 37 ° C עם 10% CO2 במשך 24 שעות ביממה.</li>
	<li>להפשיר את המצע מערכת assay לוציפראז והכן 1 x תא תרבות פירוק ריאגנט במים מזוקקים כפול (DDW).</li>
	<li>להסיר מדיה מן הבארות 96 ואת lyse וולס עם μL 50 1 x תא תרבות פירוק מאגר על קרח באמצעות של תפקודי לב / נשימה עם עצבנות עדין למשך 30 דקות.</li>
	<li>להעביר 30 μL של lysate מכל קידוח לתוך צלחת לוציפראז אטום ולאפשר את הצלחת לחמם לטמפרטורת החדר.</li>
	<li>על תוכנת luminometer, ליצור פרוטוקול חדש. בחרו ' מזרק 1 עם מדידות לפני ואחרי הזרקת. לקבוע מידות לפני הזרקת-1 s עבור אינטגרציה בזמןוהן עיכוב במדידה . עבור לאחר הזרקת המדידה, מוגדר נפח הזרקה µL 40 לעיכוב מדידה של 1 s לאחר הזרקת ו- 5 s זמן אינטגרציה. לאשר את ההגדרות על-ידי בחירת אישור.</li>
	<li>למקם את צינור מזרק DDW ולחץ על לחצן מזרק 1 תחת ההגדרות ראש הממשלה כדי לנקות את הצינור מזרק לפני השימוש. הבא להסיר את הצינור מזרק DDW והמקום באוויר ואחריו עוד שני מספרים ראשוניים של מזרק 1 ריקון כל פתרון באמצעות הרכבת התחתית. מקם את הצינור מזרק לתוך המצע גחלילית, שוב ראש הממשלה פעמיים כדי להכין את המצע.</li>
	<li>למקם את הצלחת לוציפראז אטום עם הדוגמיות luminometer ולבחור אפשרויות על התוכנה. לסמן את הבארות עניין ' ולחץ על ' החל'. הקש התחל למדוד לוציפראז אות.</li>
	<li>לאחר מדידות מלאה, להסיר ולשטוף את הצלחת עם מים. לשחזר את כל המצע הנותרים לתוך הצינור מזרק על ידי הנחת הצינור לתוך אוויר ואת ראש הממשלה מזרק 1 בחזרה לתוך צינור המצע גחלילית. למקם את צינור מזרק DDW ולבצע עוד שני מספרים ראשוניים לנקות את הצינור מזרק של כל מצע הנותרים.</li>
</ol>6. תא לקראת חיים איתות דימות In Vivo
<ol><li>48 h לפני ההשתלה הגידול, זרע 2-3 x 10 תאים6 מד א-MB-231 לתוך 175 ס' ' מ2 מבחנות (10 מבחנות סה כ). התרבות התאים ב- 20 מ של המדיה DMEM המכילה 5% FBS ב 37 מעלות צלזיוס, 10% CO2.</li>
	<li>24 שעות לאחר מכן, להוסיף 300 μL של Ad-CAGA12- לוק (כייל נוגדנים = 5 x 1010 PFU/mL, MOI = 2,500) לתוך כל הבקבוק. לשמור תאים תרבות אחרת במשך 24 שעות ביממה.</li>
	<li>ביום של ההשתלה, מסיר את המדיה הישנה ולשטוף את התאים אדנו נגוע פעם אחת עם 20 מ של PBS, pH 7.4. להוסיף 2 מ של 0.05% טריפסין-EDTA לתוך הבקבוק, לנער את הבקבוק מעט כדי לאפשר טריפסין לכסות את כל השטח את הבקבוק. הניחו את הבקבוק ב כדי החממה 37 ° C, 10% CO2 למשך 3 דקות.</li>
	<li>להרוות את טריפסין על-ידי הוספת 8 מ של DMEM המכילים FBS מדיה לתוך מבחנות. העברת כל המתלים תא לתוך בקבוק ריאגנט זכוכית.</li>
	<li>לספור את מספר הנייד באמצעות hemocytometer והעבר 4.8 x 107 תאים שני צינורות צנטריפוגה 50 מ.</li>
	<li>Centrifuge התאים ב 400 g x עבור 5 דקות ב RT כדי להסיר טריפסין resuspend בתאים 720 מ"ל של מדיה FBS-DMEM טריים.</li>
	<li>להעביר את המתלים תא לתוך צינור סטרילי 5 מ"ל ולהוסיף 160 μL Matrigel (matrigel סה כ 10% השעיה).</li>
	<li>לשמור תאים על הקרח עד ההשרשה.</li>
</ol>7. Orthotopic-השרשה
<ol><li>שוקל 12 SCID עכברים ולהקצות באופן אקראי עכברים קבוצות בקרה וטיפול (6 עכברים/קבוצה).</li>
	<li>ביצוע ההשתלה ביו-ארון סטרילי כדי לשמור על סביבה נקייה. להרדים את העכבר באמצעות איזופלוריין 2.5-4.5% שיעור זרימת החמצן של המקום L לדקה 1 העכבר על משטח חום, לוותר על טיפה של שימון העין משחה על שתי העיניים כדי למנוע נזק הקרנית. לתקן את העכבר על משטח חום במצב פרקדן בעת שמירה על הרדמה על ידי הצבת את החוטם לתוך קונוס האף מחובר לאיזופלוריין.</li>
	<li>לאשר את ההצלחה של הרדמה על ידי חוסר התגובה שאורך קמצוץ. להפחית איזופלוריין ל מנה תחזוקה של 1.5-2.5% חמצן 1 ליטר/דקה על התזכורת של השרשה.</li>
	<li>לנקות את העור מהפטמה הרביעי משני הצדדים עד האמצע באמצעות את ניקוי אוזניים? הטבלתי 80% אתנול.</li>
	<li>למצוא 4th החלב השמן משטח באמצעות מישוש וסוחטים כרית השומן לחשוף עוד יותר את הרקמה.</li>
	<li>מערבבים התליה תא היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה. בעדינות תשאף 50 µL תערובת תא לתוך מזרק אינסולין 27G, מזריקים לתוך משטח שומן החלב משני הצדדים של העכבר.</li>
	<li>לאשר זריקה מוצלחת על ידי תחושת נפיחות של כרית השומן. לשחרר את הפנקס השמן בעדינות ומניחים את העכבר בחזרה לתוך הכלוב.</li>
	<li>השאר את הכלובים על משטח חום במשך לפחות 30 דקות לאפשר העכברים לקבל הכרה ולאחר מכן מקם את הכלובים בחזרה בחדר המעצר למשך 3 ימים.</li>
</ol>8. IVIS הדמיה
<ol><li>פתח את התוכנה תמונה חיה .</li>
	<li>לאתחל את המערכת IVIS באמצעות לחיצה על הלחצן לאתחל IVIS מערכת בלוח הבקרה. המתן עד השלט החום הופך לירוק.</li>
	<li>בחר מצב הדמיה Luminescent בלוח הבקרה.</li>
	<li>הפעל הרדמה איזופלוריין קאמרית ומערכת IVIS.</li>
	<li>להרדים את העכברים באמצעות איזופלוריין 2.5-4.5% חמצן 1 ליטר/דקה. ברגע מרדימים, לקבוע איזופלוריין 1.5-2.5% לצורך תחזוקה. להזריק 150 מ"ג/ק"ג משקל גוף של D-luciferin לתוך עכברים בזריקה בקרום הבטן (i.p.).</li>
	<li>מיד להעביר עכברים לתוך המערכת IVIS, למקם אותם על הפלטפורמה הדמיה מבוקרי טמפרטורה ולמקם את האף שלהם לתוך קונוס האף.</li>
	<li>לחץ על כפתור ההתקנה רצף בלוח הבקרה ובחר Binning בינונית.</li>
	<li>להגדיר את זמן החשיפה הדמיה כדלקמן: 10 s, 20 s, 30 s, 60 s, ו- 120 ס' התחלה הדמיה כ 3 דקות אחרי הזריקה luciferin והמשך אל התמונה עד האות מתחיל לרדת (בדרך כלל זה לוקח בערך 20 דקות).</li>
	<li>להסיר את העכברים IVIS תוך שמירה על איזופלוריין באלחוש דרך קונוס האף, להתייחס העכברים עם 50 µL PBS או 50 µL TGF-β איתות מעכב (50 μg/גידול) באמצעות הזרקת אינטרה-הגידול.</li>
	<li>לשים העכברים בכלוב ולהשאיר אותן על משטח חום במשך לפחות 30 דקות. ואז למקם את הכלוב חזרה לחדר המעצר.</li>
	<li>חזור על IVIS הדמיה ההליך כמתואר לעיל ביום שלאחר הטיפול.</li>
</ol>9. ניתוח נתונים
<ol><li>פתח לשמור קבצי תמונה חיה תוכנה.</li>
	<li>למצוא המידע על התמונה באמצעות תצוגה | נתוני תמונה.</li>
	<li>בחר תמונות שצולמו בנקודת זמן דומה עם חשיפה זמנית. לטעון תמונות כקבוצה.</li>
	<li>בטל את סימון התיבה בודדים בתוך התמונה להתאים לנרמל את העוצמה.</li>
	<li>בחרו מצב הפוטון לנתח את העוצמה. לכמת את עוצמת האות על-ידי בחירת לחצן אזור של הריבית (ROI) רועי כלים.</li>
	<li>גררו את העיגול רועי האזור המכיל את האות ביולומנאסן ולחץ על לחצן אמצעי כדי לרכוש את עוצמת האות.</li>
</ol>

<ol><li>Massague, J., Like, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+receptors+for+type+beta+transforming+growth+factor.+Ligand+binding+and+affinity+labeling+in+human+and+rodent+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Cellular receptors for type beta transforming growth factor. Ligand binding and affinity labeling in human and rodent cell lines.</a> The Journal of biological chemistry. 260, 2636-2645 (1985).</li>
<li>Xu, L., Chen, Y. G., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+import+function+of+Smad2+is+masked+by+SARA+and+unmasked+by+TGFbeta-dependent+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The nuclear import function of Smad2 is masked by SARA and unmasked by TGFbeta-dependent phosphorylation.</a> Nature Cell Biology. 2, 559-562 (2000).</li>
<li>Massague, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22992590">TGFbeta signaling in context.</a> Nature reviews. Molecular cell biology. 13, 616-630 (2012).</li>
<li>Massague, J., Seoane, J., Wotton, D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16322555">Smad transcription factors.</a> Genes Development. 19, 2783-2810 (2005).</li>
<li>Blobe, G. C., Schiemann, W. P., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+transforming+growth+factor+beta+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+journal+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Role of transforming growth factor beta in human disease.</a> The New England journal of medicine. , 1350-1358 (2000).</li>
<li>Zhu, H. J., Burgess, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+transforming+growth+factor-beta+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell+biology+research+communications+%3A+MCBRC%22%5BJournal%5D)">Regulation of transforming growth factor-beta signaling.</a> Molecular cell biology research communications : MCBRC. 4, 321-330 (2001).</li>
<li>Massagué, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3512574/">TGFβ in Cancer.</a> Cell. 134, 215-230 (2008).</li>
<li>Luwor, R. B., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25744371">Single live cell TGF-beta signaling imaging: breast cancer cell motility and migration is driven by sub-populations of cells with dynamic TGF-beta-Smad3 activity.</a> Molecular cancer. 14, 50(2015).</li>
<li>Clarke, D. C., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+the+quantitative+nature+of+TGF-beta%2FSmad+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biol.ogy%22%5BJournal%5D)">Decoding the quantitative nature of TGF-beta/Smad signaling.</a> Trends in Cell Biol.ogy. 18, 430-442 (2008).</li>
<li>Zhao, R., Li, N., Xu, J., Li, W., Fang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+single-molecule+study+of+TGF-beta%2FSmad+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochimica+et+Biophysica+Sinica+%28Shanghai%29%22%5BJournal%5D)">Quantitative single-molecule study of TGF-beta/Smad signaling.</a> Acta Biochimica et Biophysica Sinica (Shanghai). 50, 51-59 (2017).</li>
<li>Luwor, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+reagents+for+improved+in+vitro+and+in+vivo+examination+of+TGF-beta+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Growth+factors%22%5BJournal%5D)">New reagents for improved in vitro and in vivo examination of TGF-beta signalling.</a> Growth factors. 29, 211-218 (2011).</li>
<li>Dennler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+binding+of+Smad3+and+Smad4+to+critical+TGF+beta-inducible+elements+in+the+promoter+of+human+plasminogen+activator+inhibitor-type+1+gene%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Direct binding of Smad3 and Smad4 to critical TGF beta-inducible elements in the promoter of human plasminogen activator inhibitor-type 1 gene.</a> EMBO J. 17, 3091-3100 (1998).</li>
<li>Luwor, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Stat3+and+Smad7+to+restore+TGF-beta+cytostatic+regulation+of+tumor+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Targeting Stat3 and Smad7 to restore TGF-beta cytostatic regulation of tumor cells in vitro and in vivo.</a> Oncogene. 32, 2433-2441 (2013).</li>
<li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/aje/article-abstract/27/3/493/99616">A Simple Method of Estimating Fifty Per Cent Endpoints.</a> American Journal of Epidemiology. 27, 493-497 (1938).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature methods. 9, 671-675 (2012).</li>
<li>Dennler, S., Prunier, C., Ferrand, N., Gauthier, J. M., Atfi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((c-Jun+inhibits+transforming+growth+factor+beta-mediated+transcription+by+repressing+Smad3+transcriptional+activity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">c-Jun inhibits transforming growth factor beta-mediated transcription by repressing Smad3 transcriptional activity.</a> The Journal of biological chemistry. 275, 28858-28865 (2000).</li>
<li>Fink, S. P., Mikkola, D., Willson, J. K., Markowitz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta-induced+nuclear+localization+of+Smad2+and+Smad3+in+Smad4+null+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">TGF-beta-induced nuclear localization of Smad2 and Smad3 in Smad4 null cancer cell lines.</a> Oncogene. 22, 1317-1323 (2003).</li>
<li>Zinn, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+bioluminescence+imaging+in+small+animals%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Noninvasive bioluminescence imaging in small animals.</a> ILAR J. 49, 103-115 (2008).</li>
<li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cell+transfection%3A+the+present+and+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397, 3173-3178 (2010).</li>
<li>Russell, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+adenovirus+and+its+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Update on adenovirus and its vectors.</a> Journal of General Virology. 81, 2573-2604 (2000).</li>
<li>Lee, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus-Mediated+Gene+Delivery%3A+Potential+Applications+for+Gene+and+Cell-Based+Therapies+in+the+New+Era+of+Personalized+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Diseases%22%5BJournal%5D)">Adenovirus-Mediated Gene Delivery: Potential Applications for Gene and Cell-Based Therapies in the New Era of Personalized Medicine.</a> Genes & Diseases. 4, 43-63 (2017).</li>
<li>Wang, I. I., Huang, I. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+technology+for+gene+manipulation+and+functional+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Adenovirus technology for gene manipulation and functional studies.</a> Drug Discovery Today. 5, 10-16 (2000).</li>
<li>Kochanek, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+adenoviral+vector%3A+Replacement+of+all+viral+coding+sequences+with+28+kb+of+DNA+independently+expressing+both+full-length+dystrophin+and+beta-galactosidase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A new adenoviral vector: Replacement of all viral coding sequences with 28 kb of DNA independently expressing both full-length dystrophin and beta-galactosidase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 5731-5736 (1996).</li>
<li>Wang, Q., Finer, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second-generation+adenovirus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Second-generation adenovirus vectors.</a> Nature Medicine. 2, 714-716 (1996).</li>
<li>Durham, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+of+replication-defective+adenoviral+recombinants+in+dissociated+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Toxicity of replication-defective adenoviral recombinants in dissociated cultures of nervous tissue.</a> Experimental Neurology. 140, 14-20 (1996).</li>
<li>MacKenzie, K. L., Hackett, N. R., Crystal, R. G., Moore, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral+vector-mediated+gene+transfer+to+primitive+human+hematopoietic+progenitor+cells%3A+assessment+of+transduction+and+toxicity+in+long-term+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Adenoviral vector-mediated gene transfer to primitive human hematopoietic progenitor cells: assessment of transduction and toxicity in long-term culture.</a> Blood. 96, 100-108 (2000).</li>
<li>Zhang, W. W., Koch, P. E., Roth, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+wild-type+contamination+in+a+recombinant+adenoviral+preparation+by+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Detection of wild-type contamination in a recombinant adenoviral preparation by PCR.</a> Biotechniques. 18, 444-447 (1995).</li>
<li>Choi, Y., Chang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+vectors+for+vaccine+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Vaccine+Research%22%5BJournal%5D)">Viral vectors for vaccine applications.</a> Clinical and Experimental Vaccine Research. 2, 97-105 (2013).</li>
<li>de Cassan, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+requirement+for+potent+adjuvants+to+enhance+the+immunogenicity+and+protective+efficacy+of+protein+vaccines+can+be+overcome+by+prior+immunization+with+a+recombinant+adenovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">The requirement for potent adjuvants to enhance the immunogenicity and protective efficacy of protein vaccines can be overcome by prior immunization with a recombinant adenovirus.</a> Journal of immunology. 187, 2602-2616 (2011).</li>
<li>Krasnykh, V. N., Mikheeva, G. V., Douglas, J. T., Curiel, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+recombinant+adenovirus+vectors+with+modified+fibers+for+altering+viral+tropism%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Generation of recombinant adenovirus vectors with modified fibers for altering viral tropism.</a> Journal of Virology. 70, 6839-6846 (1996).</li>
<li>Wickham, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+in+vitro+and+in+vivo+gene+transfer+by+adenovirus+vectors+containing+chimeric+fiber+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Increased in vitro and in vivo gene transfer by adenovirus vectors containing chimeric fiber proteins.</a> Journal of Virology. 71, 8221-8229 (1997).</li>
<li>Smith, F., Jacoby, D., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus+vectors+for+gene+delivery+to+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Restorative+neurology+and+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Virus vectors for gene delivery to the nervous system.</a> Restorative neurology and neuroscience. 8, 21-34 (1995).</li>
<li>Zhou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+receptor+NR4A1+promotes+breast+cancer+invasion+and+metastasis+by+activating+TGF-beta+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Nuclear receptor NR4A1 promotes breast cancer invasion and metastasis by activating TGF-beta signalling.</a> Nature communications. 5, 3388(2014).</li>
</ol>

המחברים מדווחים שאין ניגודי אינטרסים.

פיתחנו שיטה כדי לאפשר הדמיה בזמן אמת של TGF-β/Smad3 איתות בתאים חיים יחיד. הרומן בשיטה זו בעבר זיהינו אוכלוסיה המשנה של תאים עם דינמי TGF-β/Smad3 פעילות גנים ברמת השעתוק שהיה משויך הפלישה משופר והעברה8. שיטה זו משפרת על מבחני המסורתי של TGF-β איתות, כגון שהכלים המערבי של זרחון Smad3 ו- TGF-β ממוקד ביטוי גנים, על-ידי לכידתו של הטרוגניות של TGF-β/Smad3 איתות בתוך האוכלוסייה הגידול וסימון החשיבות של ביולוגיה של התא יחיד. בנוסף, בשיטות חלופיות לתא בודד הדמיה כגון רוברטסונית גרעיני יכול להיות זמן רב וי...

שינוי צורה של גורם גדילה β (TGF-β) הוא ציטוקין חיוני מעורבים בהתפתחות האדם כי אותות דרך heterodimeric קומפלקס המורכב מסוג II ו סוג אני קולטנים1. איגוד לסוג קולטן II תוצאות הגיוס, זרחון של סוג אני קולטן, אשר בתורו phosphorylates במורד הזרם Smad2/3 חלבונים2,3. אלה מופעלות Smad2/3 חלבונים לאגד Smad4, יוצרים קומפלקס translocates לתוך הגרעין ומסדיר שעתוק גנים4. בתנאים homeostatic TGF-β/Smad איתות בחוזקה מוסדר; עם זאת, מחלות רבות, מסלול איתות הוא deregulated, לעיתים קרובות overexpressed המוביל התקדמות של המחלה5,6,7. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי תגובת תאי TGF-β heterogenous, subpopulations של תאים פעילים TGF-β/Smad אחראים על תפקוד ביולוגי ב8,באופן תלוי-זמן9. ניתוח הסלולר הנפוצות של TGF-β/Smad איתות כרוך השימוש של מבחני קבוע נקודת הקצה לספק רק תמונה של פעילות תאית, לעיתים קרובות quantitate של אפקט ממוצע TGF-β/Smad10. שיטות אלו, עם זאת, לא במדויק ייצגו ההתנהגויות מולקולרית של TGF-β/Smad איתות במצב פיזיולוגי במהלך התקדמות המחלה. תמונה מבוססי ניתוח של תאים חיים ללכוד את הדינמיקה של הסלולר תהליכים ביולוגיים עם הבנה הן יכולות.
המטרה שלנו הייתה לפתח שיטה תפוקה גבוהה רגיש של תא חי הדמיה של TGF-β/Smad איתות באמצעות ריאגנטים המבוסס על אדנו. כאן, אנחנו נגועים הקו התא סרטן השד אנושי מד א-MB-231 עם אדנו המבטאת את רצף מחייב מוטיב Smad3 CAGA, לוציפראז (לוק) או Td-עגבניות (Td-טום) מדווח. מערכות כתב adenoviral מספקות שיטה מהירה וזולה מבוא פלסמיד שיכול לגרום שיעור זיהום 100% של שורות תאים סרטן. מערכות כתב adenoviral גם הוחלו בהצלחה על שורות תאים שקשה transfect עם פלסמיד קונבנציונאלי11. ב פרוטוקול זה נתאר תהליך לא פולשנית הדירים להשגת תא חי הדמיה של מסלול איתות TGFβ/Smad הן vivo והן בתוך חוץ גופית.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>1881024</td><td>חם ב-37 מעלות; C אמבט מים לפני השימוש</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Scientifix Life</td><td>FBS500-S</td><td>מופעל בחום לפני השימוש</td></tr><tr><td>רקומביננטי אנושי TGF ובטא; 1</td><td>PEPROTECH</td><td>100-21</td><td>Aliquot ב-DDW כדי ליצור ריכוז סופי ב-10 מ"ג/מ"ל</td></tr><tr><td>Hoechst-33258</td><td>Tocris Bioscience</td><td>5117</td><td>לדלל ל-PBS כדי להגיע לריכוז סופי ב-1 &mu; L/mL</td></tr><tr><td>Luciferase Reporter Assay Kit</td><td>Promega</td><td>197897</td><td>לדלל 5x ב-PBS לפני השימוש</td></tr><tr><td>Luminometer</td><td>Promega</td><td>9100-002</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופיה פלואורסצנטית ניגודיות פאזה</td><td>OLYMPUS</td><td>IX50</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>VivoGl Luciferin</td><td>Promega</td><td>P1041</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Lumina III In Vivo מערכת הדמיה</td><td>PerkinElmer</td><td>CLS136334</td><td></td></tr><tr><td>0.5% טריפסין-EDTA (10x)</td><td>ThermoFisher</td><td>15400-054</td><td>דילטו ל-0.05% (1x) ב-PBS</td></tr><tr><td>תרבית תאים ליזה 5x ריאגנט</td><td>Promega</td><td>E153A</td><td>מדולל ל-1x ב-DDW</td></tr><tr><td>10% פורמלין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>F5554-4L</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293A</td><td>ThermoFisher</td><td>R70507</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231</td><td>ATCC</td><td>CRM-HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>PRKDC-SCID</td><td>מרכז משאבי בעלי חיים</td><td>SCIDF6</td><td></td></tr><tr><td>מטריגל</td><td>קורנינג</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>איזופלורן</td><td>Zoetis</td><td>26675-46-7</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>Chem-supply</td><td>EA043-10L-P</td><td></td></tr><tr><td>רענון לילה</td><td>אלרגן</td><td>1750D</td><td>משחת עיניים סיכה</td></tr> <tr><td><חזק>תמיסה</חזק></td><td></td><td></td><td><חזק>הרכב</חזק></td></tr><tr><td>תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)</td><td></td><td></td><td>NaH<תת>2</תת>PO<תת>4</תת>.2H<תת>2O (4 מ"מ); NaHPO<תת>4 </תת> (16 מ"מ); NaCl (0.12M)</td></tr><tr><td>FBS-DMEM&nbsp;</td><td></td><td></td><td>5% FBS מומת בחום; 10 &mu; גרם/מ"ל פניצילין; 100 &mu; גרם/מ"ל סטרפטומיצין</td></tr></tbody></table>

חיים תא הדמיה של tgf-β/smad3 איתות לשביל במבחנה , in vivo באמצעות מערכת הכתב אדנו

Live Cell Imaging of the TGF-	&beta;/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System

שינוי צורה של גורם גדילה איתות β (TGF-β) מסדיר תפקידים חשובים רבים הדרושים עבור הסלולר הומאוסטזיס, נפוץ overexpressed במחלות רבות, כולל סרטן. TGF-β הוא בחריפות בהפרות גרורות במהלך התקדמות סרטן בשלב מאוחר, הפעלת קבוצת משנה של תאים סרטניים נודדות ופולשני. השיטות הקיימות עבור ניתוח מסלול איתות להתמקד על הקצה של דגמים, אשר לעיתים קרובות מנסים למדוד איתות פוסט-הוק של אירוע ביולוגי, ואינם משקפים את אופי המחלה מתקדמת. . הנה, נדגים מסוים מערכת הכתב הרומן אדנו עבור מסלול איתות TGF-β/Smad3 שיכול לזהות הפעלת גנים ברמת השעתוק בתאים חיים. ניצול של הכתב Ad-CAGA12-Td-טום , ניתן להשיג שיעור זיהום 100% של מד א-MB-231 תאים בתוך 24 שעות בתוך חוץ גופית. השימוש של עיתונאי פלורסנט מאפשר הדמיה של תאים בודדים בשידור חי ב בזמן אמת עם זיהוי ישיר של תאים transcriptionally פעיל. גירוי של תאים נגועים עם TGF-β מציג רק תת-ערכה של תאים transcriptionally פעיל ומעורב תפקודים ביולוגיים ספציפיים. גישה זו מאפשרת ירידה לפרטים גבוהה ורגישות ברמה תא בודד כדי לשפר את ההבנה של תפקודים ביולוגיים הקשורים TGF-β איתות במבחנה. Smad3 פעילות גנים ברמת השעתוק ניתן גם דיווח ויוו ב בזמן אמת באמצעות היישום של Ad-CAGA12- לוק כתב. לספירה-CAGA12- לוק ניתן למדוד באופן זהה כקווים תא לוציפראז stably transfected המסורתי. יכול להיות מנותח באמצעות הדמיה IVIS המקובלת ונשאר להשגחה חי במהלך התקדמות הגידול, לספק תובנה ייחודית הדינמיקה של מסלול איתות TGF-β Smad3 פעילות גנים ברמת השעתוק של תאים מושתלים ויוו . פרוטוקול שלנו מתאר מערכת משלוח כתב יתרון המאפשר הדמיה תפוקה גבוהה מהירה של תא חי מסלולי איתות גם במבחנה וגם בתוך vivo. בשיטה זו ניתן להרחיב מגוון של התמונה לפי מבחני במתנה בגישה לשחזור והרגיש יסוד ביולוגיה ופיתוח טיפולית.

חיים תא בודד דימות in vitro
כדי להעריך באופן מדויק את ההפעלה של TGF-β/Smad איתות של תאים בודדים באמצעות אדנו מבוסס ריאגנטים, חשוב לברר קודם של האופטימלית הריבוי של זיהום (MOI) עבור כל קו תא. למשרד הפנים אופטימלית נקבע 100% של תאים הן חיוביות על זיהום adenoviral ללא תופעות cytopathic או ציטוטוקסיות הנוכחי. כדי לקבוע את זה, השתמשנו כתב Ad-CMV-Td-טום צורונים פעילים כי פעלו כסמן לזיהום חיובי. אחוז תאים אדנו נגוע היה ג...

כאן, אנו מציגים עבור תא חי הדמיה של TGF-β/Smad3 פעילות איתות באמצעות מערכת הכתב אדנו פרוטוקול. המערכת עוקבת אחר פעילות גנים ברמת השעתוק בזמן אמת, ניתן להחיל שני תאים בודדים במבחנה , החימודלים.

חיים תא הדמיה של TGF-β/Smad3 איתות לשביל במבחנה , In Vivo באמצעות מערכת הכתב אדנו

Transforming Growth Factor &#946; (TGF-&#946;) signaling regulates many important functions required for cellular homeostasis and is commonly found ...

שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח בתחום האיתות התאי על ידי מעקב לא פולשני אחר איתות תאים בזמן אמת. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שמערכות אדנו-וירוס מספקות שיטה מהירה וקלה לזיהוי איתות תאים שיכולה להשיג שיעור זיהום של 100% בשורות תאים סרטניים. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על פיתוח טיפולי לסרטן וניתן להרחיב אותן למסלולי איתות אחרים.למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי מודלים של סרטן השד, ניתן ליישם אותה גם על סוגי סרטן אחרים, כגון מוח, עצמות וריאות. ביום ההדבקה באדנו-וירוס, זרעו את הבארות של צלחת של 12 בארות עם כ-1.25 כפול 10 לתאי MDA-MB-231 החמישיים ב-500 מיקרוליטר של מדיום למפגש של 35% תאים מדביקים בכל הבארות עם 75 מיקרוליטר של אדנו-וירוס-CMV-GFP ו-7.5 מיקרוליטר של אדנו-וירוס CAGA12-Td-Tomato כדי להשיג 2,500 MOI שיכול להשיג 100% חיובי לזיהום. לאחר מכן הוסף TGF-beta לטיפול מיד לאחר זיהום אדנו-וירוס.דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 10% פחמן דו חמצני למשך 24 שעות. למחרת, צלמו תאים חיים עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם ניגוד פאזה. לאחר מכן, לאחר קיבוע התאים וצביעה של הגרעינים בצבע הוכסט, דמו את חלבון TD-Tomato ואת כתם הוכסט באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.לאחר הדמיית כל הבארות, חשב את אחוז התאים החיוביים GFP ו-Td-Tomato באמצעות ImageJ. לבדיקת ריפוי הפצעים, התחל בזריעת הבארות של צלחת בת שש בארות עם כ-4.5 כפול 10 לתאי MDA-MB-231 החמישיים במיליליטר אחד של מדיום למפגש של 50% ביום ההדבקה. הדביקו את התאים ב-22.5 מיקרוליטר של עגבנייה אדנו-וירוס CAGA12-Td-Tomato, ואז הניחו את הצלחת בחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 10% פחמן דו חמצני למשך 24 שעות.לאחר 24 שעות, השתמש בקצה פיפטה P200 כדי לגרד שני קווים חוצים על שכבת התא של כל באר. הוציאו את המדיום מהבארות וטפלו ב-TGF-beta כפי שהוצג קודם לכן, ואז הניחו את הצלחת בחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 10% פחמן דו חמצני למשך חמש דקות. לאחר חמש דקות של דגירה, צלם תמונות של אזורי פצע נבחרים באמצעות הגדלה של פי 100 במיקרוסקופ ניגודיות פאזה לפני החזרת הצלחת לאינקובטור.24 שעות לאחר מכן, צלם תמונות ניגודיות פאזה של אותם אזורים כדי להעריך את סגירת הפצע. לאחר קיבוע התאים וצביעה של גרעינים, דמיין את אות Td-Tomato באזור הפצע ובאזור שאינו פצוע באמצעות הגדלה של פי 200 במיקרוסקופ פלואורסצנטי. 48 שעות לפני השתלת הגידול, זרעו כ-2.5 פעמים 10 לתאי MDA-MB-231 השישיים ל-10 צלוחיות בגודל 175 סנטימטר רבוע.לאחר 24 שעות בתרבית, הוסף 300 מיקרוליטר של אדנו-וירוס CAGA12-לוציפראז לכל בקבוק לפני החזרת התאים לחממה למשך 24 שעות נוספות. ביום ההשתלה יש להסיר את המדיה הישנה ולשטוף את התאים הנגועים באדנווירוס פעם אחת עם 20 מיליליטר PBS. הוסף שני מיליליטר של 0.05% טריפסין-EDTA לתוך הבקבוק ונער מעט את הבקבוק כדי לאפשר לטריפסין לכסות את כל שטח הבקבוק.דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות, ולאחר מכן הרוו את הטריפסין על ידי הוספת שמונה מיליליטר של מדיה DMEM המכילה FBS לתוך הצלוחיות. העבירו את כל מתלי התאים לבקבוק מגיב זכוכית. ספור את מספר התא באמצעות המוציטומטר.לאחר מכן, העבירו 4.8 פעמים 10 לשבעת התאים לצינורות צנטריפוגה של 250 מיליליטר וצנטריפוגה את התאים ב-400 פעמים גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הצנטריפוגה, השעו מחדש את התאים ב-720 מיקרוליטר של מדיום טרי והעבירו את התרחיף לצינור של חמישה מיליליטר. לאחר מכן הוסף מדיום המכיל 10% מטריג'ל כדי לדלל את תרחיף התאים לשלוש פעמים 10 לתאים השישיים לכל 50 מיקרוליטר.העבירו את תרחיף התאים לצינור סטרילי של חמישה מיליליטר והמשיכו על הקרח עד ההשתלה. שקלו 12 עכברי SCID והקצו עכברים באופן אקראי באופן שווה בין קבוצות הביקורת והטיפול. לאחר הרדמת העכבר, יש לטפטף טיפה של משחת עיניים מסככת על שתי העיניים כדי למנוע נזק לקרנית, ולאחר מכן לקבע את העכבר לכרית חום בארון ביולוגי סטרילי ולשמור על הרדמה על ידי הכנסת החוטם לתוך אף המחובר לאיזופלורן.אשר את הצלחת ההרדמה על ידי היעדר תגובה לצביטה בבוהן. הפחיתו את האיזופלורן למינון תחזוקה למשך שארית ההשתלה. לאחר מכן, השתמשו בצמר גפן טבול באתנול 80% כדי לנקות את העור מכל פטמה רביעית ועד לקו האמצע.מצא את כרית השומן הרביעית של החלב דרך מישוש וסחט את כרית השומן כדי לחשוף עוד יותר את הרקמה, ואז ערבב את תרחיף התאים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. שאפו בעדינות 50 מיקרוליטר של תערובת תאים למזרק אינסולין בגודל 27 והזריקו לתוך כרית השומן של החלב. אשר הזרקה מוצלחת ושחרר בעדינות את כרית השומן.החזר את העכבר לכלוב הביתי. לאחר שהעכברים חזרו להכרה, החזירו את הכלוב לחדר המעצר למשך שלושה ימים לפני שתמשיכו להדמיית IVIS. תאי MDA-MB-231 חיים הציגו רמות שונות של ביטוי Td-Tomato למרות זיהום של 100% כפי שמוצג על ידי ביטוי GFP, מה שמעיד על הפעלה הטרוגנית של שעתוק Smad3 תלוי TGF-beta בין התאים.ניתוח של תאים קבועים הראה שוב ביטוי של 100% GFP בעוד שרק כ-26% מהתאים הראו פעילות שעתוק ניתנת לזיהוי של TGF-beta/Smad3 24 שעות לאחר גירוי TGF-beta ללא TGF-beta בהשוואה לטיפול חיובי של 0%. בבדיקת ריפוי הפצעים, תאי MDA-MB-231 הנגועים באדנו-וירוס CAGA12-Td-Tomato הפגינו התנהגות נדידה תקינה ותאים שטופלו ב-TGF-beta הראו סגירת פצע משופרת. יש לציין כי כ-62% מהתאים באזור הפצע הציגו פעילות שעתוק Smad3 חיובית תלויה ב-TGF-beta, שהיא גבוהה משמעותית ממה שנצפה באזור הלא פצוע לאחר טיפול ב-TGF-beta.מגיב האדנווירוס CAGA12-luciferase נבדק במודל בעלי חיים להשתלה אורתוטופית של גידול שד. הן קבוצת הביקורת והן קבוצת הביקורת שטופלו במעכבי TGF-beta הראו פעילות דומה של מדווח CAGA12-luciferase לפני הטיפול. עם זאת, עבור קבוצת הביקורת, אות הלוציפראז לא השתנה לאחר הטיפול ב-PBS, בעוד שעכברים שטופלו במעכב TGF-beta הראו הפחתת אות בערך פי שלושה.לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך פחות משעה אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שלכמויות גבוהות מדי של אדנו-וירוס יכולות להיות השפעות ציטוטוקסיות וציטופתיות שעלולות להשפיע על דיוק התוצאות שלך. בעקבות הליך זה, ניתן להרחיב מערכת זו כדי לנתח מסלולי איתות מרובים בו זמנית על מנת לענות על שאלות נוספות הקשורות לדיבור צולב של איתות תאים.לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום איתות התאים הסרטניים לחקור את התנהגות התקדמות הגידול במודלים של סרטן השד.

live-cell-imaging-tgf-smad3-signaling-pathway-vitro-vivo-using-an

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

עם העניין הגובר טיפולים בתאי גזע, טכניקות הדמיה מולקולרית הם אידיאליים עבור התנהגות בתאי גזע ניטור לאחר ההשתלה. הגנים כתב בלוציפראז אפשרו פולשני, הערכה חוזרת של הישרדות התא, מיקום התפשטות in vivo. וידאו זה יהיה להדגים כיצד לעקוב אחר התפשטות hESC בעכבר חי.

במבחנה פליטת אור הדמיה vivo ג&#39;ין הכתב של בתאי גזע עובריים אנושיים

בסרטון זה אנו משתמשים adenovirus נושאת את הגן Cre recombinase להדביק fibroblasts העכבר העיקרי העוברית נושאת אלל floxed Rac1.

Adenovirus בתיווך הסרת גנטית של מולקולות איתות ב Cultured Fibroblasts עכבר ראשיים עובריים

להלן נתאר את השיטות לבנייה, לדמיין, ולכמת את התגובות של שניהם bioluminescent גחלילית ואנזימי וציפראז renilla לידי ביטוי בתאי סרטן השד גרורתי בעת הצמיחה...

במצע כפולה vivo bioluminescent ההדמיה

Assay כדי למדוד כמותית הפיכת גורם הגדילה (TGF)-β-Induced הפלישה ב 3 מימדי ג'ל קולגן מתואר. Assay זו מנצלת את הסדרה MCF10A של שורות תאים, המייצגים שלבים שונים של התפתחות סרטן השד. שיטה זו יכולה להיות מאומץ לשימוש עם שורות תאים אחרים עשוי לשמש כדי לחקור activators פוטנציאליים אחרים או מעכבי הפלישה.

Assay Spheroid למדוד TGF-β-Induced Invasion

Source: Chen, H. et. al. Live Cell Imaging of the TGF-β/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the preparation of luciferase-expressing breast cancer cells using recombinant adenoviruses for in vivo imaging.

Preparation of Reporter-Expressing Cancer Cells for In Vivo Imaging

אנו מתארים שיטה לניסויי הצלת דלדול המשמרת את שלמות התא ואת הומאוסטזיס החלבון. אדנופקציה מאפשרת ניתוחים פונקציונליים של חלבונים בתוך תהליכים ביולוגיים המסתמכים על דינמיקה מבוססת אקטין מכווננת היטב, כגון חלוקת תאים מיטוטיים ומיוגנזה, ברמת התא הבודד.

Adenofection: שיטה בחקר התפקיד של מלוויהם מולקולריים הסלולרית Morphodynamics ידי ניסויי דלדול-הצלה

מעקב חיה של אבות רשתית WT בודדים רקע גנטי מובהק מאפשר הערכה של תרומת איתות שאינו אוטונומי התא במהלך הנוירוגנזה. כאן, שילוב של מציאת גן, דור הכימרה באמצעות השתלה העובר בתחום הדמית confocal זמן לשגות vivo נוצל למטרה זו.

In vivo הדמיה של ביטוי מהונדס ג&#39;ין הפרט רשתית אבות ב Chimeric דג הזברה עוברים לחקר השפעות Cell Nonautonomous

עבור במבחנה אינדוקציה של המעבר אנדותל-mesenchymal (EndMT), אשר הוא שימושי עבור חוקרים הסלולר איתות המסלולים מעורב EndMT, פרוטוקול המתואר. במודל זה ניסיוני, EndMT הנגרמת על ידי טיפול עם TGF-β בתאי האנדותל MS-1.

אנליזה מולקולרית של אנדותל-mesenchymal מעבר המושרה על ידי הפיכת גורם גידול-β איתות

שינויים מורפולוגיים מתרחשים בתאי החיסון החיסונית התגובה בעקבות ההפעלה ולקדם שינויים בגיוס הסלולר. ניצול 2-פוטון הדמיה בשילוב עם חלבון מהונדס בצורה גנטית לפיברוסט-1 (FSP1)-יצור; tdTomato פלומפולט-stop-floxed (tb/tb) קו העכבר הירוק fluorescently מתויג ליפופוליל-fitc, אנחנו יכולים להדגים ספיגה ספציפית מאוד של ליפופוליד בפיברוהכדורים ושינויים מורפולוגיים ב vivo.

ב Vivo שני צבעים 2-פוטון הדמיה של תאי כתב שתייגת גנטית בעור

אנו מתארים זרימת עבודה שיטתית כדי לחקור איתות TGF-β ו- EMT הנגרמת על ידי β TGF על ידי לימוד ביטוי החלבון והגנים המעורבים במסלול איתות זה. השיטות כוללות סופג מערבי, בדיקת כתב לוציפראז, qPCR, וכתמי כשל חיסוני.

לימוד TGF-β איתות ו TGF-β-induced אפיתל-ל-mesenchymal מעבר בסרטן השד ותאים נורמליים

כאן, אנו מקימים פרוטוקול כדי לדמיין ולנתח בו זמנית מתחמי SMAD מרובים באמצעות בדיקת קשירת קרבה (PLA) בתאי אנדותל החשופים לתנאי לחץ גזיר נוזלים פתולוגיים ופיזיולוגיים.

הדמיה וכימות של TGFβ/BMP/SMAD איתות בתנאי לחץ שונים של גיסת נוזלים באמצעות קרבה-קשירה-אסאי

למדו הדמיה תאית חיה של מסלול האיתות TGF-β/Smad3 באמצעות מערכת דיווח אדנו-ויראלית. שיטה זו מאפשרת מעקב בזמן אמת בתאי סרטן שד ובמודלים חיים, ותורמת לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות.

חיים תא הדמיה של TGF-β/Smad3 איתות לשביל במבחנה , In Vivo באמצעות מערכת הכתב אדנו

גלה סרטונים נוספים