בידוד של רבים ברשתית ללימודי פיזיולוגיה של התא Vivo לשעבר

כתב יד זה מתאר פרוטוקול פשוטה עבור בידודו של רבים מן הרשתית עכברוש יכול לשמש אלקטרופיזיולוגיות, סידן הדמיה ואת הלחץ myography מחקרים.

הבנת האופן שבו זרימת הדם נשלטת ברשתית היא מטרה חשובה, שכן זרימת דם לא תקינה הייתה מעורבת בהתפתחות של מגוון מחלות רשתית המאיימות על הראייה, כגון רטינופתיה סוכרתית, גלאוקומה וחסימות ורידים מסועפים. עורקי הרשתית ממלאים תפקיד מפתח בוויסות זרימת הדם ברשתית על ידי הרחבה וכיווץ קוטר הלומינלי שלהם, בתיווך שינויים בהתכווצות תאי השריר החלק המקיפים את כלי הדם הללו. הבנת המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס ויסות זלוף הרשתית מחייבת אפוא תכשירים שבהם ניתן לגשת ולחקור תאי שריר חלק עורקי רשתית בתנאים קרובים ככל האפשר לפיזיולוגיים.

בסרטון זה, אנו מדגימים פרוטוקול פשוט לבידוד עורקים מרשתית החולדה שניתן להשתמש בו במחקרי מהדק טלאי, הדמיית סידן ומיוגרפיה בלחץ. במהלך השנים האחרונות, תכשיר זה שימש כדי לספק תובנות נוספות לגבי ויסות התכווצות השרירים החלקים בכלי הדם וזרימת הדם ברשתית הן בבריאות והן בחולי. הרכיבו תמיסה של ליטר אחד של סידן דל המכיל Hanks'or LCH, כפי שמוצג בטבלת החומרים.

הרכיבו את ציוד הבידוד לפני איסוף הרקמות. יש ללטש את פיפטת הזכוכית של פסטר כדי להחליק, אך לא לצמצם את הקצה. חתוך פיפטה מפלסטיק לצמצם של כחמישה עד שבעה מילימטרים.

הנח את העיניים על צלחת החיתוך, שקועה בתמיסת LCH. השתמש בסט אחד של מלקחיים כדי לעגן את העין לצלחת על ידי החזקת חיבורי שריר המסלול או עצב הראייה. ודא שנקודת העיגון קרובה ככל האפשר לסקלרה כדי לייצב את העין.

בעזרת הלהב חותכים את הקרנית לאורך האורה, ומסירים את העדשה על ידי לחיצה עדינה על הסקלרה בעזרת מלקחיים. האזור הקטן והמעגלי שאנו רואים בחלק האחורי של העין בתמונה זו הוא עצב הראייה. בעזרת הלהב, חותכים את העין לשניים באופן סימטרי דרך הדיסק האופטי.

בעזרת מלקחיים סגורים, הברישו בעדינות את הרשתית משני חצאי העין, והקפידו להסיר את כל החיבורים שנותרו בדיסק האופטי. חזרו על התהליך עם העין השנייה, והעבירו את הרשתית המנותחת לתוך המבחנה באמצעות פיפטת הפלסטיק וטיפה קטנה של מדיום LCH. בעזרת פיפטת הפלסטיק, מלאו את המבחנה ב-LCH עד כחמישה מיליליטר, ואפשרו לרשתית להתיישב בתחתית הצינור.

שטפו את הרקמה כשלוש פעמים על ידי הוצאת כארבעה מיליליטר תמיסה מהצינור והוספת LCH טרי באמצעות פיפטת הפלסטיק. במידת הצורך יש להסיר רקמות זרות. שטפו את החלק הפנימי של פיפטת הזכוכית של פסטר עם קצה מלוטש עם LCH כדי למנוע מהרקמה להידבק לפיפטה.

בעזרת אותה פיפטה, הסר כארבעה מיליליטר תמיסה מהמבחנה, והוסף כשני מיליליטר LCH טרי. נתקו בעדינות את הרשתית על ידי משיכת הרקמה דרך קצה פיפטת הזכוכית באיטיות, והוציאו את התוכן לתוך המבחנה. השתדלו לא להכניס בועות בשלב זה, וחזרו על התהליך עד לפירוק הרשתית לגודל של כשניים עד שלושה מילימטרים בריבוע.

שטפו את החלק הפנימי של הפיפטה עם כשני מיליליטר LCH, והוציאו אותו לתוך המבחנה. תנו לתכולה להתייצב לתחתית במשך חמש עד 10 דקות. חזור על תהליך הטריטורציה כפי שתואר קודם לכן עם קצת יותר כוח עד שחתיכות הרקמה יהיו בגודל של כמילימטר אחד בריבוע.

הניחו לרקמה להתייצב, וחזרו על הפעולה פעם נוספת בכוח רב עוד יותר עד שהתוכן הומוגני לחלוטין ולא נותרו חתיכות רשתית. התמיסה בשלב זה צריכה להיראות חלבית במראה. טכניקה זו תניב עד שמונה מקטעי עורקים לכל בידוד, באורך של 200 עד 2,500 מיקרומטר.

קנולציה של קצה אחד של העורק עם חסימה של הקצה הנגדי מאפשרת מדידה של התכווצות כלי דם הנגרמת על ידי לחץ, הידועה גם בשם התגובה המיוגנית. מיוגרפיה של לחץ עורקי מתבצעת באופן הבא. אליקוט של הומוגנט רשתית מועבר לתא הקלטה פיזיולוגי המותקן על במת מיקרוסקופ הפוך.

השאירו את ההומוגנאט להתיישב בתחתית החדר למשך חמש דקות לפחות. סריקה ויזואלית על פני תא ההקלטה כדי לזהות עורקים שאורכם עולה על 200 מיקרומטר ובעלי קצה פתוח שדרכו ניתן להטיל את הכלי. עוגן בקצה אחד של הכלי באמצעות מלקחיים עדינים והחלקת חוט טונגסטן קטנה המונחת מעל הכלי.

בעזרת הקצוות החופפים של חוט הטונגסטן, תמרן את הכלי כך שירוץ אופקית על פני האמבטיה, כך שהקצה הפתוח יהיה בקו אחד עם צינורית הלחץ. מחדירים את החדר באפס סידן Hanks'at 37 מעלות צלזיוס. קנולציות מבוצעות עם פיפטות זכוכית.

הצינורית ממוקמת בקצה הפתוח של הכלי באמצעות מיקרומניפולטור עדין. הקצה ממוקם מיד בסמוך לפתח, כפי שמוערך על ידי התאמת מישור המיקוד במיקרוסקופ, כך שגם קצה הכלי וגם קצה הצינורית נמצאים בפוקוס בו זמנית וצינורית הלחץ מתקדמת לתוך פתח הכלי. נדרשת פיפטה עוזרת כדי לסייע בתהליך הקנולציה ומשמשת לריסון עדין של העורק ולהנחיית דופן העורקים מעל צינורית הלחץ במקביל לקידום הצינורית לתוך לומן הכלי.

הליך זה דורש תנועה סימולטנית ומבוקרת של שני המניפולטורים ותרגול נרחב כדי להשיג אחוזי הצלחה גבוהים. לאחר דקה אחת של רישום באפס מילימטרים של כספית, הלחץ התוך-לומינלי מוגבר ל-40 מילימטרים של כספית, וכלי הדם אמור להתרחב במהירות, מה שמאשר קנולציה מוצלחת. התכווצות כלי דם הנגרמת על ידי לחץ, כלומר התגובה המיוגנית, תתפתח לאחר מכן במשך תקופה של כ-15 דקות.

הקלטת מהדק תיקון מתאי שריר חלק בכלי הדם ברשתית מאפשרת לחקור את הזרמים היוניים של קרום הפלזמה המווסתים את הסידן התוך תאי ומכאן את ההתכווצות התאית. הקלטה של תא שלם וערוץ יחיד אפשרית מתאי שריר חלק בודדים שעדיין מוטבעים בעורקי האב שלהם כדלקמן. עורקי הרשתית מבודדים ומעוגנים בתא ההקלטה עם החלקות חוטי טונגסטן.

יש לעכל את הלמינה הבסיסית כדי לאפשר יצירת אטימה בעלת התנגדות גבוהה בין פיפטת המדבקה לקרום תאי השריר החלק העורקי. העורקים מאוחים על ידי סדרה רציפה של תמיסות אנזימים ב-37 מעלות צלזיוס, מה שמביא גם לניתוק חשמלי של תאים סמוכים, כפי שמצוין על ידי החצים בתמונה. רמת העיכול מוערכת בתחילה על הפרדה חזותית של שכבות האנדותל והשרירים החלקים במהלך שלב הקולגנאז.

הסרה של כל הגדילים שנותרו של למינה בסיסית ו/או נוירופיל היקפי מושגת על ידי טאטוא זהיר של הקצוות הסגורים של מלקחיים עדינים לאורך פני הכלי. עבור הידוק טלאי, קצה פיפטת התיקון ממוקם אנכית מעל התא המעניין ומוריד בהדרגה באמצעות התנועה העדינה והאיטית של המיקרומניפולטור כדי ליצור מגע עם קרום השריר החלק העורקי. זה נשפט על ידי תנועת התא ושינוי בהתנגדות הפיפטה, הנמדד באמצעות פרוטוקול בדיקת איטום תאים בתוכנת הרכישה.

כאשר הפיפטה מורידה לתא, התנגדות האיטום תגדל בערך פי חמישה. לחץ שלילי מופעל באופן חולף על גב הפיפטה, ונוצר בהדרגה ג'יגה-סיל. זה דורש הפעלה חוזרת ונשנית של לחץ שלילי במשך דקה עד חמש דקות.

להקלטה של תא שלם, נעשה שימוש בעיקר בשיטת מהדק התיקון המחורר. נוצר ג'יגה-סיל, כפי שתואר קודם לכן, עם פיפטה המכילה תמיסה תוך-תאית ואמפוטריצין B.התנגדות הגישה מנוטרת באמצעות פרוטוקול בדיקת הממברנה בתוכנת הרכישה. ברגע שהתנגדות הגישה יורדת לפחות מ-15 מגה-אוהם, מתבצע קיזוז התנגדות סדרתית.

בדרך כלל ניתן לפצות על התנגדות הסדרה בכ-75% במצב תיקון מחורר. לאחר מכן ניתן להשתמש בשלבי מתח או פרוטוקולי רמפה למדידת זרמי תא שלם. לאחר דיסוציאציה של הרשתית, ניתן לזהות עורקים ראשוניים, משניים וקדם-נימיים על סמך קליברם וסידור תאי השריר החלק בכלי הדם.

העורקים מסדר ראשון ושני נראים דומים מבחינה ויזואלית במיקרוסקופ שדה בהיר, אך ניתן להבחין ביניהם על בסיס גודלם. העורקים הקדם-נימיים הם כלי העורקים הקטנים ביותר בתכשיר וניתן לזהות אותם בקלות בשל הסידור לסירוגין של תאי שריר חלק בכלי הדם. ניתן להבדיל בבירור בין העורקים המבודדים לבין נימים וורידים בתוך הבידוד.

נימים נראים כרשת של כלי דם בקליבר קטן בקוטר של כארבעה עד 10 מיקרומטרים, בעוד שהונולות הן בעלות דופן דקה וחסרות כיסוי של תאי שריר חלק. עורקים ראשוניים, משניים וקדם-נימיים מתאימים למחקרי מיוגרפיה בלחץ, הדמיית סידן ומחקרי מהדק טלאי. באמצעות עורקים בלחץ, חקרנו את המנגנונים המולקולריים המעורבים ביצירת התגובה המיוגנית.

הפוטומיקרוגרפים בתמונה זו מראים עורק רשתית של חולדה בנקודות זמן שונות במהלך ניסוי מיוגרפיה בלחץ. תרשים מהלך הזמן למטה מראה את השינויים בקוטר הכלי במהלך הניסוי המלא. מיד עם הלחץ, הכלי מתרחב, ולאחר מכן נוצרת התכווצות מיוגנית פעילה שמגיעה למצב יציב לאחר 15 דקות.

תוספת של וורטמנין בתמיסת אפס סידן של הנקס בסוף הניסוי מרחיבה את הכלי לקוטר הפסיבי שלו למטרות נורמליזציה. שקופית זו מציגה דוגמה לרישום מהדק תיקון חד-ערוצי, מתא שריר חלק בעורקי הרשתית לפני ואחרי מתיחת הממברנה. מדבקה זו על התא מכילה שתי תעלות TRPV2 המופעלות על ידי מתיחה, שפעילותן גוברת עם הפעלת לחץ שלילי על פיפטת התיקון.

הפרוטוקולים המתוארים כאן דורשים תרגול, אך יש להשיג אותם עם פתרון בעיות מינימלי. אנו ממליצים להשתמש בעורקים המבודדים באותו יום של הבידוד. השיטה מותאמת לעורקי רשתית של חולדות, אך ניתן להשתמש בה על רשתית עכברים.

כעת השתמשנו בתכשיר זה באופן נרחב, אך במידת האפשר אנו מנסים גם לאמת את הממצאים העיקריים שלנו באמצעות תושבות רשתית שלמות ex vivo ומדידות in vivo של קוטר כלי הדם וזרימת הדם.