חישה ביולוגית אופטית
ביו-סנסורים אופטיים משתמשים באור כדי לזהות כריכה של מולקולת מטרה. חיישנים אלה יכולים להשתמש במולקולת תווית, המייצרת אות מדיד כגון פלואורסצנטיות, או שח…
ביו-סנסורים אופטיים הם חיישנים המזהים מטרה ביולוגית או מטרות מעניינות באמצעות אור. מכשירים אלה מצאו יישומים בתחום הבריאות, תרופות, ניטור סביבתי, ביטחון המולדת, ואפילו בשדה הקרב. ביו-סנסורים אופטיים מחולקים באופן נרחב לחיישנים מבוססי תוויות וללא תוויות. דוגמה של חישה מבוססת תווית היא תגובת שרשרת פולימראז, או PCR, המשתמש בתוויות פלואורסצנטיות, או פלואורופורים, כדי לכמת את ה- DNA היעד המוגבר. דוגמה לשיטה נטולת תוויות היא תהודה של פלסמון משטח, או SPR. כאן, אינטראקציית הביו-מולולקולס ללא שינוי עם משטח החיישן מכומתת על ידי מדידת מאפיין בסיסי של החיישן, כמו זווית ההשתקפות. וידאו זה סוקר את היסודות של שני סוגים אלה של טכניקות biosensing אופטי ואת הרכיבים הקריטיים שלה, את עקרונות העבודה ואת היישומים המשותפים של biosensors אופטי.
ראשית, הבה נבחן את העקרונות הכלליים של רגישות אופטית מבוססת תווית. בדרך כלל, בדיקה או אלמנט biorecognition, כמו נוגדן חינם, מחובר על פני השטח של החיישן באמצעות כימיית immobilization מסורתית. הפתרון לדוגמה זורם לאחר מכן על פני השטח של החיישנים. מולקולת המטרה, המשלימה לאלמנט הביו-רה-מולקולציה משותק, נלכדת באופן סלקטיבי מפתרון הדגימה המורכב. ואז הפתרון מדגם עודף נשטף עם חוצץ או מים. לאחר מכן, כדי לעזור לדמיין ולכמת את כמות המטרה הכבולה, מולקולה משנית שהיא מחמיאה למטרה ומחוברת לפלורופור, זורמת דרך המערכת. לאחר זמן מה, כאשר הכריכה של המולקולה המשנית למטרה התרחשה, פלואורופור עודף לא מאוגד נשטף. לאחר מכן ניתן לכמת את עוצמת הפלואורופור הכבול באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. עוצמה זו מתווכת תחילה עבור ריכוזי יעד ידועים שונים כדי ליצור עקומת כיול, אשר לאחר מכן מאפשר מידה ישירה של כמות לא ידועה של מטרה שנתפסה. לכן, טכניקות מבוססות תווית להשתמש בעוצמת הפלואורסצנטיות של פלואורופור רגיש מאוד כדי לכמת את הריכוז של הביומולקול של עניין.
כעת, לאחר שבדקנו את העקרונות של ביו-סנסורים אופטיים מבוססי תוויות, בואו נבחן דוגמה נפוצה, התקן הנוכחי להגברת DNA, PCR כמותי או qPCR. תמהיל התגובה של qPCR כולל בדיקה מסומנת לכימות תגובה בזמן אמת. רצף הבדיקה מחובר הן לכתב פלואורסצנטי והן למולקולות קוונצ'ר, ונקשר לרצף דנ"א ספציפי. מולקולת הקוונצ'ר מרווה את פליטת הפלורופור בזמן ששניהם מחוברים לגשוש. במהלך תגובת ה- PCR, האנזים פולימראז משפיל את ה- DNA של הבדיקה ומפריד פיזית את כתב הפלורופור, ובכך מונע מרווה וכתוצאה מכך עלייה בפלואורסצנטיות. כדי לבצע qPCR, תחילה להוסיף את כל הרכיבים של התגובה, כולל בדיקות שכותרתו, לתוך צינור PCR או היטב. לאחר מכן, למקם את בארות PCR לתוך thermocycler מיוחד ולהזין את הפרמטרים עבור כל מחזור ואת מספר המחזורים. התרמו-מחזור המשמש ל- qPCR כולל מקור אור עם הרכיבים האופטיים הנדרשים לבחירת אורך גל וגלאי למדידת עוצמת הפלואורסצנטיות בזמן אמת במהלך תגובת ה- PCR. בסוף כל מחזור תרמי, עוצמת הפלואורסצנטית עקב הפלורופורים המשוחררים מתועדת ומתוכננת. עוצמת הפלואורסצנטית היא פרופורציונלית ישירות ללוגריתם של ריכוז המטרה בתגובה היטב, ולכן, עבור פלואורסצנטיות ידועה, ניתן לחשב את ריכוז היעד הלא ידוע.
הבה נבחן כעת כיצד ניתן להשיג חישה ללא כתבים, כמו פלואורופורים, תוך שימוש בטכניקות חישה אופטיות ללא תוויות. עבור טכניקות ללא תוויות, חוסר ההשתקה של אלמנט הביו-רה-קוניציה זהה לטכניקה המבוססת על תווית. כל התקשרות ביו-מולקולית לפני השטח של חיישנים אלה משנה את אינדקס השחלור בסביבה הקרובה של המכשיר האופטי. מולקולות המטרה נקשרות לפני השטח של המכשיר האופטי המתפקד ויוצרות שכבה דקה ומשנות עוד יותר את אינדקס השבירה. שינויים אלה באינדקס שבירה ניתן לפקח על ידי מעקב אחר השינוי בתדירות הטבעית של רטט, או תדירות מהדהד של המערכת. ההבדל בתדרי הדהודה לפני ואחרי כריכת המטרה, הנקראת f shift, הוא פרופורציונלי ישירות לריכוז המטרה שנתפסה.
עכשיו בואו נסתכל על העקרונות הבסיסיים של טכניקת חישה אופטית נפוצה ללא תוויות, תהודה פלסמון פני השטח, או SPR. מכשיר SPR טיפוסי משלב מקור לייזר ניתן להזזה, גלאי אופטי למדידת תזוזת עוצמת, ושבב חיישן עם מנסרת זכוכית מצופה בצד אחד בזהב. הפריזמה המכוסה בזהב משולבת עם מערכת נוזלית המאפשרת פעולת זרימה. בניסוי, מולקולת הגשושית, או אלמנט הביו-כרה, מחוברת לפני הזהב. אלמנט המטרה זורם על פני השטח ונקשר לגשוש משותק. החישה מנצלת את תופעת ה- SPR. זה קורה כאשר אור מקוטב מוצג על פני השטח של מתכת, כמו זהב, בזווית מסוימת, תטא SPR. התוצאה היא יצירת פלסמונים פני השטח שהם תנודות אלקטרונים קוהרנטיות הקיימות בממשק של שני חומרים המאפשרים סימנים מנוגדים. כאשר המסה המחוברת לפני השטח של החיישן משתנה, מצב התהודה של פלסמונים פני השטח משתנה. כתוצאה מכך, כאשר רק אלמנט הביו-כרה קשור על פני השטח, הקרן משתקפת בזווית אחת, תטא אחת. לאחר מכן, כאשר מסת יותר מחוברת לפני השטח, כמו המטרה שנתפסה, הפחתת עוצמת האור המוחזר בזווית הספציפית, תטא SPR נצפתה, כאשר זווית ההשתקפות משתנה לתטא 2. השינוי בעוצמת האור המוחזר בזווית התהודה, תטא SPR, הוא פונקציה של זווית האור המוחזר, וניתן למדוד אותו כהבדל בזוויות, תטא 1 ותטא 2.
כעת, לאחר שכיסינו את העקרונות והפרוצדורות שמאחורי ביו-סנסורים אופטיים, בואו נראה כיצד חוקרים מיישמים את הטכניקות הללו כיום. cytometer תא הזרימה היא מערכת biosensing אופטי המשמשת בדרך כלל לספירת תאים ומדידת מגוון רחב של תכונות ורכיבים תאיים אחרים. מדגם המורכב מסוגי תאים מרובים, כל אחד מתויג עם פלואורופור ייחודי, מוכן במתלה. לאחר מכן, המדגם הוא לרוץ דרך cytometer הזרימה כך התאים לרוץ על פני קרן לייזר אחד בכל פעם. כאשר כל תא עובר דרך קרן הלייזר, אור פלואורסצנטי מפוזר ונפלט על ידי הפלורופורים השונים מכומתים בנפרד, מה שנותן ספירה ישירה של סוגי התאים השונים במדגם. יישום נוסף של biosensors אופטי הוא זיהוי של חיידקים בדגימות. דרך אחת לעשות זאת היא באמצעות חיישני מהדהד טבעת אופטיים. הם מורכבים לולאה סגורה בשילוב קלט אור ומדריכי גל פלט. כאשר אור של אורך גל מהדהד מוחל על מדריך גל הקלט, הוא מועבר דרך הלולאה ובונה עוצמה על פני נסיעות הלוך ושוב מרובות עקב הפרעות קונסטרוקטיביות והוא פלט למדריך גל הפלט. נוגדנים ספציפיים לחלבוני פני השטח החיידקיים משותקים על פני השטח של מהדהד הטבעת ומתקבל ספקטרום ספיגה בסיסי. לאחר מכן דגימת החיידקים זורמת על פני השטח של המהדהד כדי לאפשר קשירה חיידקית לגוף משותק, ולאחר מכן מתקבל ספקטרום ספיגה שני. אם החיידק של עניין נקשר, שינוי גלוי בפסגות מהדהד הוא ציין, אשר פרופורציונלי ישירות לריכוז של חיידקי היעד.
הרגע צפית בסרטון של ג'וב על חישה אופטית. דנו בעקרונות הבסיסיים של חישה אופטית מבוססת תוויות וללא תוויות יחד עם שתי דוגמאות בולטות של שיטות אלה וכמה יישומים של הטכניקות. תודה שצפיתם.
חיישנים ביולוגיים אופטיים הם חיישנים המזהים מטרה ביולוגית או מטרות מעניינות באמצעות אור. מכשירים אלה מצאו יישומים בתחום הבריאות, התרופות, הניטור הסביבתי, ביטחון המולדת ואפילו בשדה הקרב. חיישנים ביולוגיים אופטיים מחולקים באופן כללי לחיישנים מבוססי תוויות וללא תוויות. דוגמה לחישה מבוססת תוויות היא תגובת שרשרת פולימראז, או PCR, המשתמשת בתוויות פלואורסצנטיות, או פלואורופורים, כדי לכמת את ה-DNA המוגבר של היעד. דוגמה לשיטה נטולת תוויות היא תהודה פלזמון פני השטח, או SPR. כאן, האינטראקציה של הביו-מולקולות ללא שינוי עם משטח החיישן מכומתת על ידי מדידת מאפיין בסיסי של החיישן, כמו זווית ההשתקפות. סרטון זה סוקר את היסודות של שני סוגים אלה של טכניקות ביו-חישה אופטיות ואת המרכיבים הקריטיים שלה, עקרונות העבודה והיישומים הנפוצים של ביו-חיישנים אופטיים.
ראשית, הבה נסתכל על העקרונות הכלליים של חישה ביולוגית אופטית מבוססת תוויות. בדרך כלל, בדיקה או אלמנט זיהוי ביולוגי, כמו נוגדן משלים, מחוברים על משטח החיישן באמצעות כימיה מסורתית של אימוביליזציה. לאחר מכן, תמיסת הדגימה מוזרמת על פני החיישנים. מולקולת המטרה, המשלימה את אלמנט הזיהוי הביולוגי המשותק, נלכדת באופן סלקטיבי מתמיסת הדגימה המורכבת. ואז תמיסת הדגימה העודפת נשטפת עם חיץ או מים. לאחר מכן, כדי לעזור לדמיין ולכמת את כמות המטרה הקשורה מוזרמת דרך המערכת מולקולה משנית משלימה למטרה ומחוברת לפלואורופור. לאחר זמן מה, כאשר התרחשה קשירה של המולקולה המשנית למטרה, עודף הפלואורופור הבלתי קשור נשטף. לאחר מכן ניתן לכמת את עוצמת הפלואורופור הקשור באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. עוצמה זו משורטטת תחילה עבור ריכוזי מטרה ידועים שונים כדי ליצור עקומת כיול, המאפשרת לאחר מכן מדידה ישירה של כמות לא ידועה של מטרה שנלכדה. לפיכך, טכניקות מבוססות תווית משתמשות בעוצמת הקרינה של פלואורופורים רגישים במיוחד כדי לכמת את ריכוז הביו-מולקולה המעניינת.
כעת, לאחר שסקרנו את העקרונות של חיישנים ביולוגיים אופטיים מבוססי תוויות, בואו נסתכל על דוגמה נפוצה, התקן הנוכחי להגברת DNA, PCR כמותי או qPCR. תערובת תגובת ה-qPCR כוללת בדיקה מסומנת לכימות תגובה בזמן אמת. רצף הבדיקה מחובר הן למולקולות מדווח פלואורסצנטי והן למולקולות מרווה ונקשר לרצף DNA ספציפי. מולקולת המרווה מרווה את פליטת הפלואורופור בזמן ששניהם מחוברים לבדיקה. במהלך תגובת ה-PCR, האנזים הפולימראז משפיל את ה-DNA של הגשושית ומפריד פיזית את מדווח הפלואורופור, ובכך מונע מרווה וכתוצאה מכך עלייה בקרינה. כדי לבצע qPCR, יש להוסיף תחילה את כל מרכיבי התגובה, כולל הבדיקות המסומנות בארגון, לתוך צינור PCR או באר. לאחר מכן, הנח את בארות ה-PCR לתוך תרמו-סייקלר מיוחד והזן את הפרמטרים עבור כל מחזור ומספר המחזורים. התרמו-ציקלר המשמש ל-qPCR כולל מקור אור עם הרכיבים האופטיים הנדרשים לבחירת אורך גל וגלאי למדידת עוצמת הקרינה בזמן אמת במהלך תגובת ה-PCR. בסוף כל מחזור תרמי, עוצמת הפלואורסצנט עקב הפלואורופורים המשוחררים נרשמת ומתוארת. עוצמת הפלואורסצנט עומדת ביחס ישר ללוגריתם של ריכוז המטרה בבאר התגובה, וכך, עבור פלואורסצנטיות ידועה, ניתן לחשב את ריכוז המטרה הלא ידוע.
הבה נבחן כעת כיצד ניתן להשיג חישה ללא מדווחים, כמו פלואורופורים, באמצעות טכניקות חישה אופטיות ללא תוויות. עבור טכניקות ללא תוויות, הקיבוע של אלמנט הזיהוי הביולוגי זהה לטכניקה המבוססת על תוויות. כל חיבור ביו-מולקולה לפני השטח של חיישנים אלה משנה את מדד השבירה בסביבה הקרובה של המכשיר האופטי. מולקולות המטרה נקשרות לפני השטח של המכשיר האופטי הפונקציונלי ויוצרות שכבה דקה ומשנות עוד יותר את מקדם השבירה. ניתן לעקוב אחר שינויים אלה במקדם השבירה על ידי מעקב אחר השינוי בתדר הטבעי של הרטט, או בתדר התהודה של המערכת. ההבדל בתדרי התהודה לפני ואחרי קשירת המטרה, הנקרא הסטת f, עומד ביחס ישר לריכוז המטרה שנלכדה.
עכשיו בואו נסתכל על העקרונות הבסיסיים של טכניקת חישה אופטית נפוצה ללא תוויות, תהודה פלזמון פני השטח או SPR. מכשיר SPR טיפוסי משלב מקור לייזר נע, גלאי אופטי למדידת שינוי עוצמה ושבב חיישן עם מנסרת זכוכית מצופה בצד אחד בזהב. המנסרה המצופה זהב משולבת במערכת נוזלית המאפשרת פעולת זרימה. בניסוי, מולקולת הבדיקה, או אלמנט הזיהוי הביולוגי, מחוברת למשטח הזהב. לאחר מכן אלמנט המטרה זורם על פני השטח ונקשר לבדיקה המשותקת. חישה מנצלת את תופעת ה-SPR. זה קורה כאשר אור מקוטב מוצג על פני השטח של מתכת, כמו זהב, בזווית מסוימת, תטא SPR. התוצאה היא יצירת פלזמונים על פני השטח שהם תנודות אלקטרונים קוהרנטיות הקיימות בממשק של שני חומרים בעלי היתרות של סימנים מנוגדים. כאשר המסה המחוברת למשטח החיישן משתנה, מצב התהודה של פלזמוני פני השטח משתנה. כתוצאה מכך, כאשר רק אלמנט הזיהוי הביולוגי קשור על פני השטח, הקרן משתקפת בזווית אחת, תטה אחת. לאחר מכן, כאשר יותר מסה מחוברת למשטח, כמו המטרה שנלכדה, הפחתה של עוצמת האור המוחזר בזווית הספציפית, נצפית תטה SPR, כאשר זווית ההשתקפות משתנה לתטא שתיים. השינוי בעוצמת האור המוחזר בזווית התהודה, תטא SPR, הוא אם כן פונקציה של זווית האור המוחזר, וניתן למדוד אותו כהפרש בזוויות, תטה אחת ותטא שתיים.
כעת, לאחר שכיסינו את העקרונות וההליך מאחורי חיישנים ביולוגיים אופטיים, בואו נראה כיצד חוקרים מיישמים את הטכניקות הללו כיום. ציטומטר תאי הזרימה הוא מערכת ביו-חישה אופטית המשמשת בדרך כלל לספירת תאים ולמדידת מגוון תכונות ורכיבים תאיים אחרים. דגימה המורכבת ממספר סוגי תאים, שכל אחד מהם מתויג בפלואורופור ייחודי, מוכנה בתרחיף. לאחר מכן, הדגימה מועברת דרך ציטומטר הזרימה כך שהתאים עוברים על פני קרן לייזר בזה אחר זה. כאשר כל תא עובר דרך קרן הלייזר, אור פלואורסצנטי מפוזר ונפלט על ידי הפלואורופורים השונים מכומתים בנפרד, מה שנותן ספירה ישירה של סוגי התאים השונים בדגימה. יישום נוסף של חיישנים ביולוגיים אופטיים הוא זיהוי חיידקים בדגימות. אחת הדרכים לעשות זאת היא באמצעות חיישני תהודה טבעתיים אופטיים. הם מורכבים מלולאה סגורה המחוברת למדריכי גל כניסת אור ויציאה. כאשר אור באורך גל תהודה מוחל על מוביל גל הכניסה, הוא מועבר דרך הלולאה ובונה עוצמה על פני מספר נסיעות הלוך ושוב עקב הפרעות בונות ויוצא למוביל גל הפלט. נוגדנים ספציפיים לחלבוני פני השטח של חיידקים משותקים על פני המהוד הטבעת ומתקבל ספקטרום ספיגה בסיסי. לאחר מכן דגימת החיידקים מוזרמת על משטח התהודה כדי לאפשר קשירת חיידקים לגוף המשותק, ולאחר מכן מתקבל ספקטרום ספיגה שני. אם החיידק המעניין נקשר, נצפה שינוי גלוי בפסגות התהודה, שהוא ביחס ישר לריכוז חיידקי המטרה.
זה עתה צפיתם בסרטון של JoVE על חישה ביולוגית אופטית. דנו בעקרונות הבסיסיים של חישה אופטית מבוססת תוויות ונטולת תוויות יחד עם שתי דוגמאות בולטות לשיטות אלה וכמה יישומים של הטכניקות. תודה שצפית.
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is the difference between label-based and label-free optical biosensors?
Label-based biosensors use fluorescent molecules called fluorophores attached to secondary probes to generate measurable signals, such as in quantitative PCR. Label-free biosensors detect binding by monitoring changes in optical properties like refractive index without adding reporter molecules. Both approaches immobilize biorecognition elements on sensor surfaces but differ in how they quantify target binding. Optical and electrochemical biosensors represent complementary detection strategies in modern bioanalysis.
Q2: How does quantitative PCR use fluorescence to measure DNA concentration?
In qPCR, a labeled probe contains both a fluorescent reporter and a quencher molecule that suppresses fluorescence when attached. During PCR amplification, the polymerase degrades the probe, separating the fluorophore from the quencher and releasing fluorescence. The thermocycler measures fluorescent intensity in real time at each cycle, which is directly proportional to the logarithm of target DNA concentration.
Q3: What role does the biorecognition element play in optical biosensing?
The biorecognition element, such as a complementary antibody, is immobilized on the sensor surface using chemical attachment methods. It selectively captures target molecules from complex sample solutions based on molecular specificity. This immobilized probe forms the foundation for both label-based and label-free detection methods by enabling selective binding of targets.
Q4: How does Surface Plasmon Resonance detect target binding without labels?
SPR uses polarized light directed at a gold-coated prism at a specific angle to generate surface plasmons, which are coherent electron oscillations at the metal interface. When target molecules bind to immobilized probes on the gold surface, the mass changes alter the resonance condition. This shifts the angle of reflected light, and the change in reflection intensity at the resonance angle is measured and quantified.
Q5: What is a calibration curve and why is it important in label-based biosensing?
A calibration curve is created by plotting fluorescent intensity measurements against known target concentrations. This curve establishes the relationship between fluorescence signal and target concentration. Once established, the calibration curve allows researchers to determine unknown target concentrations by measuring the fluorescent intensity of unknown samples and referencing the curve.
Q6: How does flow cytometry use optical biosensing to identify cell types?
Flow cytometry prepares cell samples with each cell type tagged with a unique fluorophore. Cells flow past a laser beam one at a time, and scattered and emitted fluorescent light from different fluorophores are separately quantified. This direct measurement provides accurate counts of various cell types in the sample based on their distinct fluorescent signatures.
Q7: How do optical ring resonators detect bacteria in samples?
Optical ring resonators consist of a closed loop coupled to input and output waveguides. Antibodies specific to bacterial surface proteins are immobilized on the resonator surface. When bacterial samples flow over the surface and bind to antibodies, the resonant peaks shift visibly. This shift is directly proportional to bacterial concentration, enabling sensitive detection and quantification.