PCR דיגיטלי עבור לכימות מחזורי מיקרו Rna חריפה אוטם שריר הלב, מחלות לב וכלי דם

שיטה זו עשויה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האבחון, כגון האם מיקרו RNA הם סמנים ביולוגיים תקפים במחלות לב וכלי דם. בהשוואה ל-PCR כמותי בזמן אמת, PCR דיגיטלי מציג איכויות טכניות מעולות לכימות מיקרו-RNA במחזור. מכיוון שהמדגם מחולק לכ-20,000 טיפות, אין צורך במדידות כפולות, ואין צורך בעקומה סטנדרטית לכימות

למרות ששיטה זו עשויה לספק תובנה לגבי כימות של מיקרו-רנ"א בחולי לב וכלי דם, היא עשויה להיות מיושמת גם על חולים ומחלות אחרות, שכן מיקרו-רנ"א אחרים הראו הבטחה כסמנים ביולוגיים בהתקדמות הסרטן, היא עשויה להיות מיושמת גם על חולים אונקולוגיים. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שהטיפות שנוצרו הן שבירות ויש לטפל בהן בזהירות. לאחר בידוד RNA מדגימות סרום, המשך בשעתוק הפוך כדי להשיג DNA משלים יציב יותר עבור dPCR.

כדי להתחיל, הפשירו את ערכת השעתוק ההפוך על קרח. לאחר מכן סובב את האנזימים והפריימרים כלפי מטה. לאחר מכן, הכינו את מיקס המאסטר כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

שלב 10 מיקרוליטר מתערובת המאסטר עם חמישה מיקרוליטרים של RNA מופק בכל באר של צלחת של 96 בארות. לאחר מכן צנטריפוגה את הצלחת ב-2,000xg ב-4 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות. המשך עם התמלול ההפוך כמפורט בפרוטוקול הטקסט.

ראשית, יש להפשיר את תערובת ה-dPCR המסחרית, פריימרים cDNA ו-PCR על קרח וצנטריפוגה מיד לפני השימוש. לאחר מכן הכן את מיקס המאסטר כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הוסף נפחי 1.33 מיקרוליטר של מוצר שעתוק הפוך לנפחים של 18.67 מיקרוליטר של תערובת המאסטר והצנטריפוגה בקצרה.

בעזרת פיפט, העבירו 20 מיקרוליטר מהדגימה לכל באר בשורה הבינונית של קלטת שמונה בארות. לאחר מכן הזרימו 70 מיקרוליטר של נפט ליצירת טיפות לבארות הנפט של הקסטה. לאחר מכן, הניחו אטם על גבי הקסטה והניחו אותו בגנרטור הטיפות.

סגור את מחולל הטיפות והמתן עד ששלושת נוריות החיווי יהיו ירוקות קבועות. בעזרת פיפט, העבירו בזהירות 40 מיקרוליטר מהדגימה שנוצרה בטיפות לבארות נפרדות של צלחת 96 בארות. לאחר מכן אטמו את הצלחת בנייר כסף dPCR בטמפרטורה של 180 מעלות צלזיוס למשך ארבע שניות.

הנח את לוחית ה-PCR האטומה במחזור ופעל לפי הוראות הרכיבה המפורטות בפרוטוקול הטקסט. הסר את הצלחת מהתרמו-סייקלר והעביר אותה לבסיס מחזיק צלחת. לאחר מכן הנח את החלק העליון של מחזיק הצלחת על לוחית ה-PCR.

לבסוף, הפעל את תוכנת ה-dPCR המסחרית. בפרוטוקול זה, נעשה שימוש ב-PCR דיגיטלי כדי לכמת מיקרו-RNA בסרום של חולים עם מחלות לב וכלי דם. דגימות נלקחו מ-16 חולים לפני, שמונה שעות אחרי ו-16 שעות לאחר התערבות מלעורית.

חולים עם אוטם שריר הלב בעליית ST הראו עלייה משמעותית ברמות miR-499 בהשוואה לחולים עם מחלת עורקים כליליים יציבה. לאחר השליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כשעה להיווצרות טיפות של 96 דגימות אם היא נעשית כהלכה. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לטפל בטיפות בזהירות.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע PCR דיגיטלי בצורה נכונה, על ידי היווצרות טיפות נכונה, רכיבה על אופניים, קריאה וניתוח.