PCR דיגיטלי עבור לכימות מחזורי מיקרו Rna חריפה אוטם שריר הלב, מחלות לב וכלי דם
3 ביולי 2018
מחזורי מיקרו Rna הראו הבטחה כמו סמנים ביולוגיים עבור infarctions אוטם אקוטי ומחלות לב וכלי דם. במחקר זה, אנו מתארים פרוטוקול miRNA החילוץ, שעתוק במהופך של PCR דיגיטלי עבור כימות מוחלטת של miRNAs בנסיוב של חולים עם מחלות לב וכלי דם.
שיטה זו עשויה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האבחון, כגון האם מיקרו RNA הם סמנים ביולוגיים תקפים במחלות לב וכלי דם. בהשוואה ל-PCR כמותי בזמן אמת, PCR דיגיטלי מציג איכויות טכניות מעולות לכימות מיקרו-RNA במחזור. מכיוון שהמדגם מחולק לכ-20,000 טיפות, אין צורך במדידות כפולות, ואין צורך בעקומה סטנדרטית לכימות
למרות ששיטה זו עשויה לספק תובנה לגבי כימות של מיקרו-רנ"א בחולי לב וכלי דם, היא עשויה להיות מיושמת גם על חולים ומחלות אחרות, שכן מיקרו-רנ"א אחרים הראו הבטחה כסמנים ביולוגיים בהתקדמות הסרטן, היא עשויה להיות מיושמת גם על חולים אונקולוגיים. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שהטיפות שנוצרו הן שבירות ויש לטפל בהן בזהירות. לאחר בידוד RNA מדגימות סרום, המשך בשעתוק הפוך כדי להשיג DNA משלים יציב יותר עבור dPCR.
כדי להתחיל, הפשירו את ערכת השעתוק ההפוך על קרח. לאחר מכן סובב את האנזימים והפריימרים כלפי מטה. לאחר מכן, הכינו את מיקס המאסטר כמתואר בפרוטוקול הטקסט.
שלב 10 מיקרוליטר מתערובת המאסטר עם חמישה מיקרוליטרים של RNA מופק בכל באר של צלחת של 96 בארות. לאחר מכן צנטריפוגה את הצלחת ב-2,000xg ב-4 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות. המשך עם התמלול ההפוך כמפורט בפרוטוקול הטקסט.
ראשית, יש להפשיר את תערובת ה-dPCR המסחרית, פריימרים cDNA ו-PCR על קרח וצנטריפוגה מיד לפני השימוש. לאחר מכן הכן את מיקס המאסטר כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הוסף נפחי 1.33 מיקרוליטר של מוצר שעתוק הפוך לנפחים של 18.67 מיקרוליטר של תערובת המאסטר והצנטריפוגה בקצרה.
בעזרת פיפט, העבירו 20 מיקרוליטר מהדגימה לכל באר בשורה הבינונית של קלטת שמונה בארות. לאחר מכן הזרימו 70 מיקרוליטר של נפט ליצירת טיפות לבארות הנפט של הקסטה. לאחר מכן, הניחו אטם על גבי הקסטה והניחו אותו בגנרטור הטיפות.
סגור את מחולל הטיפות והמתן עד ששלושת נוריות החיווי יהיו ירוקות קבועות. בעזרת פיפט, העבירו בזהירות 40 מיקרוליטר מהדגימה שנוצרה בטיפות לבארות נפרדות של צלחת 96 בארות. לאחר מכן אטמו את הצלחת בנייר כסף dPCR בטמפרטורה של 180 מעלות צלזיוס למשך ארבע שניות.
הנח את לוחית ה-PCR האטומה במחזור ופעל לפי הוראות הרכיבה המפורטות בפרוטוקול הטקסט. הסר את הצלחת מהתרמו-סייקלר והעביר אותה לבסיס מחזיק צלחת. לאחר מכן הנח את החלק העליון של מחזיק הצלחת על לוחית ה-PCR.
לבסוף, הפעל את תוכנת ה-dPCR המסחרית. בפרוטוקול זה, נעשה שימוש ב-PCR דיגיטלי כדי לכמת מיקרו-RNA בסרום של חולים עם מחלות לב וכלי דם. דגימות נלקחו מ-16 חולים לפני, שמונה שעות אחרי ו-16 שעות לאחר התערבות מלעורית.
חולים עם אוטם שריר הלב בעליית ST הראו עלייה משמעותית ברמות miR-499 בהשוואה לחולים עם מחלת עורקים כליליים יציבה. לאחר השליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כשעה להיווצרות טיפות של 96 דגימות אם היא נעשית כהלכה. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לטפל בטיפות בזהירות.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע PCR דיגיטלי בצורה נכונה, על ידי היווצרות טיפות נכונה, רכיבה על אופניים, קריאה וניתוח.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג פרוטוקול למיצוי וכמימות של microRNAs במחזור הדם כסמנים ביולוגיים פוטנציאליים למחלות קרדיווסקולריות. באמצעות שימוש ב-digital PCR, שיטה זו שואפת לשפר את דיוק מדידת ה-miRNA בדגימות סרום של מטופלים עם מצבים קרדיווסקולריים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מחלות קרדיווסקולריות
- סמנים ביולוגיים
- ניתוח MicroRNA
רקע
- miRNA הם רנ"א קצרים שאינם מקודדים המעורבים בבקרת ביטוי גנים.
- הם התגלו כסמנים ביולוגיים פוטנציאליים למחלות שונות, כולל מחלות קרדיווסקולריות.
- PCR דיגיטלי מציע יתרונות על פני שיטות מסורתיות לכימות של miRNA.
- הבנת פרופילי miRNA יכולה לסייע באבחון ובניהול של מחלות קרדיווסקולריות.
מטרת המחקר
- תיקוף של microRNAs כסמנים ביולוגיים למחלות קרדיווסקולריות.
- הדגמת היעילות של digital PCR בכימות של miRNAs במחזור הדם.
- אספקת פרוטוקול מהימן עבור חוקרים בתחום.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- מיצוי miRNAs מדגימות סרום.
- שעתוק הפוך לסנתזת DNA משלים.
- dPCR (PCR דיגיטלי) לצורך כימות מוחלט של miRNAs.
- השוואה בין PCR דיגיטלי לבין quantitative real-time PCR.
תוצאים עיקריים
- Digital PCR הדגימה דיוק גבוה יותר בכימות של miRNA.
- השיטה מאפשרת ניתוח של אלפי טיפות ללא צורך בעקיفات סטנדרט.
- היישום הפוטנציאלי של השיטה חורג ממחלות קרדיווסקולריות למצבים אחרים כגון סרטן.
- צוינו קשיים בטיפול בטיפות שבירות עבור משתמשים חדשים בטכניקה.
מסקנות
- המחקר תומך בשימוש ב-microRNAs במחזור הדם כסמנים ביולוגיים למחלות קרדיווסקולריות.
- Digital PCR הוא כלי מבטיח לכמות מדויקת של miRNA.
- מחקר נוסף עשוי להרחיב את יישומי שיטה זו למחלות אחרות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
כימות של microRNAs במחזור הדם באמצעות dPCR מספק גישה הדירה ובעלת רגישות גבוהה לתיקוף של סמנים ביולוגיים במחקר של מחלות קרדיווסקולריות. שיטה זו תומכת בתיקוף של מטרות ובפיתוח של בדיקות על ידי מתן אפשרות לכימות מוחלט ללא עקומות סטנדרט, ובכך מפחיתה את השונות במחקרים רב-מרכזיים. הטכניקה מגבירה את הביטחון החזוי בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי קישור ביטוי miRNA לפתולוגיה, ובכך מסייעת בקבלת החלטות לגבי המשך המחקר (go/no-go) בבחינת היפותזות טיפוליות.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות כימות של miRNAs ספציפיים למחלה, כגון miR-499 ב-AMI.
- ערך תפעולי: מספק מספר עותקים מוחלט של miRNA ללא עקומות סטנדרט, ובכך משפר את השחזוריות בין אתרים שונים.
- ערך ניבוי: תומך במיון תיקי פיתוח מונחה-סמנים ביולוגיים (biomarkers) על ידי קישור רמות miRNA לפתולוגיה קרדיווסקולרית.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: יוצר מערכות ביולוגיות מתוקפות (cDNA מ-RNA של סרום) עבור תהליכי סריקה המשכיים.
- ערך תפעולי: מספק תוצאות בעלות ליניאריות גבוהה ושונות נמוכה המתאימות לסטנדרטיזציה של בדיקות.
- יכולת הרחבה (Scalability): מאפשר עיבוד של 96 דגימות בערך שעה אחת לאחר הכנת תערובת המאסטר (post-mastered), ובכך תומך בסריקה בעלת תפוקה בינונית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מקשר בין כימות miRNA בשלב הגילוי לבין תיקוף פרה-קליני באמצעות סממנים ביולוגיים בנסיוב הרלוונטי למחלה.
- הפחתת סיכונים מכניסטיים: מפחיתה עמימות בתיקוף המטרה על ידי הצלבת ביטוי miRNA עם פגיעה קרדיווסקולרית.
- סנכרון סממנים ביולוגיים: תומך בפיתוח סממנים ביולוגיים תרגומיים על ידי כימות miRNAs בעלי ספציפיות גבוהה לרקמה ולמחלה.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, מהבדיקה של השערות ועד לזיהוי מובילים (leads), ומספקת נתונים כמותיים של miRNA המאפשרים להעריך את מידת הביטחון במטרה ואת מוכנות הבדיקה.
- ביולוגיה של תגליות: תומך בבדיקת השערות על ידי כימות שחרור miRNA מתאי קרדיו-וסקולריים אל מחזור הדם.
- סריקה: מייצר פלטים סטנדרטיים המוכנים לבדיקה עם רגישות גבוהה להערכת מועמדים לסממנים ביולוגיים.
- אנליזה: מאפשר השוואה ישירה של רמות miRNA בין תנאים שונים באמצעות כימות מוחלט ללא עקומות סטנדרט.
- מחקר תרגומי: מקדם את רציפות הסממנים הביולוגיים על ידי קישור פרופילים של miRNA במחזור הדם לפתולוגיה קרדיו-וסקולרית.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמת כימות ניתנת לשימוש חוזר, הישמימה לאינדיקציות קרדיו-וסקולריות ואונקולוגיות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתקפות של ביומרקרים באמצעות כימות miRNA בעל שונות נמוכה ורגישות גבוהה.
- ערך תפעולי: מבטיח שחזור וסטנדרטיזציה באמצעות חלוקה מבוססת טיפות (droplet-based partitioning) המבטלת מדידות כפולות.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) על ידי הפחתת עמימות מכניסטית במערכות היחסים בין ביומרקר למטרה.
- השפעה על פורטפוליו: מאפשר קידום מותאם סיכונים באמצעות נתוני miRNA כמותיים המקושרים לפתולוגיה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בבידוד RNA, שעתוק הפוך וטיפול בטיפות למניעת אובדן דגימות.
- נחוש ציוד ליצירת טיפות, מכשירי PCR ותוכנת dPCR לצורך כימות מדויק.
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי יצירת הטיפות והאיטום להשגת תוצאות הניתנות לשחזור.
- כולל שיקולי התאמה בעת היישום על סוגי דגימות שונים מעבר לסרום, כגון פלזמה או ליזאטים של רקמה.
- כולל מגבלות מעשיות כמו טיפול בטיפות שבירות, שעלול להשפיע על תפוקת העבודה עבור משתמשים חסרי ניסיון.
