Name: לקטט דהידרוגנאז פחמיות וזמינותו — שיטה פשוטה ואמינה לקביעת נפח פעילות פחמיות Autophagic בתאים בתרבית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: למדו שיטה לאמידת פעילות אוטופגיה בתאי יונקים באמצעות מדידת רמות LDH בחלקיקים שקועים. הפרוטוקול מספק גישה אמינה לחקר ספיגת מטען אנדוגני ללא שימוש בבדיקות מלאכותיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה כלכלית על ידי מועצת המחקר של נורבגיה, אוניברסיטת אוסלו, קרן Jahre אנדרס, קרן Nansen, המורשת לזכרו של הנריק Homan. אנו מודים ד ר Mizushima נובורו עבור ATG5 + / + MEFs ו- ATG5-/-MEFs, ד ר מסאקי Komatsu עבור ATG7 + / + MEFs ATG7/MEFs, ואת ד ר אקירה שיזואו עבור ATG9A + / + MEFs ו- ATG9A/MEFs. אנו מודים Sætre פרנק סיוע טכני, ד ר לכל O. Seglen על דיונים מועילים מתודולוגי.

1. תא זריעה וטיפול
<ol><li>
התרבות תאים חסיד ב- 75 ס מ2 תרביות רקמה מבחנות ב חממה humidified עם 5% CO2 ב 37 מעלות צלזיוס, תוך שימוש באמצעי תרבות מועדפת עבור סוג התא המדובר. מאפשרים לתאים לגדול עד שיגיעו שכבה תא בקרבת מקום ל- confluent. הערה: השתמש בינוני RPMI 1640 בתוספת 10% עוברית שור נסיוב (FBS) LNCaP, HEK293, העכבר מתחלקים fibroblasts (MEFs), ג'יי, MCF-7, תאי RPE-1.<ol>
<li>לשטוף את התאים עם 3 מ ל 37 ° C באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS), pH 7.4. החלף את PBS 3 mL 0.25% (w/v) טריפסין-ethylenediaminetetraacetate (EDTA), דגירה. הבקבוק ב חממה humidified ב 5% CO2 ב 37 ° C עד התאים ניתוק (2-5 דקות).</li>
		<li>Resuspend התאים מנותקת 7 mL תרבות בינונית המכיל 10% FBS. מערבבים aliquot השעיה 10 µL תאים עם 10 µL 0.4% Trypan Blue בשפופרת microcentrifuge, באמצעות טיפ פיפטה 0.5 – 20 µL. שימוש בקצה פיפטה אותו למלא מיד שקופית קאמרית ספירה, ולספור התאים מונה הניתן תא אוטומטית.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
להכין מתאים דילול (ראה הערה להלן) של התליה תא מלהשתמש שלב 1.1.2 תרבות בינוני המכיל 10% FBS וזרע 1 מ"ל של התא מדולל ההשעיה ב כל טוב של צלחת (שטח ~3.8 ס מ2) 12-ובכן תרביות רקמה באמצעות אספטי טכניקה. מאפשרים צמיחה חממה humidified עם 5% CO2 ב 37 ° C עד צפיפות התאים הרצויים הגיעה, למשל, 60 – 90% הנהרות-קציר. הערה: דילול המתאים של התליה תא שתעניק את confluency התא הרצוי-קציר ישתנו מן סוג התא סוג התא, וכן על פי את משך וסוג ניסיוני טיפולים. לכן, זה חייב להיות מדעית מוערך בכל מקרה ומקרה.<ol>
<li>לניסויים שהן שניהם התייחסו וקצרו 2 ימים לאחר זריעה, זרע 2.5 10x5 LNCaP, HEK293, או MCF-7 תאים, 5 x 104 MEFs, 4 x 105 BJ או 1.5 x 10 תאים5 RPE-1 מכל קידוח של צלחת 12-. טוב.</li>
		<li>עבור תאים ולהתבטא באופן רופף, מעיל הצלחות עם הסוג של ציפוי מומלץ עבור סוג התא המדובר. עבור תאים LNCaP (וגם HEK293) השתמש צלחות מצופה פולי-D-ליזין (PDL).</li>
		<li>לשם כך, הוסף 500 µL PDL ב 2.5 µg/mL סטרילי H2O מכל קידוח ולאחר דגירה הלוחות בסביבה סטרילית למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (20 – 25 ° C). להסיר את PDL עם השאיבה, ולשטוף היטב בקצרה עם 1 מ"ל סטרילי H2O. הערה: בדרך כלל, שלב 1.2.1 נעשית ללא כל ניסיוני טיפולים. עם זאת, אם מבצע RNAi, יתכן נוח להתחיל של תרביות תאים הפוכה עם זריעה9.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
לבצע טיפולים ניסיוניים בבארות כפולים או triplicate לכל תנאי.
	<ol>
<li>לדוגמה, מתייחסים התאים עם 50 nM של Torin1 מעכב mTOR, אשר בדרך כלל משרן יעיל של פחמיות autophagic, או נושא את התאים חריפה לרעב סרום, חומצת אמינו ע י שטיפת התאים עם 1 מ"ל של ארל נטול חומצה אמינית היא מאוזנת מלח בינוני פתרון (EBSS) ולאחר מכן דגירה תאי 1 מ"ל של EBSS ב חממה humidified עם 5% CO2 ב 37 º C.</li>
		<li>משאיר סט אחד של וולס לא מטופל כדי להגדיר רקע רמות של sedimentable LDH.</li>
		<li>להוסיף כמות saturating של bafilomycin פחמיות שלאחר מעכב A1 (Baf)3,13,16,18 היעדרות או נוכחות של טיפולים ניסיוניים, 3-4 שעות לפני תא קציר. דגירה התאים חממה humidified עם 5% CO2 ב 37 º C.<ol>
<li>שימוש 100 ננומטר Baf LNCaP, HEK293, ג'יי, MCF-7 ותאי RPE-1, ו- 10 ננומטר Baf עבור MEFs.</li>
			<li>עבור טיפולים ניסיוניים יש משך של רק 3-4 h (כמו אלה שלב החזרתם ב 1.3.1 יש בדרך כלל), הוסף Baf בו זמנית עם הטיפולים. עבור עוד טיפולים ניסיוניים לחכות עד 3-4 שעות לפני הקטיף, וכן להוסיף 2 µL של סימן x 500 מרוכז Baf המניה ישירות לתוך המדיום.</li>
			<li>מערבבים על ידי לזעזע את הצלחת מיד לאחר התוספת של Baf. בשלב זה הוא גם recommendable כדי להוסיף macroautophagic פחמיות מעכבי פקדים, למשל, 10 מ מ של פאן-phosphoinositide 3-קינאז (PI3K) מעכב 3-מתיל אדנין (3MA)19או 10 מיקרומטר של המחלקה PI3K סלקטיבי השלישי מעכב SAR-40520.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. התא הקציר והכנה Electrodisruption
<ol><li>בסוף תקופת הטיפול, תשאף המדיום עם השאיבה, ולהוסיף את הניתוק פתרון µL תא 200 (שחומם מראש ל- 37 ° C) כל טוב. דגירה ב 37 ° C עד התאים ניתוק (בדרך כלל בסביבות 5 דקות). הערה: הואיל 0.25% (w/v) טריפסין-EDTA יכול לשמש במקום הפתרון ניתוק התא, שהשני מכיל DNase, אשר מסייע להפחית את צמיגות של התאים מנותקת. כל עוד המדיום ביסודיות aspirated, אין צורך לשטוף את התאים לפני תוספת של טריפסין-EDTA או תא פתרון ניתוק.</li>
	<li>להוסיף 500 µL בטמפרטורת החדר (20-25 ° C) PBS, pH 7.4, המכיל 2% (w/v) אלבומין שור (BSA) על כל טוב, וכן resuspend עם פיפטה עד אין גושים תאים גלויים. להעביר מיד התליה תא ל 1.5 mL microcentrifuge צינורות על קרח. הערה: אלא אם צויין אחרת, לבצע את כל הצעדים הבאים על קרח.</li>
	<li>משקעים התאים על ידי צנטריפוגה ב x 400 g למשך 5 דקות ב 4 º C.</li>
	<li>ביסודיות וארוקן את תגובת שיקוע (עם השאיבה) לעזוב את כדורי תא יבש ככל האפשר.</li>
	<li>להוסיף 400 סוכרוז 10% (w/v) µL (ב- H הנדסה גנטית2O) כל שפופרת.</li>
</ol>3. קרום פלזמה Electrodisruption והפרדה של שברים Sedimentable - וסה כתא
<ol><li>Resuspend בגדר תא עם פיפטה כדי לקבל השעיה תא בודד ליד, להעביר אותו cuvette אלקטרופורציה 4 מ מ. הערה: Pipetting שיהיה ~ 10-15 פעמים, באמצעות טיפ 100 – 1000 µL פיפטה, מספיקה בדרך כלל.</li>
	<li>מניחים את cuvette electroporator גל דעיכה מעריכית, הפרשות דופק חשמלי יחיד-800 V, 25 µF וω 400; הגדרות אלה מייצרים דופק של משך ~ 8 ms.</li>
	<li>
להשתמש טיפ פיפטה חדש כדי להעביר את disruptate תא צינור microcentrifuge 1.5 mL המכיל 400 פתרון כקרח סוכרוז באגירה פוספט µL (100 מ מ נתרן monophosphate, dithiothreitol 2 מ מ (DTT), EDTA 2 מ מ ו- 1.75% סוכרוז, pH 7.5), ומערבבים בקצרה על ידי pipetting.
	<ol>
<li>אופציונלי: כדי לוודא קרום פלזמה יעיל electrodisruption17, לערבב 10 µL של disruptate התא מדולל מהשלב 3.3 עם 10 µL 0.4% Trypan Blue צינור microcentrifuge 1.5 mL. העברה לתא הספירה ולוודא כי הוא האחוז של תאים חיוביים Trypan Blue &gt; 99%.<ol>
<li>להשאיר את הדגימה בתא ספירה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (20 – 25 ° C), וודא כי אחוז תאים חיוביים Trypan Blue נותר &gt; 99%.</li>
		</ol>
</li>
		<li>אופציונלי: כדי לוודא כי electrodisruption לא היה נוקשה מדי, כלומר, זה יש לא הפריע organelles תאיים, בצע את השלבים 1.1 – 3.3 כמתואר לעיל, אך השתמש בחומר המוצא גדול יותר (באר מצלחת 6-ובכן עם שכבת תאים confluent ~ 80%), ולהשתמש 150 µL 10% סוכרוז שלב 2.5 ו- 150 µL תמיסת סוכרוז באגירה פוספט ללא DTT בשלב 3.3.<ol>
<li>להשתמש על פיפטה כדי בזהירות שכבה 200 µL של הפתרון disruptate תא מדולל על גבי כרית צפיפות 1.2 מ של באגירה פוספט 8% (w/v) צפיפות בינונית מעבר צבע (למשל, 8% Nycodenz, 50 מ מ סודיום פוספט, 2.2% סוכרוז, 1 מ"מ EDTA) ומפרידה 2 מ שפופרת. צנטריפוגה ב 20,000 x g למשך 45 דקות ב 4 ° C ב- microcentrifuge עם פונקציית מצב רך (עבור עדין האצה והאטה) והניח בזהירות הצינורות על קרח.</li>
			<li>הסר בזהירות µL 60 של השבר ~ 200 µL העליון, מקפיד לא לאסוף כל פתרון הדרגתי בינוני צפיפות ולאחר להעביר צינור microcentrifuge טריים. הערה: זה להכיל ציטוזול טוהר יוצאת דופן, כינה "תא sap"21.</li>
			<li>מבחן הטוהר של השבר שהושג בשלב מעל, על ידי ביצוע ניתוחים תספיג של חלבונים הכילה-אברון, באמצעות טכניקות רגיל ו- 4 – 20% ג'ל הדרגתיות16.</li>
			<li>בצע immunoblotting לדוגמה עבור cathepsin B21, ציטוכרום c, וחלבון disulphide איזומראז, כדי לוודא כי הזרם החשמלי בשלב 3.2 יש לא שיבשו lysosomes, המיטוכונדריה או רשתית תוך-פלזמית, בהתאמה, ו- immunoblot עבור LDH כדי לוודא נוכחות של חלבון הצוף תא cytosolic.</li>
			<li>במקביל, מבצע immunoblotting תמציות חלבונים זני ה פתרון disruptate cell סך הכל16 כדי לאשר הנוגדנים בשימוש ניתן לזהות את החלבונים הכיל אברון זה הם המוערך.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>חזור על שלבים 3.1 – 3.3 עבור כל דגימה.</li>
	<li>להסיר 550 µL כל פתרון disruptate תא מדולל (שהושג בשלב 3.3) כדי microcentrifuge 2 mL צינורות המכיל 900 µL resuspension קר כקרח מאגר (50 מ מ נתרן monophosphate, 1 מ מ DTT, EDTA 1 מ"מ ו- 5.9% סוכרוז, pH 7.5) בתוספת BSA 0.5% ו- 0.01% Tween-20, מערבבים בקצרה על-ידי pipetting.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 18,000 x g למשך 45 דקות ב 4 ° C כדי לייצר גללים המכיל "sedimented LDH". ביסודיות וארוקן את תגובת שיקוע (עם השאיבה) לעזוב את כדורי יבש ככל האפשר. מקם את הדגימות במקפיא-80 ° C.</li>
	<li>להעביר 150 µL כל פתרון disruptate תא מדולל (שהושג בשלב 3.3) צינורות חדשים, ולמקם את הדגימות במקפיא-80 ° C. להשתמש בדוגמאות אלה כדי לקבוע את רמות "סה כ- LDH" בתאים. הערה: בשלב זה הניסוי ניתן להשהות עבור כל עוד הרצוי.</li>
</ol>4. LDH החילוץ ומדידה של פעילות אנזימטי לקטט דהידרוגנאז
<ol><li>להפשיר את "LDH sedimented" (מתוך שלב 3.6) ודוגמאות "סה כ- LDH" (מתוך שלב 3.7) על קרח.</li>
	<li>להוסיף 300 µL resuspension קר כקרח מאגר המכיל 1.5% טריטון X-405 ל- "LDH הכולל" דגימות (מניב ריכוז טריטון X-405 הסופי של 1%). לסובב את הדוגמאות על גלגלת בחדר קר (4 – 8 ° C) במשך 30 דקות.</li>
	<li>הוסף µL 750 המאגר הקר resuspension עם 1% טריטון X-405 ל- "sedimented LDH" דגימות, resuspend כדורי עם פיפטה עד פתרון הומוגני.</li>
	<li>Centrifuge דגימות מן שלב 4.2 ו- 4.3-x 18,000 g עבור 5 דקות ב 4 ° C כדי פסולת הסלולר משקעים undissolved.</li>
	<li>לערבב 4 חלקים מ מ 65 קר imidazole (pH 7.5)/0.75 פירובט מ מ עם חלק אחד של imidazole מ מ 65 קר (pH 7.5) / 1.8 מ"מ NADH להשגת פתרון עבודה יציב במשך שלושה שבועות לפחות ב 4 º C.</li>
	<li>מערבבים 3 – 30 µL של supernatants מ שלב 4.4 עם 200 µL של הפתרון עובד שלב 4.5.</li>
	<li>לקבוע את כמות LDH על ידי מדידת LDH פעילות אנזימטי כמו הירידה nicotinamide אדנין dinucleotide (טופס מופחתת) ספיגת (NADH)-340 nm ב 37 מעלות צלזיוס לעומת תקן עם ריכוז LDH ידוע. לבצע מדידות ספיגת עד התגובה פנה השלמה, דהיינו עד ספיגת-340 ננומטר כבר לא משתנה עם הזמן. הערה: זוהי שיטת הביוכימי קלאסית כדי למדוד פעילות LDH. למרות בפרוטוקול הנוכחי מבצע את התגובה ב 37 מעלות צלזיוס, זה ניתן גם לבצע בטמפרטורת החדר (20 – 25 ° C), אשר מומלץ אם עושה ספקטרופוטומטר ידנית. בפרוטוקול הנוכחי משתמש מכשיר multianalyzer רובוטית, אשר באופן אוטומטי מתערבב דגימות עם הפתרון עובד בצלחת 96-ובכן, מודד את ספיגת-340 nm ב 37 ° C כל 20 s למשך 3 דקות. לאחר מכן, כלי התוכנה מחשבת את הריכוז של LDH, הביע כמו יחידות (U) / L, על-ידי השוואת השיפוע של המדידות ספיגת לאורך זמן בהשוואה עיקול רגיל מושגת באמצעות כיול עם תקן של LDH ידוע ריכוז. טווח לינאריות לזיהוי על-ידי גישה זו הוא 30 – 1,500 U/ל' כחלופה, קיים מגוון רחב של ערכות זמינים מסחרית כדי למדוד LDH. חלקם מבוססים על מצומדות אנזימטי לדור של ערכי צבע מוחלטים או פלורסנט מוצרים, המאפשרים זיהוי על ידי אמצעים אחרים מאשר ספקטרופוטומטר UV, ועם שאר הטווחים ליניארי של זיהוי.</li>
</ol>5. חישוב של LDH פחמיות
<ol><li>לחשב את אחוז LDH sedimented כדי LDH הכולל עבור כל דגימה, לוקח את דילולים ולדגום בחשבון: LDH sedimented (%) =<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57971/57971eq1.jpg"> הערה: במהלך השלבים µL כ-50 3.1 – 3.3 זה איבדו בשל העברת את cuvette אלקטרופורציה וממנה. לפיכך, חישוב מהצורך סך של 750 µL (במקום 800 µL) של התא מדולל disruptate בשלב 3.3.</li>
	<li>להפחית את אחוז LDH sedimented להשיג דגימות מתאי לא מטופל (שלב 1.3.2) מן האחוז של LDH sedimented להשיג דגימות תאים שטופלו ניסיוניים, הפער בזמן הטיפול עם Baf כדי לקבל את אחוז LDH מוחרמת לשעה בתקופת הדגימה: . מבודד LDH (% / h) =<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57971/57971eq2.jpg">
</li>
</ol>

<ol><li>Rubinsztein, D. C., Frake, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yoshinori+Ohsumi%27s+Nobel+Prize+for+mechanisms+of+autophagy%3A+from+basic+yeast+biology+to+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22J+R+Coll+Physicians+Edinb%22%5BJournal%5D)">Yoshinori Ohsumi's Nobel Prize for mechanisms of autophagy: from basic yeast biology to therapeutic potential.</a> J R Coll Physicians Edinb. 46 (4), 228-233 (2016).</li>
<li>Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+exponential+growth+of+autophagy-related+research%3A+from+the+humble+yeast+to+the+Nobel+Prize%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">The exponential growth of autophagy-related research: from the humble yeast to the Nobel Prize.</a> FEBS Lett. 591 (5), 681-689 (2017).</li>
<li>Seglen, P. O., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25576638">Macroautophagic cargo sequestration assays.</a> Methods. 75, 25-36 (2015).</li>
<li>Hoyvik, H., Gordon, P. B., Seglen, P. O. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3743649">Use of a hydrolysable probe, [14C]lactose, to distinguish between pre-lysosomal and lysosomal steps in the autophagic pathway.</a> Exp Cell Res. 166 (1), 1-14 (1986).</li>
<li>Plomp, P. J., Gordon, P. B., Meijer, A. J., Hoyvik, H., Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+dependence+of+different+steps+in+the+autophagic-lysosomal+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Energy dependence of different steps in the autophagic-lysosomal pathway.</a> J Biol Chem. 264 (12), 6699-6704 (1989).</li>
<li>Gordon, P. B., Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prelysosomal+convergence+of+autophagic+and+endocytic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Prelysosomal convergence of autophagic and endocytic pathways.</a> Biochem Biophys Res Commun. 151 (1), 40-47 (1988).</li>
<li>Holen, I., Gordon, P. B., Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase-dependent+effects+of+okadaic+acid+on+hepatocytic+autophagy+and+cytoskeletal+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Protein kinase-dependent effects of okadaic acid on hepatocytic autophagy and cytoskeletal integrity.</a> Biochem J. 284, Pt 3 633-636 (1992).</li>
<li>Kabeya, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LC3%2C+a+mammalian+homologue+of+yeast+Apg8p%2C+is+localized+in+autophagosome+membranes+after+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+j%22%5BJournal%5D)">LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing.</a> Embo j. 19 (21), 5720-5728 (2000).</li>
<li>Szalai, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagic+bulk+sequestration+of+cytosolic+cargo+is+independent+of+LC3%2C+but+requires+GABARAPs%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Autophagic bulk sequestration of cytosolic cargo is independent of LC3, but requires GABARAPs.</a> Exp Cell Res. 333 (1), 21-38 (2015).</li>
<li>Nguyen, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atg8+family+LC3%2FGABARAP+proteins+are+crucial+for+autophagosome-lysosome+fusion+but+not+autophagosome+formation+during+PINK1%2FParkin+mitophagy+and+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Atg8 family LC3/GABARAP proteins are crucial for autophagosome-lysosome fusion but not autophagosome formation during PINK1/Parkin mitophagy and starvation.</a> J Cell Biol. , (2016).</li>
<li>Pontano Vaites, L., Paulo, J. A., Huttlin, E. L., Harper, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+human+cells+lacking+ATG8+proteins+uncovers+roles+for+GABARAPs+and+the+CCZ1%2FMON1+regulator+C18orf8%2FRMC1+in+macro+and+selective+autophagic+flux%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of human cells lacking ATG8 proteins uncovers roles for GABARAPs and the CCZ1/MON1 regulator C18orf8/RMC1 in macro and selective autophagic flux.</a> Mol Cell Biol. , (2017).</li>
<li>Kopitz, J., Kisen, G. O., Gordon, P. B., Bohley, P., Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonselective+autophagy+of+cytosolic+enzymes+by+isolated+rat+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nonselective autophagy of cytosolic enzymes by isolated rat hepatocytes.</a> J Cell Biol. 111 (3), 941-953 (1990).</li>
<li>Bowman, E. J., Siebers, A., Altendorf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bafilomycins%3A+a+class+of+inhibitors+of+membrane+ATPases+from+microorganisms%2C+animal+cells%2C+and+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Bafilomycins: a class of inhibitors of membrane ATPases from microorganisms, animal cells, and plant cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 85 (21), 7972-7976 (1988).</li>
<li>Hadjivassiliou, A. G., Rieder, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enzymatic+assay+of+pyruvic+and+lactic+acids.+A+definitive+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">The enzymatic assay of pyruvic and lactic acids. A definitive procedure.</a> Clin Chim Acta. 19 (3), 357-361 (1968).</li>
<li>Bergmeyer, H. U., Bernt, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBergmeyer%2C+HU+%22Methods+of+enzymatic+analysis+%282nd+English+ed%29%22">Methods of enzymatic analysis (2nd English ed)</a>. Bergmeyer, H. U. 2, Verlag Chemie. 574-579 (1974).</li>
<li>Engedal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+intracellular+calcium+homeostasis+blocks+autophagosome+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Modulation of intracellular calcium homeostasis blocks autophagosome formation.</a> Autophagy. 9 (10), 1475-1490 (2013).</li>
<li>Luhr, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Cargo+Sequestration+Assay+for+Quantitative+Measurement+of+Nonselective+Autophagy+in+Cultured+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">A Simple Cargo Sequestration Assay for Quantitative Measurement of Nonselective Autophagy in Cultured Cells.</a> Methods Enzymol. 587, 351-364 (2017).</li>
<li>Mousavi, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+inhibitors+of+the+vacuolar+proton+pump+on+hepatic+heterophagy+and+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Effects of inhibitors of the vacuolar proton pump on hepatic heterophagy and autophagy.</a> Biochim Biophys Acta. 1510 (1-2), 243-257 (2001).</li>
<li>Seglen, P. O., Gordon, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-Methyladenine%3A+specific+inhibitor+of+autophagic%2Flysosomal+protein+degradation+in+isolated+rat+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">3-Methyladenine: specific inhibitor of autophagic/lysosomal protein degradation in isolated rat hepatocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (6), 1889-1892 (1982).</li>
<li>Ronan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+potent+and+selective+Vps34+inhibitor+alters+vesicle+trafficking+and+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">A highly potent and selective Vps34 inhibitor alters vesicle trafficking and autophagy.</a> Nat Chem Biol. 10 (12), 1013-1019 (2014).</li>
<li>Saetre, F., Hagen, L. K., Engedal, N., Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+steps+in+the+autophagic-lysosomal+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Febs+j%22%5BJournal%5D)">Novel steps in the autophagic-lysosomal pathway.</a> Febs j. 282 (11), 2202-2214 (2015).</li>
<li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy+%283rd+edition%29%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition).</a> Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).</li>
<li>Seglen, P. O., Overbye, A., Saetre, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequestration+assays+for+mammalian+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Sequestration assays for mammalian autophagy.</a> Methods Enzymol. 452, 63-83 (2009).</li>
<li>Hurley, J. H., Young, L. N. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28301741">Mechanisms of Autophagy Initiation.</a> Annu Rev Biochem. 86, 225-244 (2017).</li>
<li>Thastrup, O., Cullen, P. J., Drobak, B. K., Hanley, M. R., Dawson, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thapsigargin%2C+a+tumor+promoter%2C+discharges+intracellular+Ca2%2B+stores+by+specific+inhibition+of+the+endoplasmic+reticulum+Ca2%28%2B%29-ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Thapsigargin, a tumor promoter, discharges intracellular Ca2+ stores by specific inhibition of the endoplasmic reticulum Ca2(+)-ATPase.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (7), 2466-2470 (1990).</li>
<li>Kuma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+autophagy+during+the+early+neonatal+starvation+period%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The role of autophagy during the early neonatal starvation period.</a> Nature. 432 (7020), 1032-1036 (2004).</li>
<li>Komatsu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impairment+of+starvation-induced+and+constitutive+autophagy+in+Atg7-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Impairment of starvation-induced and constitutive autophagy in Atg7-deficient mice.</a> J Cell Biol. 169 (3), 425-434 (2005).</li>
<li>Saitoh, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atg9a+controls+dsDNA-driven+dynamic+translocation+of+STING+and+the+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Atg9a controls dsDNA-driven dynamic translocation of STING and the innate immune response.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (49), 20842-20846 (2009).</li>
<li>Gordon, P. B., Seglen, P. O. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7140848">Autophagic sequestration of [14C]sucrose, introduced into rat hepatocytes by reversible electro-permeabilization.</a> Exp Cell Res. 142 (1), 1-14 (1982).</li>
<li>An, H., Harper, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+ribophagy+in+human+cells+reveals+bystander+flux+during+selective+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of ribophagy in human cells reveals bystander flux during selective autophagy.</a> Nat Cell Biol. 20 (2), 135-143 (2018).</li>
<li>Fass, E., Shvets, E., Degani, I., Hirschberg, K., Elazar, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubules+support+production+of+starvation-induced+autophagosomes+but+not+their+targeting+and+fusion+with+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Microtubules support production of starvation-induced autophagosomes but not their targeting and fusion with lysosomes.</a> J Biol Chem. 281 (47), 36303-36316 (2006).</li>
<li>Velikkakath, A. K., Nishimura, T., Oita, E., Ishihara, N., Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+Atg2+proteins+are+essential+for+autophagosome+formation+and+important+for+regulation+of+size+and+distribution+of+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Mammalian Atg2 proteins are essential for autophagosome formation and important for regulation of size and distribution of lipid droplets.</a> Mol Biol Cell. 23 (5), 896-909 (2012).</li>
<li>Øverbye, A., Sætre, F., Hagen, L. K., Johansen, H. T., Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagic+activity+measured+in+whole+rat+hepatocytes+as+the+accumulation+of+a+novel+BHMT+fragment+%28p10%29%2C+generated+in+amphisomes+by+the+asparaginyl+proteinase%2C+legumain%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Autophagic activity measured in whole rat hepatocytes as the accumulation of a novel BHMT fragment (p10), generated in amphisomes by the asparaginyl proteinase, legumain.</a> Autophagy. 7 (9), 1011-1027 (2011).</li>
<li>Kominami, E., Hashida, S., Khairallah, E. A., Katunuma, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequestration+of+cytoplasmic+enzymes+in+an+autophagic+vacuole-lysosomal+system+induced+by+injection+of+leupeptin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Sequestration of cytoplasmic enzymes in an autophagic vacuole-lysosomal system induced by injection of leupeptin.</a> J Biol Chem. 258 (10), 6093-6100 (1983).</li>
<li>Rosado, C. J., Mijaljica, D., Hatzinisiriou, I., Prescott, M., Devenish, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rosella%3A+a+fluorescent+pH-biosensor+for+reporting+vacuolar+turnover+of+cytosol+and+organelles+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Rosella: a fluorescent pH-biosensor for reporting vacuolar turnover of cytosol and organelles in yeast.</a> Autophagy. 4 (2), 205-213 (2008).</li>
<li>Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+and+quantitative+technique+for+detecting+autophagic+events+based+on+lysosomal+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery.</a> Chem Biol. 18 (8), 1042-1052 (2011).</li>
<li>Ogier-Denis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+heterotrimeric+Gi3-protein+controls+autophagic+sequestration+in+the+human+colon+cancer+cell+line+HT-29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A heterotrimeric Gi3-protein controls autophagic sequestration in the human colon cancer cell line HT-29.</a> J Biol Chem. 270 (1), 13-16 (1995).</li>
<li>Seglen, P. O., Gordon, P. B., Tolleshaug, H., Hoyvik, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+%5B3H%5Draffinose+as+a+specific+probe+of+autophagic+sequestration%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Use of [3H]raffinose as a specific probe of autophagic sequestration.</a> Exp Cell Res. 162 (1), 273-277 (1986).</li>
<li>Luhr, M., Sætre, F., Engedal, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Long-lived+Protein+Degradation+Assay%3A+an+Efficient+Method+for+Quantitative+Determination+of+the+Autophagic+Flux+of+Endogenous+Proteins+in+Adherent+Cell+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">The Long-lived Protein Degradation Assay: an Efficient Method for Quantitative Determination of the Autophagic Flux of Endogenous Proteins in Adherent Cell Lines.</a> Bio-protocol. 8 (9), e2836(2018).</li>
<li>Ronning, O. W., Pettersen, E. O., Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+synthesis+and+protein+degradation+through+the+cell+cycle+of+human+NHIK+3025+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Protein synthesis and protein degradation through the cell cycle of human NHIK 3025 cells in vitro.</a> Exp Cell Res. 123 (1), 63-72 (1979).</li>
<li>Seglen, P. O., Grinde, B., Solheim, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+the+lysosomal+pathway+of+protein+degradation+in+isolated+rat+hepatocytes+by+ammonia%2C+methylamine%2C+chloroquine+and+leupeptin%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Inhibition of the lysosomal pathway of protein degradation in isolated rat hepatocytes by ammonia, methylamine, chloroquine and leupeptin.</a> Eur J Biochem. 95 (2), 215-225 (1979).</li>
<li>Seglen, P. O., Solheim, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Valine+uptake+and+incorporation+into+protein+in+isolated+rat+hepatocytes.+Nature+of+the+precursor+pool+for+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Valine uptake and incorporation into protein in isolated rat hepatocytes. Nature of the precursor pool for protein synthesis.</a> Eur J Biochem. 85 (1), 15-25 (1978).</li>
<li>Bauvy, C., Meijer, A. J., Codogno, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+of+autophagic+protein+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Assaying of autophagic protein degradation.</a> Methods Enzymol. 452, 47-61 (2009).</li>
<li>Engedal, N., Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+of+cytoplasmic+bulk+cargo+does+not+require+LC3%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Autophagy of cytoplasmic bulk cargo does not require LC3.</a> Autophagy. 12 (2), 1-3 (2016).</li>
</ol>

המחברים יש אין ניגוד אינטרסים.

לסיכום, הפרוטוקול המתואר כאן מייצג שיטה אמינה החלים נרחב כדי לעקוב אחר פעילות פחמיות autophagic בתפזורת בתאי יונקים. לעומת ה12,המקורי שיטת16, יש להסיר מספר צעדים מיותרים, פשוטה מספר השלבים הנותרים, ואנו הציג downscaling משמעותית. כתוצאה מכך, הפרוטוקול זה השתפר מאוד ביחס עלות-זמן-ויעילות, עכשיו יכול להיות מטופלים כמות זהה של דגימות פחות מחצי מהזמן לעומת הפרוטוקול המקורי. לקבלת דוגמאות 24, שלבים 2 – 3 (יום 1) דורש כ ½ h של הכנה פלוס 3 שעות של עבודה יעילה, בעוד שלב ...

Autophagy (מיוונית "עצמי אוכל") היא תהליך ההכפלה אבולוציונית על השפלה vacuolar/lysosomal של חומר תאיים. על גילוי של גנים הקשורים autophagy ("ATG"), אשר חשובים עבור autophagy שמרים ובבני אדם, המימוש autophagy הזה משחק תפקיד משמעותי (הכיר בכך 2016 הנובל ברפואה או פיזיולוגיה כדי מחלה ובריאות האדם Yoshinori Ohsumi), autophagy הפך במהירות אחד מהתהליכים הכי בעוצמה למדה תא ביולוגיה1,2.
Macroautophagy (ןלהל "autophagy") הוא מאופיין על ידי ההרחבה, מתקפלים של קרום תאיים cisternae ("phagophores") לתוך חסומות, membrane כפול או ריבוי במבנים ("autophagosomes") sequester ביעילות חומר enwrapped משאר הציטופלסמה. על היתוך של autophagosomes עם lysosomes, קרום autophagosomal הפנימי ואת המטען מוחרמת מושפל, ממוחזר. Autophagosomes יכולים sequester חומר cytoplasmic אקראי (autophagy לא בררניים) והן נימוסים סלקטיבית (autophagy סלקטיבי). בתפזורת autophagy קרוב לוודאי מייצגת שילוב של autophagy לא בררניים, סלקטיבי.
ב שנות ה-60 וה-70 ("מורפולוגי עידן" autophagy מחקר), autophagic פחמיות הוערכה בעיקר באמצעות ניתוחים ultrastructural. בשנות השמונים ובתחילת שנות התשעים ("התקופה הביוכימי") לכל Seglen ועמיתים — מי למד autophagy בשנת החולדה הראשית hepatocytes — פיתח את השיטות הראשונות למדוד באופן כמותי את פעילות פחמיות autophagic3. באמצעות מבחני אלה, Seglen מוגדרת, מאופיין שלבים שונים של4,autophagic-lysosomal מסלול5גילה, טבע amphisome6 (התוצר של פיוז'ן אנדוזום-autophagosome), היה הראשון תאר את התפקיד של זירחון חלבונים ב autophagy בתקנה7. עם זאת, לאחר גילוי ATGs של 1990 ("התקופה מולקולרי"), אפיון חלבון ATG8 בתרבית של הראשון, חלבונים הקשורים microtubule 1A/1B-אור שרשרת 3 (LC3) ב- 20008, השימוש של חלבונים ATG כסמני עבור תהליך autophagic במהירות לפופולריות, שיטות ביוכימיות יותר מפרך ושנמצאת הושארו מאחור. למעשה, במהלך 18 השנים האחרונות, תספיג וניתוחים פלורסצנטיות מיקרוסקופיה של LC3 הפכו הפופולרי ביותר עד כה (ובמקרים רבים היחידה) פירושו של הלומדים autophagy בתאי יונקים. היתרון הוא הקלות שבה שיטות אלה יכול להתבצע. החיסרון הוא שזה הוא לומד מרכיב עגלה (LC3) במקום מטען autophagic בפועל. זה חיסרון די רציני, כי היחסים בין מדינות ו/או של שטף של LC3 דרך בשביל לעומת פחמיות, שטף של מטענים מאוד לא ברור. למעשה, אנחנו הראו כי שטף מטענים בצובר יכול להישמר ברמה גבוהה בתנאים שבו יש שטף LC3 אין, למרות נוכחותם של LC3 מצומדת ב9תאים. יתר על כן, אנו הפגינו autophagy בצובר הזה הוא לא מושפע על ידי דלדול LC3 יעיל, ולכן סביר שאינו תלוי-LC39. ממצא זה אושר מאוחר יותר על ידי LC3 מעלף מחקרים10,11, אשר גם עולה כי mitophagy תלויי-פרקין (autophagy סלקטיבי של המיטוכונדריה) היא עצמאית של LC310,11 .
לסיכום, יש ברור הצורך מבוסס-מטען מבחני לעקוב אחר פעילות autophagic. בצורה אופטימלית מבחני כזה צריך להיות בהרחבה ישימים, מוגדרים היטב וקל לביצוע. במהלך השנים האחרונות לקחנו את עניין מסוים וזמינותו פחמיות LDH, אשר פותחה על ידי לכל Seglen ב-198012, והיא מבוססת על מדידת ההעברה של cytosolic LDH כדי sedimentable, autophagic המכילים חלולית התא שברים. LDH הוא חלבון cytosolic יציב, מסיסים זה הוא ברצון משותפת מבודד כאשר phagophores שלכדו cytoplasmic מטענים. פחמיות של LDH לכן מדד כללי של פחמיות autophagic. LDH יורד באופן בלעדי על ידי שביל autophagic-lysosomal12. לפיכך, בנוכחות השפלה lysosomal מעכבי, למשל, bafilomycin A1 (Baf)13, טיפול ניסיוני השפעות ישירות לשקף שינויים בפעילות פחמיות autophagic. בהיעדרו של מעכבי השפלה, ניתן למדוד את השפעת שינויים ב- LDH פחמיות והשפלה נטו.
LDH פחמיות וזמינותו ישימה באופן כללי, כיוון LDH מאוד, ubiquitously מתבטא בכל סוגי התאים, LDH רמות ניתן לכמת במדויק על ידי מטוס14,assay אנזימטי15. עם זאת, המקורי פרוטוקול12 – נוסדה בשנת החולדה הראשית hepatocytes — היה במקום זמן רב והוא נדרש כמות גבוהה של החל בחומר, כמו גם קבל פריקה חשמלית בהזמנה אישית. באופן הדרגתיים, לנו יש בהדרגה הפך וזמינותו שיטה קלה ופסיביות. ראשית, הפרוטוקול המקורי הותאם לשימוש בתרבית של תאים שורות16. שנית, שיטת הפעולה היתה באופן משמעותי downscaled3,9. השלישי, מספר שלבים בפרוטוקול חוסלו, כולל כרית צפיפות מפרך בשלב17. זה מופעל בו זמנית של עוד יותר downscaling של השיטה, מנקודת ההתחלה המקורית של שימוש צלחת 10 ס מ לכל דגימה16 באמצעות לבאר בודדת מצלחת 12-טוב עבור דגימה (כלומר, כ 15-fold החל פחות חומר)17. רביעית, זיהינו מנגנון אלקטרופורציה מסחרי שיכול להחליף קבל פריקה חשמלית בהזמנה אישית17.
כאן מוצג שלנו פרוטוקול העדכנית ביותר של LDH פחמיות וזמינותו, הכולל כמה העבודה נוסף של השיטה לעומת ה-17 שפורסמו בעבר. יתר על כן, ערכה של טיפוסי התוצאות המתקבלות מספר סוגי התאים מוצג, חשוב, שורות מרובות של אימותים ניסיוניים של השיטה באמצעות נוקאאוט תרופתי, כמו גם גנטי וגישות נוק אאוט הינם מסופקים. לקבלת לסכימת הזרימה הכללית של פרוטוקול שלם, ראה איור 1.

<table><tbody><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל ו-2 מ"ל&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>211-2130 ו- 211-2120</td><td></td></tr><tr><td>צלחות 12 בארות&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>Accumax&nbsp; פתרון ניתוק תאים</td><td>חדשני טכנולוגיות תאים</td><td>A7089</td><td>שמור על מינימום של -20 מעלות; C במשך שנים, ובמקרר למשך מספר חודשים</td></tr><tr><td>Bafilomycin A1</td><td>Enzo</td><td>BML-CM110-0100</td><td>מתמוסס בתאי DMSO</td></tr><tr><td>BJ</td><td>ATCC</td><td>CRL-2522</td><td>שימוש במעבר < 30</td></tr><tr><td>אלבומין בסרום בקר (BSA)</td><td>VWR</td><td>422361V</td><td></td></tr><tr><td>תא ספירת בורקר</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>139-658585</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות תא ספירת תאים של הרוזנת</td><td>ThermoFisher Scientfic</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Countess II מונה תאים אוטומטי</td><td>ThermoFisher Scientfic</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>כיסוי זכוכית לתא</td> <td>הספירה של בורקרפישר סיינטיפיק</td><td>139-658586</td><td></td></tr><tr><td>קריטריון Tris-HCl ג'ל, 4&ndash; 20%, 26 בארות, 15 ומיקרו; L, 13.3 ס"מ x 8.7 ס"מ (רוחב x אורך)&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>3450034</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח מאוזנת של ארל (EBSS)</td><td>Gibco</td><td>24010-043</td><td>conatains 0.1% גלוקוז</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>קובטה אלקטרופורציה (4 מ"מ)</td><td>Bio-Rad</td><td>1652088</td><td></td></tr><tr><td>אלקטרופורטור גל דעיכה אקספוננציאלי</td><td>BTX הרווארד מכשירים</td><td>&nbsp; EMC 630</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F7524</td><td>10% ריכוז סופי ב-RPMI 1640</td></tr><tr><td>תאי HEK293</td> בינוניים <td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56750</td><td>חיטוי תמיסה של 65 מ"מ ולשמור במקרר למשך חודשים</td></tr><tr><td>אינקובטור; חממת CO2 חום ישיר IR זרימה</td> אוטומטית <td>NuAire</td><td>NU-5510E</td><td></td></tr><tr><td>ליפופקטמין RNAiMAX מגיב טרנספקציה</td><td>ThermoFisher</td><td>13778150</td><td></td></tr><tr><td>תאי LNCaP</td><td>ATCC</td><td>CRL-1740</td><td>שימוש במעבר < 30</td></tr><tr><td>3-מתיל אדנין (3MA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9281</td><td>מלאי 100 מ"מ ב-RPMI ב-20 &deg;C.&nbsp; מחממים ציר ל 65 מעלות; C למשך 10 דקות, ושימוש בריכוז סופי של 10 מ"מ</td></tr><tr><td>מיקרוצנטריפוגה מקוררת</td><td>בקמן קולטר מדעי החיים</td><td>368831</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוצנטריפוגה מקוררת עם פונקציית מצב רך</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>אפנדורף 5417R&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MRT67307 הידרוכלוריד (ULKi)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>SML0702</td><td>מעכב את פעילות ULK קינאז. להתמוסס ב-DMSO.</td></tr><tr><td>מכשיר מולטיאנלייזר MaxMat</td><td>Erba Diagnostics</td><td>PL-II</td><td></td></tr><tr><td>MCF7 תאים</td><td>ATCC</td><td>HTB-22</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>Merck-Millipore</td><td>1.24644.001</td><td></td></tr><tr><td>Nycodenz</td><td>Axis-Shield</td><td>1002424</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM סרום מופחת בינוני</td><td>ThermoFisher</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>מי מלח חוצץ פוספט (PBS)</td><td>Gibco</td><td>20012-019</td><td></td></tr><tr><td>טיפים לפיפטה 3 (0.5-20 ומיקרו; L)</td> <td>VWR</td><td>732-2223</td><td>Thermo Fischer ART קצות מחסום</td></tr><tr><td>קצות פיפטה (1-200 ומיקרו; L)</td> <td>VWR</td><td>732-2207&nbsp;</td><td>טיפים למחסום ART של תרמו פישר</td></tr><tr><td>קצות פיפטות (100-1,000 ומיקרו; L)</td> <td>VWR</td><td>732-2355&nbsp;</td><td>טיפים למחסום ART של תרמו פישר</td></tr><tr><td>Pipettes</td><td>ThermoFisher</td><td>4701070</td><td>Finnpipette F2 GLP Kit</td></tr><tr><td>Poly-D-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407-10X5MG</td><td>הכינו תמיסת מלאי של 1 מ"ג/מ"ל ב-H2O סטרילי. פתרון זה יציב ב-20 מעלות; C למשך שנה לפחות.</td></tr><tr><td>תאי Pyruvate</td><td>Merck-Millipore</td><td>1066190050</td><td></td></tr><tr><td>RPE-1 (hTERT RPE-1)</td> <td>ATCC</td><td>CRL-4000</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>21875-037</td><td></td></tr><tr><td>SAR-405</td><td>ApexBio&nbsp;</td><td>A8883</td><td>מעכב פוספואינוזיטיד 3-קינאז בדרגה III (PIK3C3). להתמוסס ב-DMSO.</td></tr><tr><td>משתיק קול בחר שליטה שלילית #1 (siCtrl)</td>משתיק קול <td>ThermoFisher/Ambion</td><td>4390843</td><td></td></tr><tr><td>בחר siRNA מכוון ATG9 (siATG9A)</td><td>משתיק קול ThermoFisher/Ambion</td><td>s35504</td><td></td></tr><tr><td>בחר siRNA מכוון FIP200 (siFIP200)</td><td>ThermoFisher/Ambion</td><td>s18995</td><td></td></tr><tr><td>משתיק קול בחר siRNA מכוון ULK1 (siULK1)</td><td>ThermoFisher/Ambion</td><td>s15964</td><td></td></tr><tr><td>משתיק קול בחר siRNA ממוקד ULK2 (siULK2)</td><td>ThermoFisher/Ambion</td><td>s18705</td><td></td></tr><tr><td>משתיק קול בחר siRNA ממוקד GABARAP (siGABARAP)</td><td>ThermoFisher/Ambion</td><td>s22362</td><td></td></tr><tr><td>משתיק קול בחר siRNA ממוקד GABARAPL1 (siGABARAPL1)</td><td>ThermoFisher/Ambion</td><td>s24333</td><td></td></tr><tr><td>משתיק קול בחר siRNA ממוקד GABARAPL2 (siGABARAPL2)</td><td>ThermoFisher/Ambion</td><td>s22387</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פוספט מונו-בסיסי דיהידראט (NaH2PO4 ושור; 2H2O)&nbsp;</td><td>Merck-Millipore</td><td>1.06580.1000</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פוספט די-בסיסי דיהידראט (Na2HPO4 &bull; 2H2O) &nbsp;</td><td>Prolabo</td><td>28014.291</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>VWR</td><td>443816T</td><td>10% ריכוז סופי במים; מסנן דרך 0.45 ומיקרו; m מסנן ושומר במקרר למשך חודשים</td></tr><tr><td>Thapsigargin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9033</td><td>מעכב את משאבת SERCA ER Ca2+. להתמוסס ב-DMSO.</td></tr><tr><td>טריטון X-405&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X405</td><td>1% כתם כחול טריפן סופי</td></tr><tr><td>0.4%</td> <td>בדיקות מולקולריות</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין-EDTA (0.25% משקל/נפח טריפסין)</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td>0.01% סופי</td></tr></tbody></table>

לקטט דהידרוגנאז פחמיות וזמינותו — שיטה פשוטה ואמינה לקביעת נפח פעילות פחמיות autophagic בתאים בתרבית

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

תפזורת autophagy מאופיין על ידי פחמיות של חלקים גדולים של הציטופלסמה למבנים כפול/מולטי-membrane הנקרא autophagosomes. כאן מתואר פרוטוקול פשוט לעקוב אחר תהליך זה. יתר על כן, תוצאות טיפוסי ובדיקת ניסיוני של השיטה בתנאים בתדר autophagy מסוגים שונים בתרבית של תאים בתרבית הינם מסופקים. במהלך autophagy בתפזורת, autophagosomes sequester ציטוזול, ובכך גם חלבונים מסיסים cytosolic, לצד אחרים מטען autophagic. LDH הינה יציב מאוד אנזים cytosolic שופע, מסיסים שאינם סלקטיבי. מבודד לתוך autophagosomes. הכמות של LDH פחמיות ולכן משקף את כמות פחמיות autophagic בתפזורת. ביעילות ובדייקנות לקבוע LDH פחמיות בתאים, אנחנו מעסיקים פרוטוקול מבוסס electrodisruption fractionation המפריד ביעילות sedimentable LDH cytosolic, ואחריו מדידה של פעילות אנזימטי sedimentable שברים לעומת דגימות תאים שלמים. Autophagic פחמיות נקבע על ידי הפחתת שיעור sedimentable LDH בתאים לא מטופל מתאי שטופלו בתוך זה. היתרון של LDH פחמיות וזמינותו היא כי זה נותן מדד כמותי פחמיות autophagic של מטענים אנדוגני, לעומת שיטות אחרות גם לערב ביטוי חוץ רחמי של הגששים פחמיות או פרוטאז הכמותיים למחצה ניתוחים הגנה של סמנים autophagy או קולטנים.

באמצעות הפרוטוקול המתואר כאן, נפח פעילות פחמיות autophagic במספר קווים שונים בתרבית של תאים, כולל LAPC4, DU145, Huh7, PNT2A, הלה, VCaP, H3122, Hec1A, MCF-7, T47D, U2OS, PC3, G361, העכבר מתחלקים fibroblasts (MEFs), RPE-1. תאים HEK293, בי ג'יי ו LNCaP נמדדה. פחמיות היה מוערך בתנאים הבזליים (ב מלאה, עשירות בינוני), או בתאים בחריפות ברעב עבור סרום וחומצות אמינו ( פיד ה bona בתדר autophagy תנאי22). התוצאות הראו כי פעילות פחמיות LDH בתנאים הרעבה משתנה בהרחבה על ...

כאן מתואר פרוטוקול המאומת היטב ופשוט למדידת נפח פעילות פחמיות autophagic בתרבית של תאים. השיטה מבוססת על לכימות שחלקן של לקטט דהידרוגנאז (LDH) בחלקים תא sedimentable, לעומת סה כ רמות LDH הסלולר.

לקטט דהידרוגנאז פחמיות וזמינותו — שיטה פשוטה ואמינה לקביעת נפח פעילות פחמיות Autophagic בתאים בתרבית

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האוטופגיה, כגון כיצד מווסתת היווצרות אוטופאגוזומים וכיצד טיפולים ומצבים תאיים שונים משפיעים על אוטופוגיה בתפזורת. היתרון העיקרי בטכניקה זו הוא שהיא מודדת קיבוע מטען אנדוגני. לכן, השיטה ישימה באופן נרחב ואינה תלויה בביטוי יתר מלאכותי או הכנסת בדיקות מטען.ידגימו את ההליך, פאולה סלאי ומורטן לור, דוקטורנטים מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, תאים דבקים בתרבית צלוחיות תרבית רקמה של 75 סנטימטר רבוע באינקובטור לח עם 5% פחמן דו חמצני ב -37 מעלות צלזיוס. אפשרו לתאים לגדול עד שהם מגיעים לשכבת תאים קרובה.לאחר מכן יש לשטוף את התאים בשלושה מיליליטר PBS בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב- pH 7.4. הסר את ה-PBS והחלף אותו בשלושה מיליליטר של 0.25% טריפסין EDTA. דגירה באינקובטור לח עם 5% פחמן דו חמצני ב -37 מעלות צלזיוס, עד שהתאים מתנתקים.לאחר מכן, השעו מחדש את התאים בשבעה מיליליטר של מדיום תרבית המכיל 10% FBS, והעבירו לצינור סטרילי של 50 מיליליטר. בעזרת קצה פיפטה של 0.5 עד 20 מיקרוליטר, העבירו 10 מיקרוליטר של תרחיף תאים לצינור מיקרו-צנטריפוגה המכיל 10 מיקרוליטר טריפן כחול. השתמש באותו קצה פיפטה כדי למלא מיד שקופית תא ספירה ולספור את התאים במונה תאים אוטומטי.לאחר מכן השתמש במדיום תרבית המכיל 10% FBS כדי להכין דילול מתאים של תרחיף התא. באמצעות טכניקות אספטיות, זרעו מיליליטר אחד של תרחיף התאים המדולל לכל באר של צלחת תרבית רקמות של 12 בארות. דגירה בחממה לחה עם 5% פחמן דו חמצני ב-37 מעלות צלזיוס עד להשגת צפיפות התאים הרצויה.בטיפולים הניסיוניים הרצויים השארת קבוצה אחת של בארות לא מטופלות על מנת להגדיר את רמות הרקע של LDH הניתן לשקיעה. שלוש עד ארבע שעות לפני הקציר, הוסף כמות רוויה של מעכב לאחר הקיבוע Bafilomycin A1 לכל באר. דגירה בחממה לחה עם 5% פחמן דו חמצני ב-37 מעלות צלזיוס.בתום תקופת הטיפול אתה שואב כדי לשאוב את המדיום. הוסף 200 מיקרוליטר של תמיסת ניתוק תאים שחוממה מראש ל -37 מעלות צלזיוס לכל באר. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד שהתאים מתנתקים.הוסף 500 מיקרוליטר PBS בטמפרטורת החדר ב-pH 7.4 המכיל 2% BSA לכל באר. בעזרת פיפטה, השעו כל באר עד שלא נראים גושי תאים. לאחר מכן, העבירו מיד את תרחיף התאים בכל באר לצינור מיקרו-צנטריפוגה נפרד בנפח 1.5 מיליליטר על קרח.צנטריפוגה של הצינורות בטמפרטורה של 400 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות כדי לשקוע את התאים. השתמש ביניקה כדי לשאוב היטב את הסופרנטנט, והשאיר את כדורי התא יבשים ככל האפשר. לאחר מכן, הוסף 400 מיקרוליטר של תמיסה המכילה 10% סוכרוז במים טהורים במיוחד לכל צינור.בעזרת פיפטה, השהה מחדש את כדור התא כדי להשיג תרחיף כמעט תא בודד. העבר את המתלה הזה לקובטה אלקטרופורציה של ארבעה מילימטרים. הנח את הקובט באלקטרופורטור גל דעיכה אקספוננציאלי ושחרר פולס חשמלי בודד ב-800 וולט, 25 מיקרופאראד ו-400 אוהם.השתמש בקצה פיפטה חדש כדי להעביר את שיבוש התא לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר המכיל 400 מיקרוליטר של תמיסת סוכרוז פוספט קרה כקרח וערבב קצרות על ידי פיפטינג. חזור על תהליך ההשעיה מחדש, שיבוש חשמלי וערבוב עבור כל דגימה. אם מבצעים את ההליך בפעם הראשונה, הקפידו לוודא שיבוש חשמלי יעיל וסלקטיבי של קרום הפלזמה כמתואר בטקסט.כדי להשיג שברי LDH משוקעים, הסר 550 מיקרוליטר מכל תמיסה מדוללת של שיבוש תאים והעביר אותו לצינור מיקרו-צנטריפוגה של שני מיליליטר משלו המכיל 900 מיקרוליטר של מאגר השעיה קר כקרח עם 0.5% BSA ו-0.01% טווין 20. פיפטה קצרה לערבב. צנטריפוגה בטמפרטורה של 18,000 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך 45 דקות לייצור כדורים המכילים LDH משקע.בעזרת יניקה, שאפו היטב את הסופרנטנט כדי להשאיר את הכדורים יבשים ככל האפשר. אחסן את דגימות ה-LDH המשקעות במינוס 80 מעלות צלזיוס עד שהן מוכנות לניתוח. עבור שברי LDH כוללים, העבירו 150 מיקרוליטר מכל אחד מהתאים המדוללים לשבש את התמיסות לצינור החדש שלו.אחסן אותם במקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס עד שהם מוכנים לניתוח. להפשיר גם את ה-LDH המשקע וגם את סך דגימות ה-LDH על הקרח. לאחר ההפשרה, הוסף 300 מיקרוליטר של מאגר מתלה קר כקרח המכיל 1.5% טריטון X-405 לסך דגימות ה-LDH.סובב את הדגימות על רולר בחדר קר למשך 30 דקות. לאחר מכן, הוסף 750 מיקרוליטר של מאגר מתלה קר כקרח המכיל 1% טריטון X-405 לדגימות ה-LDH המשקעות. השתמש בפיפטה כדי להשעות מחדש את הכדורים עד שהתמיסה תהיה הומוגנית.צנטריפוגה של כל הדגימות בטמפרטורה של 18,000 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות כדי לשקוע פסולת תאית לא מומסת. לאחר השלמת הצנטריפוגה, הניחו את הדגימות על קרח. קבע את רמות ה-LDH בסופרנטנטים באמצעות מבחן אנזימטי קלאסי כמתואר בטקסט או כל אחת מהמגוון הרחב של ערכות זמינות מסחרית.במחקר זה, פעילות הקיבוע האוטופאגי בתפזורת מנוטרת במספר קווי תאים שונים של יונקים. כפי שמוצג כאן, גם תאי ה-LDH הבסיסיים וגם תאי הרעב ותאי ה-LNCaP מבוטלים לחלוטין על ידי מעכב הפאן-PI3-קינאז, 3MA. מעכב PI3-קינאז סלקטיבי Class 3, SAR-405 ומעכב משאבת הסידן ER, Thapsigargin.בתאי HEK293, קיבוע LDH בתנאי רעב מופחת מאוד הן על ידי Thapsigargin והן על ידי מעכב ULK, MRT 67307. יתר על כן, הוכח כי קיבוע LDH המושרה על ידי רעב מעוכב באופן עקבי על ידי 3MA בשורות התאים האחרות שנצפו. לאחר מכן, MEFs שונים של נוקאאוט של גן ATG משמשים כדי לבדוק אם גנים הקשורים לאוטופגיה שדווחו כחיוניים להיווצרות אוטופאגוזום נדרשים לקיבוע LDH.כפי שניתן לראות, קיבוע LDH המושרה על ידי רעב מבוטל ב-ATG5 נוקאאוט MEFS. יתר על כן, הוא קהה גם ב-ATG7 ו-ATG9A נוקאאוט MEF. לבסוף, נקבעות ההשפעות של השתקה בתיווך RNAi של תעתיקי גן ATG מרכזיים.טרנספקציה עם ATG9A המכוון ל-siRNA או עם מיקוד משולב של ULK1 ו-ULK2 נראית כמפחיתה מאוד את קיבוע ה-LDH בתאי LNCaP. בעת ניסיון הליך זה, חשוב להיות מדויק בכל שלבי הפיפטינג. בעקבות הליך זה ניתן לבצע שיטות אחרות כמו בדיקת פירוק חלבון ארוכת טווח על מנת לענות על שאלות נוספות כמו האם נצפו שינויים בפעילות הקיבוע וכתוצאה מכך שינויים דומים בפעילות הפירוק האוטופגי.לאחר ביסוס שיטה זו בשורות תאים של יונקים, השתמשנו בה כדי להדגים כי אוטופגיה בתפזורת אינה תלויה במשפחת החלבונים LC3 ובמקום זאת דורשת GABARAPs. זה מדגיש את החשיבות של שימוש בשיטות עצמאיות LC3 לניטור פעילות האוטופגיה.

the-lactate-dehydrogenase-sequestration-assay-simple-reliable-method

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרטון וידאו זה מתאר בדיקה קולורימטרית למדידת לקטט בליזטים של תאים באמצעות האנזים לקטט דהידרוגנאז. אנזים זה ממיר לקטט לפירובט, יחד עם המרה של NAD ל-NADH שמגיב עם צבעי טטרזוליום ונותן תוצר צבעוני שניתן למדוד ספקטרופוטומטרית כדי לכמת את הלקטט.

בדיקה קולורימטרית לכימות לקטט בדגימות בדיקה

הסרטון מדגים בדיקה להערכת פעילות קיבוע אוטופגית בתפזורת בתאי יונקים. הוא משתמש באלקטרופורציה כדי לשחרר חלבונים ציטוסוליים, כולל לקטט דהידרוגנאז (LDH). שברי ה-LDH המבודדים וה-LDH התאי הכולל נקבעים כדי להעריך את תפיסת ה-LDH, ומספקים תובנות לגבי הפעילות הכוללת של קיבוע בתפזורת.

כימות פעילות קיבוע אוטופגית בתפזורת בתאי יונקים

הנה, cytometry זרימת multispectral הדמיה עם תכונה אנליטית שמשווה תמונות פירוט בהיר של 3 סמנים autophagy ו quantifies שיתוף שלהם לוקליזציה, יחד עם ספירת LC3 ספוט, שימש למדוד autophagy באופן אובייקטיבי, כמותי, סטטיסטית וחסכונית.

הערכת השטף autofagic ידי מדידת LC3, p62, ו LAMP1 Co-localization באמצעות multispectral הדמיה cytometry

Mitophagy, התהליך של פינוי נפגע המיטוכונדריה, הוא הכרחי עבור תחזוקה מיטוכונדריאלי הומאוסטזיס ובריאות. מאמר זה מציג חלק mitophagy האחרונה שיטות זיהוי תאים אנושיים, Caenorhabditis elegansועכברים.

במבחנה and In Vivo זיהוי של Mitophagy ב תאים אנושיים, C. Elegansועכברים

אנו מתארים פרוטוקול זמן התגובה. ממפה את התפוצה המרחבית של אנזימטי לפעילות אנזימים המייצרים nicotinatmide אדנין dinucleotide פוספט (NAD(P)H) + H + ישירות בדגימות רקמה.

מיפוי החומרים: פיקוח על פעילות לקטט דהידרוגנאז ישירות בתוך הרקמה

אנו מתארים את הפרוטוקול שלנו למדידת מקצבים ביולוגיים בקטוליזם חלבונים באמצעות הוראות משוב ושוב בכבד העכבר.

מדידת מקצבים הדיורnal בתצוגה מקדימה של הזרם ופרוטאספאל השטף

מטרת פרוטוקול זה היא לקבוע רמות אוטופגיות בסרטן הלבלב ובתאי אסינר בלבלב באמצעות אימונופלואורסנציה LC3 וכימות נקודות LC3.

הערכת רמות אוטופגיה בשני מודלים שונים של תאי לבלב באמצעות LC3 immunofluorescence

במאמר זה אנו מציגים אוסף של בדיקות למדידה ישירה של תפקוד המיטוכונדריה בתאי יונקים ללא תלות ביכולתם לצרוך חמצן מולקולרי.

בדיקות שאינן תלויות בחמצן למדידת תפקוד המיטוכונדריה ביונקים

כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט לשימוש בבדיקת כתב מבוססת לוציפראז בפורמט סינון חצי אוטומטי, בתפוקה גבוהה.

בדיקת תרופות מבוססות תאים למעכבי אוטופגיה הקשורים לפפטידאז ציסטאין 4B

כאן, אנו מציגים את המתודולוגיה להערכה תמציתית של רמות סמן אוטופגוזום LC3-II בשלפוחיות חוץ-תאיות (EVs) על ידי immunoblotting. ניתוח רמות LC3-II ברכבים חשמליים, היווצרות אוטוליזוזום והיווצרות אומגה מצביע על התפקיד החדש של STX6 בשחרור רכבים חשמליים חיוביים ל-LC3-II כאשר איחוי אוטופגוזום-ליזוזום מעוכב.

הערכה של שחרור LC3-II באמצעות שלפוחיות חוץ-תאיות ביחס להצטברות שלפוחיות חיוביות ל-LC3 תוך תאיות

למדו שיטה לאמידת פעילות אוטופגיה בתאי יונקים באמצעות מדידת רמות LDH בחלקיקים שקועים. הפרוטוקול מספק גישה אמינה לחקר ספיגת מטען אנדוגני ללא שימוש בבדיקות מלאכותיות.

לקטט דהידרוגנאז פחמיות וזמינותו — שיטה פשוטה ואמינה לקביעת נפח פעילות פחמיות Autophagic בתאים בתרבית

גלה סרטונים נוספים