לקטט דהידרוגנאז פחמיות וזמינותו — שיטה פשוטה ואמינה לקביעת נפח פעילות פחמיות Autophagic בתאים בתרבית

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האוטופגיה, כגון כיצד מווסתת היווצרות אוטופאגוזומים וכיצד טיפולים ומצבים תאיים שונים משפיעים על אוטופוגיה בתפזורת. היתרון העיקרי בטכניקה זו הוא שהיא מודדת קיבוע מטען אנדוגני. לכן, השיטה ישימה באופן נרחב ואינה תלויה בביטוי יתר מלאכותי או הכנסת בדיקות מטען.

ידגימו את ההליך, פאולה סלאי ומורטן לור, דוקטורנטים מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, תאים דבקים בתרבית צלוחיות תרבית רקמה של 75 סנטימטר רבוע באינקובטור לח עם 5% פחמן דו חמצני ב -37 מעלות צלזיוס. אפשרו לתאים לגדול עד שהם מגיעים לשכבת תאים קרובה.

לאחר מכן יש לשטוף את התאים בשלושה מיליליטר PBS בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב- pH 7.4. הסר את ה-PBS והחלף אותו בשלושה מיליליטר של 0.25% טריפסין EDTA. דגירה באינקובטור לח עם 5% פחמן דו חמצני ב -37 מעלות צלזיוס, עד שהתאים מתנתקים.

לאחר מכן, השעו מחדש את התאים בשבעה מיליליטר של מדיום תרבית המכיל 10% FBS, והעבירו לצינור סטרילי של 50 מיליליטר. בעזרת קצה פיפטה של 0.5 עד 20 מיקרוליטר, העבירו 10 מיקרוליטר של תרחיף תאים לצינור מיקרו-צנטריפוגה המכיל 10 מיקרוליטר טריפן כחול. השתמש באותו קצה פיפטה כדי למלא מיד שקופית תא ספירה ולספור את התאים במונה תאים אוטומטי.

לאחר מכן השתמש במדיום תרבית המכיל 10% FBS כדי להכין דילול מתאים של תרחיף התא. באמצעות טכניקות אספטיות, זרעו מיליליטר אחד של תרחיף התאים המדולל לכל באר של צלחת תרבית רקמות של 12 בארות. דגירה בחממה לחה עם 5% פחמן דו חמצני ב-37 מעלות צלזיוס עד להשגת צפיפות התאים הרצויה.

בטיפולים הניסיוניים הרצויים השארת קבוצה אחת של בארות לא מטופלות על מנת להגדיר את רמות הרקע של LDH הניתן לשקיעה. שלוש עד ארבע שעות לפני הקציר, הוסף כמות רוויה של מעכב לאחר הקיבוע Bafilomycin A1 לכל באר. דגירה בחממה לחה עם 5% פחמן דו חמצני ב-37 מעלות צלזיוס.

בתום תקופת הטיפול אתה שואב כדי לשאוב את המדיום. הוסף 200 מיקרוליטר של תמיסת ניתוק תאים שחוממה מראש ל -37 מעלות צלזיוס לכל באר. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד שהתאים מתנתקים.

הוסף 500 מיקרוליטר PBS בטמפרטורת החדר ב-pH 7.4 המכיל 2% BSA לכל באר. בעזרת פיפטה, השעו כל באר עד שלא נראים גושי תאים. לאחר מכן, העבירו מיד את תרחיף התאים בכל באר לצינור מיקרו-צנטריפוגה נפרד בנפח 1.5 מיליליטר על קרח.

צנטריפוגה של הצינורות בטמפרטורה של 400 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות כדי לשקוע את התאים. השתמש ביניקה כדי לשאוב היטב את הסופרנטנט, והשאיר את כדורי התא יבשים ככל האפשר. לאחר מכן, הוסף 400 מיקרוליטר של תמיסה המכילה 10% סוכרוז במים טהורים במיוחד לכל צינור.

בעזרת פיפטה, השהה מחדש את כדור התא כדי להשיג תרחיף כמעט תא בודד. העבר את המתלה הזה לקובטה אלקטרופורציה של ארבעה מילימטרים. הנח את הקובט באלקטרופורטור גל דעיכה אקספוננציאלי ושחרר פולס חשמלי בודד ב-800 וולט, 25 מיקרופאראד ו-400 אוהם.

השתמש בקצה פיפטה חדש כדי להעביר את שיבוש התא לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר המכיל 400 מיקרוליטר של תמיסת סוכרוז פוספט קרה כקרח וערבב קצרות על ידי פיפטינג. חזור על תהליך ההשעיה מחדש, שיבוש חשמלי וערבוב עבור כל דגימה. אם מבצעים את ההליך בפעם הראשונה, הקפידו לוודא שיבוש חשמלי יעיל וסלקטיבי של קרום הפלזמה כמתואר בטקסט.

כדי להשיג שברי LDH משוקעים, הסר 550 מיקרוליטר מכל תמיסה מדוללת של שיבוש תאים והעביר אותו לצינור מיקרו-צנטריפוגה של שני מיליליטר משלו המכיל 900 מיקרוליטר של מאגר השעיה קר כקרח עם 0.5% BSA ו-0.01% טווין 20. פיפטה קצרה לערבב. צנטריפוגה בטמפרטורה של 18,000 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך 45 דקות לייצור כדורים המכילים LDH משקע.

בעזרת יניקה, שאפו היטב את הסופרנטנט כדי להשאיר את הכדורים יבשים ככל האפשר. אחסן את דגימות ה-LDH המשקעות במינוס 80 מעלות צלזיוס עד שהן מוכנות לניתוח. עבור שברי LDH כוללים, העבירו 150 מיקרוליטר מכל אחד מהתאים המדוללים לשבש את התמיסות לצינור החדש שלו.

אחסן אותם במקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס עד שהם מוכנים לניתוח. להפשיר גם את ה-LDH המשקע וגם את סך דגימות ה-LDH על הקרח. לאחר ההפשרה, הוסף 300 מיקרוליטר של מאגר מתלה קר כקרח המכיל 1.5% טריטון X-405 לסך דגימות ה-LDH.

סובב את הדגימות על רולר בחדר קר למשך 30 דקות. לאחר מכן, הוסף 750 מיקרוליטר של מאגר מתלה קר כקרח המכיל 1% טריטון X-405 לדגימות ה-LDH המשקעות. השתמש בפיפטה כדי להשעות מחדש את הכדורים עד שהתמיסה תהיה הומוגנית.

צנטריפוגה של כל הדגימות בטמפרטורה של 18,000 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות כדי לשקוע פסולת תאית לא מומסת. לאחר השלמת הצנטריפוגה, הניחו את הדגימות על קרח. קבע את רמות ה-LDH בסופרנטנטים באמצעות מבחן אנזימטי קלאסי כמתואר בטקסט או כל אחת מהמגוון הרחב של ערכות זמינות מסחרית.

במחקר זה, פעילות הקיבוע האוטופאגי בתפזורת מנוטרת במספר קווי תאים שונים של יונקים. כפי שמוצג כאן, גם תאי ה-LDH הבסיסיים וגם תאי הרעב ותאי ה-LNCaP מבוטלים לחלוטין על ידי מעכב הפאן-PI3-קינאז, 3MA. מעכב PI3-קינאז סלקטיבי Class 3, SAR-405 ומעכב משאבת הסידן ER, Thapsigargin.

בתאי HEK293, קיבוע LDH בתנאי רעב מופחת מאוד הן על ידי Thapsigargin והן על ידי מעכב ULK, MRT 67307. יתר על כן, הוכח כי קיבוע LDH המושרה על ידי רעב מעוכב באופן עקבי על ידי 3MA בשורות התאים האחרות שנצפו. לאחר מכן, MEFs שונים של נוקאאוט של גן ATG משמשים כדי לבדוק אם גנים הקשורים לאוטופגיה שדווחו כחיוניים להיווצרות אוטופאגוזום נדרשים לקיבוע LDH.

כפי שניתן לראות, קיבוע LDH המושרה על ידי רעב מבוטל ב-ATG5 נוקאאוט MEFS. יתר על כן, הוא קהה גם ב-ATG7 ו-ATG9A נוקאאוט MEF. לבסוף, נקבעות ההשפעות של השתקה בתיווך RNAi של תעתיקי גן ATG מרכזיים.

טרנספקציה עם ATG9A המכוון ל-siRNA או עם מיקוד משולב של ULK1 ו-ULK2 נראית כמפחיתה מאוד את קיבוע ה-LDH בתאי LNCaP. בעת ניסיון הליך זה, חשוב להיות מדויק בכל שלבי הפיפטינג. בעקבות הליך זה ניתן לבצע שיטות אחרות כמו בדיקת פירוק חלבון ארוכת טווח על מנת לענות על שאלות נוספות כמו האם נצפו שינויים בפעילות הקיבוע וכתוצאה מכך שינויים דומים בפעילות הפירוק האוטופגי.

לאחר ביסוס שיטה זו בשורות תאים של יונקים, השתמשנו בה כדי להדגים כי אוטופגיה בתפזורת אינה תלויה במשפחת החלבונים LC3 ובמקום זאת דורשת GABARAPs. זה מדגיש את החשיבות של שימוש בשיטות עצמאיות LC3 לניטור פעילות האוטופגיה.