Name: לומד Ribonucleotide התאגדות: זיהוי סטרנד ספציפיים של Ribonucleotides הגנום שמרים, מדידה Ribonucleotide-induced מוטגנזה מכוונת (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: למדו שיטות לזיהוי שילוב ריבונוקלאוטידים ב-DNA בשמרים באמצעות אלקטרופורזה בסיסית ובלוטינג סאות'רן. שיטות אלו מאפשרות מדידה מדויקת של יציבות גנומית ומוטגנזה מכוונת במחקר תאי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לכל בהווה ובעבר Kunkel מעבדה החברים על עבודתם, דיונים הקשורים פרוטוקול נתונים שהוצגו כאן לעשות בה שימוש חוזר. עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט Z01 ES065070 כדי T.A.K. של המחלקה של מגזר בחקר המכונים הלאומיים לבריאות (NIH), לאומי המכון למדעי בריאות הסביבה (NIEHS).

1. אלקליין ההידרוליזה וזמינות תספיג דנ ספציפיים סטרנד (איור 1)
<ol><li>צמיחת תאים ובידוד דנ א גנומי<ol>
<li>לבודד שמרים דנ א גנומי באמצעות שמרים ערכת טיהור DNA ההוראות של היצרן. השתמש התרבויות, הן בשלב מעריכית של צמיחה בין (צפיפות אופטית של 0.5) 1. Resuspend בגדר DNA הסופי ב- 35 מ ל 1 x מאגר TE (10 מ מ טריס-HCl, pH 7.5, 1 מ ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA)).</li>
		<li>להוסיף 1 מ"ל של 5 מ"ג/מ"ל RNase של ה-DNA, תקופת דגירה של 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>לזרז את הדנ א באמצעות 0.1 כרכים של 3 מ' סודיום אצטט (pH 5.2) ו- 2.5 בנפחים של 100% אתנול במשך 20 דקות על קרח.</li>
		<li>צנטריפוגה ב 16,000 x g כעשרים דקות ב 4 º C. הסר את תגובת שיקוע באמצעות פיפטה.</li>
		<li>לשטוף את גלולה פעמיים עם 500 מ"ל אתנול 70%. הסר את תגובת שיקוע באמצעות פיפטה.</li>
		<li>יבש בגדר על הספסל, resuspend ב 35 מ ל 1 x מאגר טה.</li>
		<li>Quantitate ה-DNA באמצעות של fluorimeter (טבלה של חומרים) עם dsDNA ערכת BR וזמינותו.</li>
		<li>לזרז 5 מ"ג של ה-DNA של כל דגימה באמצעות 0.1 כרכים של 3 מ' סודיום אצטט, pH 5.2 ו- 2.5 בנפחים של 100% EtOH על הנפח הכולל של 200 מ ל (להוסיף H2O אם הצורך, נוספים 5 מ"ג של ה-DNA נחוצה אם הפקד ג'ל ניטרלי נדרשת). דגירה על קרח למשך 20 דקות.</li>
		<li>צנטריפוגה ב 16,000 x g כעשרים דקות ב 4 º C. הסר את תגובת שיקוע באמצעות פיפטה.</li>
		<li>יבש בגדר על הספסל. Resuspend ה-DNA ב מ 14 ל H2O.</li>
	</ol></li>
	<li>אלקליין ההידרוליזה וזמינות ג'ל אלקטרופורזה<ol>
<li>מוסיפים 6 מ של 1 מ' KOH, דגירה ב 55 מעלות צלזיוס במשך שעתיים.</li>
		<li>דגירה בדגימות בקרח במשך 5 דקות.</li>
		<li>להוסיף מ 4 ל 6 x אלקליין DNA טעינת מאגר: 300 מ מ KOH, 6 מ מ EDTA, pH 8.0, polysucrose 18% (טבלה של חומרים), 0.15% bromocresol ירוק ו- 0.25% קסילן cyanol FF.</li>
		<li>הטיל של ג'ל אלקליין מורכב של 1% agarose, 50 מ מ NaOH, 1 מ מ EDTA, pH 8.0. משתמש במסרק המאפשר 24 מ של דנ א ייטענו לכל ליין</li>
		<li>הפעל את הג'ל בטמפרטורת החדר 1 x אלקטרופורזה אלקליין מאגר: 50 מ מ NaOH, 1 מ"מ EDTA, pH 8.0. לכלול סמן בגודל המתאים של DNA.</li>
		<li>ספין לטמיון בקצרה וטען המדגם כולו mL 24 לתוך הג'ל אלקליין agarose. Electrophorese למשך 30 דקות וחצי V, ואחריו 18-20 h 10 V.</li>
		<li>לנטרל את הג'ל על 2 incubations של 45 דקות כל בטמפרטורת החדר עם עצבנות עדין ניטרול מאגר i: 1 מ' טריס-HCl, 1.5 M NaCl.</li>
		<li>כתם הדנ א למסמס את הג'ל ינוטרלו ב 200 מ של מים המכילים לדילול 1/10,000 הכתם SYBR זהב עבור 2 h בטמפרטורת החדר עם טלטול עדין.</li>
		<li>דמיינו את הדנ א באמצעות transilluminator UV. אלקלי-לרגישות מוגברת גורמת את המראה של שברים DNA קטנים יותר, המציינת את צפיפות גבוהה יותר של ribonucleotides לא מתוקן דנ א5.</li>
	</ol></li>
	<li>העברת בדרום<ol>
<li>להעביר את ה-DNA מ הג'ל אלקליין למוח ניילון הטעון חיובית על ידי נימיות10. דוגמה של איך העברה זו ניתן להגדיר מסופק ידנית, Sambrook, של ראסל10.</li>
		<li>משרים את הג'ל אלקליין למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר במאגר אלקליין העברה: 0.4 M NaOH, 1 M NaCl.</li>
		<li>להרטיב את הקרום ניילון (לחתוך לגודל של הג'ל) לזמן קצר עם מים ולאחר מכן משרים למשך 5 דקות מאגר העברה אלקליין.</li>
		<li>להגדיר את הפלטפורמה העברה על-ידי היפוך זכוכית 3 ספלים (100 מ"ל) בכוס אפייה. מאכל זה צריך להיות מעט גדול יותר מהגודל של הג'ל agarose. הגדר צלחת זכוכית מעל כולם.</li>
		<li>לעטוף 2 חתיכות גדולות של 3 מ מ- CHR-כרומטוגרפיה-נייר (לחתוך לגודל של הרוחב של ג'ל ועוד יותר הצדדים יכול לעטוף פינות לתוך המאגר מאגר) מעל לוח הזכוכית.</li>
		<li>מאגר העברה אלקליין שופכים הנייר כרומטוגרפיה ומלא חצי את צלחת זכוכית. חלקה את הבועות בעזרת פיפטה מזכוכית 5 מ ל.</li>
		<li>מקם את הג'ל agarose עליון, שוב החלקת את הבועות. מקיפים את כל הקצוות של הג'ל עם מצלמות-מיקרוסקופים. יוצקים כמות קטנה של מאגר העברה אלקליין על גבי הג'ל.</li>
		<li>מניחים ניילון טרום רטוב הקרום על גבי הג'ל. חלקה את הבועות.</li>
		<li>רטוב 2 חתיכות של נייר חתוך לגודל של הג'ל agarose. למקם אותם על גבי הקרום, להחליק בועות.</li>
		<li>במקום אוסף גדול של מגבות נייר (קאט לגודל גדול מעט יותר הג'ל agarose) על גבי הכריך העברה. בזהירות המקום צלחת זכוכית מעל מגבות הנייר. הוסף אובייקט משוקלל העליון (ספר עם מסה של 400 גרם עובד היטב).</li>
		<li>. בסדר ההעברה להמשיך ללילה בטמפרטורת החדר</li>
		<li>בזהירות לפרק את הערימה העברה ומשרים את הקרום למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר ניטרול מאגר השנייה: 0.5 M טריס-HCl, pH 7.2, 1 M NaCl.</li>
		<li>Crosslink דנ א קרום ניילון טעונה באמצעות crosslinker UV. הכנס מחדש הקרום, השתמש בהגדרה autocrosslink.</li>
	</ol></li>
	<li>הכנה בדיקה בדרום הערה: הגישה המתוארת כאן כדי לזהות אלקליות רגיש אתרים מובילים המתהווה-לעומת לקרטע-גדיל של הד מבוססת על פרוטוקול פרסם בעבר11. שהניסוי שלנו, הבדיקה מבוצעת על הגן כתב URA3 אשר הוכנס באחד שני כיוונים (OR1 או ניתוח 2) הסמוך מקור שכפול ARS306 על כרומוזום השלישי (איור 3 א). הנוכחות של רגיש אלקליות אתרים ב- DNA גנומי שמרים הוא מחוון התאגדות ribonucleotide, המאפשר את השימוש ribonucleotides כמו סמנים ביולוגיים של ה-DNA פולימראז פעילות12,13,14. גישה זו, באמצעות מטרה רצף ה-DNA סמוך המקור ARS306 יעיל של שכפול, צריך להיות נוטה גנומית מיקומים אחרים, היעד גנים וכן.<ol>
<li>PCR-להגביר 520-בסיס זוג קטע גן מדווח URA3 באמצעות צמד פריימר הבאים: URA3-F1 (5´-GCTACATATAAGGAACGTGCTGC) ו- URA3-R1 (5´-CTTTGTCGCTCTTCGCAATGTC).</li>
		<li>לבצע את התגובה PCR באמצעות 10-20 ng של שמרים DNA גנומי כתבנית, 4 μL של כל פריימר (10 מניות μM), μL 10 של 10 x Ex מאגר Taq (מ ג2 + פלוס), μL 8 תערובת dNTP (2.5 מ מ כל אחד), 0.5 μL של Ex דנ א. אנזימים (U 5/μL) , ולכוונן את העוצמה הסופי כדי μL 100 עם H2O.</li>
		<li>הפעלת התוכנית הבאה של ה-PCR: 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות; מחזורים של 95 מעלות צלזיוס במשך 1 דקה, 55 ° C עבור 1 דקות, 72 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות; 72 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות והחזק ב 4 º C.</li>
		<li>לטהר את מוצר ה-PCR באמצעות ערכת טיהור PCR ו elute ה-DNA באמצעות 50 מ של H2O. זה יכול כעת לשמש כתבנית בתגובה radiolabeling.</li>
		<li>להשתמש את תחל הבאה עבור סטרנד ספציפי radiolabeling: שימוש URA3-A (5´-CTCATCCTAGTCCTGTTGCTGCC) להמחשת DNA anneals כדי בדיקה א זה מקביל הדי גדיל מוביל המתהווה כאשר URA3 ניתוח 2, את tnascent מפגרות גדיל DNA כאשר URA3 OR1. השתמש URA3-B (5´-CAGTACCCTTAGTATATTCTCCAG) להמחשת DNA המתהווה anneals כדי בדיקת B. זה תואם את הדי גדיל מוביל המתהווה כאשר URA3 OR1 ו לקרטע nascent גדיל DNA כאשר URA3 ניתוח 2 (איור 3).<ol>
<li>לבצע את התגובה radiolabeling באמצעות 10-20 ng מוגבר URA3 שבר כמו תבנית ה-DNA, μL 2 פריימר (10 מניות μM), 5 μL של 10 x Ex Taq מאגר (מ ג2 + פלוס), 4 μL של 2.5 מ מ dNTPs (מינוס dCTP), μL 5 (50 μCi) של -32P-dCTP , 0.5 μL של ExTaq ה-DNA פולימראז (5 U μL) ולהתאים את עוצמת הקול הסופי כדי μL 50 עם H2O. בניהול הבאות תוכנית עבור radiolabeling: 94 ° C עבור 5 דקות; 25 מחזורי 94 ° C במשך 1 דקה, 55 ° C ל 30 s, 72 ° C עבור 1 דקות; 72 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות והחזק ב 4 º C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>להשתמש בעמודת ספין G-25 להסיר את התווית רדיואקטיבי טריטוריה. לפני הוספת מדגם radiolabeled, centrifuge את העמודה עבור 1 דקות ב- 720 x מאגר g ולהסיר על-ידי pipetting. לטעון את התגובה radiolabeled המוצר ואת צנטריפוגה למשך 2 דקות ב 720 x g כדי elute את המכשיר עם תוויות.</li>
		<li>דגירה ב 95 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות כדי denature את המכשיר מייד לפני הכלאה. מגניב בקצרה על קרח.</li>
	</ol></li>
	<li>הכלאה בדרום<ol>
<li>לגלגל את הקרום wetted לתוך צינור הכלאה, להוסיף 25 מ ל שזה עתה הוכנו הכלאה המאגר: 0.5 M סודיום פוספט מאגר, pH 7.2, 7% סולפט נתרן dodecyl (מרחביות), 1% אלבומין שור (BSA). דגירה-65 מעלות צלזיוס במשך 1-2 h עם סיבוב בתנור הכלאה.</li>
		<li>בזהירות יוצקים את הפתרון ולהוסיף 25 מ של הכלאה מאגר ובנוסף המכשיר radiolabelled. דגירה-65 מעלות צלזיוס במשך 16-18 h עם סיבוב.</li>
		<li>יוצקים את הפתרון לתוך מיכל פסולת רדיואקטיבית. ביצוע שוטף 5 של 5 דקות כל בטמפרטורת החדר עם פוספט-מרחביות שטיפה פתרון א': 40 מ מ סודיום פוספט מאגר, pH 7.2, 5% מרחביות, BSA 0.5%, 1 מ"מ EDTA, pH 8.0.</li>
		<li>ביצוע שוטף 2 של 15 דקות כל ב 65 ° C עם פוספט-מרחביות שטיפה פתרון II: מאגר סודיום פוספט 40 מ מ, pH 7.2, 1% מרחביות, 1 מ"מ EDTA, pH 8.0.</li>
		<li>הסרת הקרום מהצינור הכלאה באמצעות פינצטה ולמקם נפתח שרוול פלסטיק מגן. מכסה, לחשוף צלחת הדמיה. נסה מספר פעמים ועד 4 h 4 d חשיפה שונות.</li>
		<li>במידת הצורך, חשפנות, בדיקה מחדש את האבן החשופה באמצעות בדיקה שונים כ 3 - 4 פעמים. להתפשט, דגירה הקרום עבור 2 h ב- 65 מעלות צלזיוס ב 25 מיליליטר 50% formamide, 2 x SSPE פתרון. הערה: x SSPE 20 מניות פתרון: 3 M NaCl, 0.2 מ' NaH2PO4, מ 0.02 נקודות EDTA, pH 7.4.</li>
		<li>יוצקים את הפתרון לתוך מיכל פסולת רדיואקטיבית. ביצוע שוטף 2 של 15 דקות כל ב 65 ° C פוספט-מרחביות שטיפה הפתרון השני.</li>
		<li>בדוק את הקרום עם מונה גייגר ' וחזור על פרוטוקול חשפנות, אם האות נשארת.</li>
		<li>מבצעים טרום הכלאה הכלאה כמתואר לעיל.</li>
	</ol></li>
</ol>2. מדידת קצב מוטציה וספציפיות של זנים cerevisiae ס
<ol><li>להכין את התרבות התא<ol>
<li>לחסן מושבה בודדת (שמרים בריא תאים לוקח 2-3 ימים ב- 30 מעלות צלזיוס על טופס מתאים בגודל מושבות) גדל על אגר YPD בתוספת 100 מ"ג/מ"ל אדנין לתוך מ ל מרק YPDA בתוספת 250 מ"ג/מ"ל אדנין (תוספת של אדנין אינו נחוץ רק אם המתח היה הוא auxotroph אדנין). גדלים של חממה בשייקר או על מסובב ב 30 ° C עד התרבות מגיע רוויה (36-48 שעות עבור זן ללא פגם חמור צמיחה).</li>
		<li>ספין למטה התאים ב g x ~ 2000 במשך 5 דקות.</li>
		<li>למחוק את תגובת שיקוע ולשטוף את התאים עם 5 מ ל מים סטריליים.</li>
		<li>Resuspend התאים 500 מ"ל מים סטריליים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>דילול של תרבית תאים, ציפוי<ol>
<li>עבור פקדים ללא בחירה, לדלל את התאים במנת 96-ובכן לפי פקטור של 1,600,000 וצלחת 100 מ של כל תרבות על צלחת מלאה (COM).</li>
		<li>כדי לבחור למוטאנטים ura3 , צלחת 100 מ של תאים מדולל על צלחת 5-דניאל עבור זן (WT) פראי-סוג. לדלל את התאים בהתאם אם קצב מוטציה המתח עניין צפוי להיות גבוה יותר בזן WT.</li>
		<li>כדי לבחור למוטאנטים can1 , לדלל את התאים 5 פי, צלחת 100 מ לצלחת המכילים canavanine (יכול) עבור זן WT. הגורם דילול הוא 0.5.</li>
		<li>דגירה הלוחות ב 30 ° C עד שמרים מושבות טופס. עבור זנים ללא פגם צמיחה, 2-3 ימים מספיקה בדרך כלל עבור COM ויכול צלחות ו- 3-5 ימים עבור לוחות 5-דניאל. כדי להשוות את המחירים מוטציה בין זנים שונים, עדיף לבחור באותו היום של צמיחה לספור מושבות. חנות את הלוחיות מוכן להיספר בחדר הקר (~ 4 ° C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>חישוב קצב מוטציה ספונטנית<ol>
<li>לספור מושבות גלוי שהלוח ולקחת הערות של המושבה מספרים</li>
		<li>לחשב את קצב מוטציה באמצעות נוסחת דרייק: μ = ln ÷ נ (μNt). f הוא תדירות מוטציה מחושב לפי מספר מוטציות מחולק מספר תאים בתרבות הסופי. Nt הוא מספר התאים בתרבות הסופי והוא μ קצב מוטציה. המשוואה הזו ניתן לפתור על ידי שיטה איטרטיבית כגון שיטת ניוטון-רפסון. ישנן שיטות אחרות משערך, כולל הבדיקה לאה, קולסון, כדי לחשב את קצב מוטציה15.</li>
		<li>חישוב מרווח הביטחון בהנחה יומן להתפלגות הנורמלית של שיעור utation של הפרט מבודד. 95% הסמך משמש לרוב.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ניתוח ספקטרום מוטציה<ol>
<li>מושבה בודדת של כל 5-דניאל או יכול צלחת ולרענן על צלחת YPDA.</li>
		<li>לבצע המושבה PCR כדי להגביר את ג'ין URA3 או CAN1 ואת רצף כדי לזהות מוטציות באמצעות תחל את הבאים: URA3-F (5'-CGCATATGTGGTGTTGAAGAA-3') ו URA3-R (5'-TGTGAGTTTAGTATACATGCA-3') עבור שני הגברה PCR ו רצף של הגן URA3 bp 800; CAN1-F (5'-CTTCTACTCCGTCTGCTTTC-3') ו- CAN1-R (5'-CAGAGTTCTTCAGACTTC-3') עבור הגברה ו- CAN1-AR (5'-TGAAATGTGAAGGCAGCGTT-3 "), CAN1-9R (5'-CCTGCAACACCAGTGATA-3'), CAN1-10R (5'-GAGGATGTAACAGGGATGAAT-3') ו- (CAN1-BR 5'-CGGTGTATGACTTATGAGGG-3') עבור רצף של הגן כתב 1800 CAN1 bp.</li>
		<li>כדי לבצע המושבה PCR, resuspend מושבה בודדת ב- 5 μL של H2O ולהשתמש 1 μL כתבנית. להוסיף 1 μL של כל אחד תחל (5 מניות μM), μL 2 מאגר x KAPA2G 5 (מ ג2 + פלוס), 0.5 μL של dNTP (2.5 מ מ), 0.5 μL של KAPA2G מהר DNA פולימראז, μL 12 של H2O.</li>
		<li>עבור ההגברה של URA3 ג'ין, להפעיל את התוכנית הבאה של ה-PCR: 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות; 5 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס במשך 10 s, 61 ° C 15 s, 72 ° C ל 30 s; 35 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס במשך 10 s, 61 ° C 15 s, 72 ° C ל 30 s; 72 מעלות צלזיוס במשך 2 דקות והחזק ב 4 º C. עבור ההגברה של ג'ין CAN1 , להפעיל את התוכנית הבאה של ה-PCR: 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות; 5 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס במשך 10 s, 61 ° C 15 s, 72 מעלות צלזיוס במשך 45 s; 35 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס במשך 10 s, 61 ° C 15 s, 72 מעלות צלזיוס במשך 45 s; 72 מעלות צלזיוס במשך 2 דקות והחזק ב 4 º C.</li>
		<li>יישר את התוצאות רצף לרצף הפניה באמצעות תוכנית כגון DNASTAR Seqman Pro או Sequencher לזיהוי מוטציות.</li>
		<li>לקמפל את הנתונים מוטציות לפי סוג המוטציה (איור 4) או מיקום המוטציה (איור 5). לחשב תעריפי המוטציה תדירות מוטציה (מספר האירועים נצפתה מחולק מספר מוטציות וסודרו) כפול התעריף מוטציה הכללית.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Joyce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choosing+the+right+sugar%3A+how+polymerases+select+a+nucleotide+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Acaddemy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Choosing the right sugar: how polymerases select a nucleotide substrate.</a> Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 94 (5), 1619-1622 (1997).</li>
<li>Nick McElhinny, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abundant+ribonucleotide+incorporation+into+DNA+by+yeast+replicative+polymerases%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Acaddemy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Abundant ribonucleotide incorporation into DNA by yeast replicative polymerases.</a> Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 107 (11), 4949-4954 (2010).</li>
<li>Sparks, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNase+H2-initiated+ribonucleotide+excision+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">RNase H2-initiated ribonucleotide excision repair.</a> Molecular Cell. 47 (6), 980-986 (2012).</li>
<li>Li, Y., Breaker, R. R. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja990592p">Kinetics of RNA Degradation by Specific Base Catalysis of Transesterification Involving the 2'-Hydroxyl Group.</a> Journal of the American Chemical Society. 121 (23), 5364-5372 (1999).</li>
<li>Nick McElhinny, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+instability+due+to+ribonucleotide+incorporation+into+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome instability due to ribonucleotide incorporation into DNA.</a> Nature Chemical Biology. 6 (10), 774-781 (2010).</li>
<li>Williams, J. S., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribonucleotides+in+DNA%3A+origins%2C+repair+and+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Ribonucleotides in DNA: origins, repair and consequences.</a> DNA Repair (Amst). 19, 27-37 (2014).</li>
<li>Williams, J. S., Lujan, S. A., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+ribonucleotides+incorporated+during+eukaryotic+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Processing ribonucleotides incorporated during eukaryotic DNA replication.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (6), 350-363 (2016).</li>
<li>Jones, M. E., Thomas, S. M., Rogers, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luria-Delbruck+fluctuation+experiments%3A+design+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Luria-Delbruck fluctuation experiments: design and analysis.</a> Genetics. 136 (3), 1209-1216 (1994).</li>
<li>Zheng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+practical+guide+to+the+Luria-Delbruck+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Research%22%5BJournal%5D)">A new practical guide to the Luria-Delbruck protocol.</a> Mutat Research. 781, 7-13 (2015).</li>
<li>Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+a+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: a Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).</li>
<li>Miyabe, I., Kunkel, T. A., Carr, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+major+roles+of+DNA+polymerases+epsilon+and+delta+at+the+eukaryotic+replication+fork+are+evolutionarily+conserved%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">The major roles of DNA polymerases epsilon and delta at the eukaryotic replication fork are evolutionarily conserved.</a> PLoS Genetics. 7 (12), e1002407(2011).</li>
<li>Lujan, S. A., Williams, J. S., Clausen, A. R., Clark, A. B., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribonucleotides+are+signals+for+mismatch+repair+of+leading-strand+replication+errors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Ribonucleotides are signals for mismatch repair of leading-strand replication errors.</a> Molecular Cell. 50 (3), 437-443 (2013).</li>
<li>Williams, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topoisomerase+1-mediated+removal+of+ribonucleotides+from+nascent+leading-strand+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Topoisomerase 1-mediated removal of ribonucleotides from nascent leading-strand DNA.</a> Molecular Cell. 49 (5), 1010-1015 (2013).</li>
<li>Clausen, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+replication+enzymology+in+vivo+by+genome-wide+mapping+of+ribonucleotide+incorporation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Tracking replication enzymology in vivo by genome-wide mapping of ribonucleotide incorporation.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 22 (3), 185-191 (2015).</li>
<li>Foster, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+determining+spontaneous+mutation+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Methods for determining spontaneous mutation rates.</a> Methods Enzymology. 409, 195-213 (2006).</li>
<li>Williams, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+processing+of+ribonucleotides+in+DNA+by+topoisomerase+1+is+leading-strand+specific%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Evidence that processing of ribonucleotides in DNA by topoisomerase 1 is leading-strand specific.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 22 (4), 291-297 (2015).</li>
<li>Pavlov, Y. I., Shcherbakova, P. V., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+consequences+of+putative+active+site+mutations+in+yeast+DNA+polymerases+alpha%2C+epsilon%2C+delta%2C+and+zeta%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">In vivo consequences of putative active site mutations in yeast DNA polymerases alpha, epsilon, delta, and zeta.</a> Genetics. 159 (1), 47-64 (2001).</li>
<li>Nick McElhinny, S. A., Kissling, G. E., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+correction+of+lagging-strand+replication+errors+made+by+DNA+polymerases+%7Balpha%7D+and+%7Bdelta%7D%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Acaddemy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Differential correction of lagging-strand replication errors made by DNA polymerases {alpha} and {delta}.</a> Proceedings of the National Acaddemy of Sciences U S A. 107 (49), 21070-21075 (2010).</li>
<li>Clark, A. B., Lujan, S. A., Kissling, G. E., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mismatch+repair-independent+tandem+repeat+sequence+instability+resulting+from+ribonucleotide+incorporation+by+DNA+polymerase+epsilon%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Mismatch repair-independent tandem repeat sequence instability resulting from ribonucleotide incorporation by DNA polymerase epsilon.</a> DNA Repair (Amst). 10 (5), 476-482 (2011).</li>
<li>Lujan, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mismatch+repair+balances+leading+and+lagging+strand+DNA+replication+fidelity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mismatch repair balances leading and lagging strand DNA replication fidelity.</a> PLoS Genetics. 8 (10), e1003016(2012).</li>
<li>Reijns, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+removal+of+ribonucleotides+from+DNA+is+essential+for+mammalian+genome+integrity+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Enzymatic removal of ribonucleotides from DNA is essential for mammalian genome integrity and development.</a> Cell. 149 (5), 1008-1022 (2012).</li>
<li>Lujan, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneous+polymerase+fidelity+and+mismatch+repair+bias+genome+variation+and+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Heterogeneous polymerase fidelity and mismatch repair bias genome variation and composition.</a> Genome Research. 24 (11), 1751-1764 (2014).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

כאן, אנו מתארים את הפרוטוקולים עבור שתי קבוצות של ניסויים המשמשים לעתים קרובות לנתח באופן כמותי למחצה ribonucleotides שולבו במהלך שכפול ה-DNA ואת ההשפעות המוטגניות של ribonucleotides לא מתוקן. למרות גישות אלה כוללות את מודל איקריוטים cerevisiae ס, טכניקות אלו ניתן להתאים בקלות על חיידקים ועל פרוקריוטים גבוהה יותר האחרות.
בודק את ribonucleotides לא מתוקן ב- DNA באמצעות אלקטרופורזה אלקליין agarose בשילוב עם סופג הדרומי מספק מידע חשוב לגבי מספר ribonucleotides נוכח ומלון סטראנד שאליה הם ...

במהלך שכפול ה-DNA הגרעיני האיקריוטים, ribonucleotides משולבים הגנום על ידי כל שלוש הגדולות DNA replicases, אן polymerases (Pols) α, חדוה אלפא1,2. RNase תלויי-H2 ribonucleotide כריתה תיקון (RER3) מסיר את רוב אלה ribonucleotides מוטבע.
Ribonucleotide ב- DNA היא חשופה הידרוליזה, כמו 2' קבוצת הידרוקסיל של moiety הסוכר יכול לתקוף את סמוכים פוספודיאסטרי, שחרור קצה אחד עם 2 - 3' פוספטים מחזורית והשני עם 5'-OH4. תנאי בסיסי מאוד יכולים להאיץ את התגובה הזו. לפיכך, הידרוליזה של ribonucleotides מוטבע במהלך הדגירה בפתרון בסיסי גורם פיצול של הדנ א, אשר ניתן לאבחן על ידי אלקטרופורזה אלקליין agarose5. את הדנ א ניתן להעביר קרום, שנבדק על ידי ניתוח תספיג דנ א באמצעות הגששים סטרנד ספציפיים המאפשרים זיהוי אתרים אלקליות רגיש נגרם על-ידי ribonucleotides משולבים לתוך nascent המובילים - או לקרטע-סטרנד ה-DNA, בהתאמה.
תאי שמרים חסר פעילות RNase H2, הסרה של ribonucleotides יכול להיות יזם כאשר טופואיזומראז (Top1) אני גונבת דנ א ב6,ribonucleotide מוטבע7. עם זאת, כשאתה Top1 cleaves בקצה 3' של ribonucleotide, זה יוצר 5'-הו ומסתיים 2' - 3' פוספט מחזורית DNA כי הם דברים מעוותים religation. כשל תיקון, או חריגה עיבוד קצות אלה' מלוכלך' יכול להוביל אי יציבות גנומית. בנוסף, אם החתך מתבצע בתוך רצף הדנ א. אני חוזר, תהליך התיקון יכול להוביל מוטציות מחיקה. זה בעייתי במיוחד עבור טנדם חוזר, איפה קצר מחיקות (של בין זוגות בסיס וחמש) בדרך כלל שנצפו בתאי RNase H2 לקויה. תלוי Top1-השפעות מזיקות בהיעדרו של שמרים H2 RNase פעילות הם החמירו ב- DNA פולימראז חדוה מוטציה (pol2-M644G) מופקר על התאגדות ribonucleotide במהלך סינתזה גדיל מוביל המתהווה.
עיבוד של ribonucleotides בדנ א מוביל מוטציות ספונטניות, מוטגנזה מכוונת זו ניתן להבחין באמצעות הכתבת המתאימים גנים ובחירה עבור השינוי פנוטיפי הנלווה. מבחן תנודות או ניסוי לוריא, דלבריק הוא אחת השיטות הנפוצות ביותר למדוד את המחירים מוטציה ספונטנית באמצעות כתב לבחירה על ידי גנים8,9. בשמרים, הגנים URA3 , CAN1 יכול לשמש עיתונאים ב וזמינותו מוטציה קדימה, המאפשר איתור כל סוגי מוטציה שתוצאתה אובדן התפקוד ג'ין. קצב מוטציה ספונטנית מוערך כמו החציון של זה נצפתה לגבי תרבויות רבות במקביל החלה מ מושבות יחיד ללא מוטציות בגן כתב היעד. שמרים RNase H2 לקויה זן כגון Δ rnh201יש קצב מוטציה ספונטנית בסך הכל במתינות מוגברות נגרמת בעיקר על ידי שכיחות גבוה של 2-5 מחיקות bp במשולב לחזור על רצפים. לפיכך, לאפיין באופן מלא את ההשפעות המוטגניות של ribonucleotides הגנום, המוטציה המחירים צריך להיקבע. במקרה זה, הגנים כתב URA3 או CAN1 יכול להיות מוגבר וסודרו כדי לקבוע את סוגי והמיקומים של מוטציות ו המוטציה המחירים יכול להיות מחושב. הידור מוטציות. שזוהו מספר מוטציות URA3 או CAN1 עצמאית ואז ניתן ליצור קשת מוטציה.

<table><tbody><tr><td>מדיה</td><td></td><td></td> YPD <td>20 גרם דקסטרוז, 20 גרם פפטון, 10 גרם תמצית שמרים, ב-H2O נטול יונים עד 1 ליטר, הוסף 20 גרם אגר Bacto למדיה מוצקה, חיטוי.</td></tr><tr><td>צלחות</td><td></td><td></td> COM <td>1.3 גרם תערובת נשירה SC, 1.7 גרם בסיס חנקן שמרים ללא חומצות אמינו או (NH4)2SO4, 5 גרם (NH4)2SO4, 20 גרם דקסטרוז, 20 גרם Bacto agar H2O עד 1 ליטר. חיטוי ו-30 &ndash; 35 מ"ל לצלחת.</td></tr><tr><td>צלחות</td><td></td><td></td> CAN <td>1.3 גרם אבקת נשירה SC-Ura, 1.7 גרם בסיס חנקן שמרים ללא חומצות אמינו או (NH4)2SO4, 5 גרם (NH4)2SO4, 20 גרם דקסטרוז, 20 גרם אגר בקטו, 25 מ"ג אוראציל ו-H2O עד 1 ליטר. C ומצננים ל-56&°C. מוסיפים 6 מ"ל של תמיסת קנבנין סולפט 1% מעוקרת בפילטר.</td></tr><tr><td>5-צלחות</td><td></td><td></td> FOA <td>1.3 גרם אבקת נשירה SC-Ura, 1.7 גרם בסיס חנקן שמרים ללא חומצות אמינו או (NH4)2SO4, 5 גרם (NH4)2SO4, 20 גרם דקסטרוז, 20 גרם אגר בקטו, 25 מ"ג אוראציל ו-H2O עד 800 מ"ל. חיטוי למשך 15 דקות ב-121 מעלות; C ומצננים ל 60 & מעלות צלזיוס. הוסף 200 מ"ל של תמיסת 5-FOA מעוקרת מסנן 0.5%.</td></tr><tr><td>L-Canavanine סולפט</td><td>ארה"ב ביולוגי</td><td>C1050</td><td></td></tr><tr><td>5-FOA</td><td>ארה"ב ביולוגי</td><td>F5050</td><td></td></tr><tr><td>20 מ"ל צינור</td><td></td><td></td> תרבית זכוכית <td>כל מותג</td></tr><tr><td>מסובב תרבות ב 30 מעלות; ניתן להשתמש בחממת</td><td></td><td></td><td>שייקר C</td></tr> במקום <tr><td>96 צלחות תחתונות עגולות</td><td></td><td></td> היטב <td>סטריליות, כל מותג</td></tr><tr><td>חרוזי זכוכית 3 מ"מ</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>11-312A</td><td>חיטוי לפני השימוש</td></tr><tr><td>פיפטות</td><td></td><td></td> 12 ערוצים <td>כל מותג</td></tr><tr><td>Ex Taq DNA פולימראז</td><td>TaKaRa</td><td>RR001</td><td></td></tr><tr><td>Epicentre MasterPure שמרים DNA ערכת טיהור</td><td>Epicenter</td><td>MPY80200</td><td></td></tr><tr><td>3 M נתרן אצטט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7899</td><td></td></tr><tr><td>100% אתנול</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>קיוביט 2.0 פלואורומטר</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td>דגם חדש יותר זמין</td></tr><tr><td>dsDNA BR ערכת בדיקה</td><td>Invitrogen</td><td>Q32850</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221473</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>Dot Scientific Inc.</td><td></td><td></td>DSF10400</tr><tr><td>ברומוקרסול ירוק</td><td>איסטמן</td><td>6356</td><td></td></tr><tr><td>קסילן ציאנול FF</td><td>אינטרנשיונל טכנולוגיות בע"מ</td><td>72120</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl (pH 8.0)</td> <td>Teknova</td><td>T5080</td><td></td></tr><tr><td>SYBR זהב חומצת גרעין ג'ל</td><td>כתם Invitrogen</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>מאיר</td><td></td><td></td><td></td>UV</tr><tr><td>אמרשם קרום ניילון Hybond-N +</td> <td>GE Healthcare</td><td>RPN303B</td><td></td></tr><tr><td>3 מ"מ CHR נייר כרומוטוגרפיה</td><td>Whatman</td><td>3030-392</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Caledon</td><td>7560-1</td><td></td></tr><tr><td>Stratalinker 1800</td><td>Stratagene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR ערכת טיהור</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>G-25 עמוד ספין</td><td>GE Healthcare</td><td>27-5325-01</td><td></td></tr><tr><td>1 M מאגר נתרן פוספט (pH 7.2)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>NaH2PO4 (S9638); Na2HPO4 (S9390)</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4522</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47671</td><td></td></tr><tr><td>מונה</td><td></td><td></td><td></td> גייגר</tr></tbody></table>

לומד ribonucleotide התאגדות: זיהוי סטרנד ספציפיים של ribonucleotides הגנום שמרים, מדידה ribonucleotide-induced מוטגנזה מכוונת

Studying Ribonucleotide Incorporation: Strand-specific Detection of Ribonucleotides in the Yeast Genome and Measuring Ribonucleotide-induced Mutagenesis

הנוכחות של ribonucleotides ב DNA גרעיני הוכח להיות מקור של אי יציבות גנומית. היקף ההתאגדות ribonucleotide יכול להיות מוערך על ידי הידרוליזה אלקליין, ג'ל אלקטרופורזה כמו ה-RNA הוא רגישים מאוד הידרוליזה בתנאים אלקליין. זה, בשילוב עם ניתוח תספיג דנ א יכול לשמש כדי לקבוע את המיקום לנטישה לתוך אשר ribonucleotides כבר שילבו. עם זאת, הליך זה היא רק חצי כמותית ולא ניתן רגישים מספיק כדי לזהות שינויים קטנים בתוכן ribonucleotide, למרות סטרנד ספציפיים תספיג חיטוט משפר את הרגישות. כאמצעי של אחת ההשלכות ביולוגי הבולט ביותר של ribonucleotides ב- DNA, מוטגנזה מכוונת ספונטנית ניתן לנתח באמצעות וזמינותו של מוטציה קדימה. באמצעות כתב המתאים גנים, מוטציות נדירות שתוצאתו אובדן התפקוד יכול להיות שנבחרו, הכוללת, המוטציה המחירים נמדד על ידי שילוב הנתונים של תנודות ניסויים עם רצפי DNA של הגן הכתב. וזמינותו תנודות ישימה לבחון מגוון רחב של תהליכים מוטגניות רקע גנטי מסוים או תנאי הגידול.

טיפול ה-DNA גנומי עם אלקליות ואחריו בג'ל אלקליין מאפשרת גילוי חצי כמותית של DNA במבנה השביר עקב שפע ribonucleotides stably incorporated. איור 2 מציג את התמונות ג'ל של שמרים דנ א גנומי מטופלים עם או בלי קו5. גרסה M644L של Pol2, יחידת משנה קטליטי של Polε, הפחיתה את היכולת לשלב ribonucleotides בזמן המוטציה M644G משלבת ribonucleotides יותר מאשר WT פולימראז. כמפורט בפרוטוקול, הג'ל אלקליין נוסף פתור על ידי ניתוח ספציפי סטרנד תספיג דנ א. עם ה...

Ribonucleotides הם בין נוקלאוטידים קאנונית הנפוץ ביותר שולבו הגנום במהלך שכפול ה-DNA הגרעיני האיקריוטים. אם לא כראוי הוסר, ribonucleotides עלול לגרום נזק לדנ א מוטגנזה מכוונת. כאן, אנו מציגים שתי גישות ניסיוניות אשר משמשים כדי להעריך את השפע של השתלבות ribonucleotide הדנ א ואת השפעותיו מוטגניות.

לומד Ribonucleotide התאגדות: זיהוי סטרנד ספציפיים של Ribonucleotides הגנום שמרים, מדידה Ribonucleotide-induced מוטגנזה מכוונת

The presence of ribonucleotides in nuclear DNA has been shown to be a source of genomic instability. The extent of ribonucleotide incorporation can be ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות כמו כמה ריבונוקלאוטידים משולבים ב-DNA גדיל מתהווה, מוביל ומפגר בגנום. למרות ששיטה זו יכולה לספק מידע כמותי ואיכותי לגבי צפיפות ריבונוקלאוטידים בגנום השמרים, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות כגון גנומים של יונקים. אלקטרופורזה של ג'ל אלקליין מספקת תצוגה כמותית למחצה של שילוב ריבונוקלאוטידים בגנום כולו ובכתמים דרומיים ספציפיים לגדיל מאפשרים רגישות וכימות גדולים יותר בלוקוס גנומי ספציפי.כדי להתחיל בהליך זה, הוסף שישה מיקרוליטרים של אשלגן הידרוקסיד מולארי אחד לכל דגימה של DNA גנומי של שמרים טריים ודגירה בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. לאחר שעתיים, דגרו את הדגימות על קרח למשך חמש דקות. לאחר מכן הוסף לכל דגימה ארבעה מיקרוליטרים של 6-6 מאגר טעינת DNA אלקליין.יצקו ג'ל אלקליין המורכב מאחוז אחד של אגרוז, 50 מילי-מולרי נתרן הידרוקסיד ומילימולרית אחת EDTA pH שמונה עם מסרק המאפשר טעינת 24 מיקרוליטר של דגימת DNA לכל נתיב. סובב את צינורות הדגימות בקצרה. טען את כל 24 המיקרוליטרים של כל דגימה לתוך ג'ל האגרוז האלקליין.כלול סמן גודל DNA מתאים. אלקטרופורזה ב -30 וולט למשך 30 דקות. לאחר מכן הורד את המתח ל -10 וולט ואלקטרופורזה למשך 18 עד 20 שעות.למחרת יש לנטרל את הג'ל. טבלו את הג'ל במאגר נטרול אחד ודגרו בטמפרטורת החדר בתסיסה עדינה למשך 45 דקות. החלף את תערובת מאגר הנטרול במאגר טרי.ולדגור עוד 45 דקות. כדי להכתים את ה-DNA, יש להשרות את הג'ל המנוטרל ב-200 מיליליטר מים המכילים דילול של 1 עד 10000 של כתם זהב sybr בטמפרטורת החדר עם ניעור עדין למשך שעתיים. דמיין את ה-DNA באמצעות טרנסמאייטור UV.ה-DNA מהג'ל האלקליין יועבר לקרום ניילון טעון חיובי על ידי פעולה נימית. ראשית יש להשרות את הג'ל האלקליין בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות במאגר העברה אלקליין. לאחר מכן, הרטיבו את קרום הניילון לזמן קצר במים והשרו אותו במאגר העברה אלקליין למשך חמש דקות.הגדר את פלטפורמת ההעברה על ידי היפוך שלוש כוסות זכוכית של 100 מיליליטר בתבנית אפייה מזכוכית הגדולה מעט מגודל ג'ל האגרוז. הניחו צלחת זכוכית על גבי כוסות הזכוכית. עטפו שתי חתיכות גדולות של שלושה נייר כרומטוגרפיה MMCHR מעל לוחית הזכוכית.יוצקים מאגר העברה אלקליין על נייר הכרומטוגרפיה וממלאים חצי את צלחת הזכוכית. החלק את הבועות בעזרת פיפטת זכוכית של חמישה מיליליטר. מניחים מעל את ג'ל האגרוז.שוב, החלקת הבועות. הקיפו את כל קצוות הג'ל בפרפילם. יוצקים כמות קטנה של מאגר העברה אלקליין על הג'ל.מניחים את קרום הניילון הספוג מראש על גבי הג'ל ומחליקים את הבועות. שים שתי חתיכות נייר כרומטוגרפיה חתוכות לגודל ג'ל האגרוז. הניחו אותם על גבי הממברנה והחליקו את כל הבועות.מניחים ערימה גדולה של מגבות נייר על גבי כריך ההעברה ומניחים בזהירות צלחת זכוכית על גבי מגבות הנייר. הוסף חפץ משוקלל למעלה ותן להעברה להמשיך בטמפרטורת החדר למשך הלילה. למחרת, פרק בזהירות את ערימת ההעברה.משרים את הממברנה בטמפרטורת החדר במאגר נטרול שניים למשך 15 דקות. קשר את ה-DNA לקרום הניילון הטעון באמצעות קישור צולב UV. השתמש בהגדרת קישור צולב אוטומטי.לפני תחילת הליך ההכלאה, הכן את הגשושית עם תווית הרדיו כמתואר בפרוטוקול הטקסט. מגלגלים את הממברנה הרטובה לצינור הכלאה ומוסיפים 25 מיליליטר של מאגר הכלאה טרי. דגירה של 65 מעלות צלזיוס עם סיבוב בתנור הכלאה למשך שעה עד שעתיים.שפכו בזהירות את התמיסה והוסיפו 25 מיליליטר של מאגר הכלאה בתוספת הבדיקה. דגירה בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 16 עד 18 שעות עם סיבוב. לאחר מכן, שפכו את התמיסה למיכל פסולת רדיואקטיבית.הוסף תמיסת כביסה STS פוספט אחת לצינור ההכלאה וסובב בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. באופן זה, בצע חמש כביסות של חמש דקות כל אחת עם תמיסת כביסה STS פוספט אחת. לאחר הכביסה החמישית עם תמיסת כביסה STS פוספט אחת, שטפו את הממברנה פעמיים עם תמיסת כביסה STS פוספט, שתיים למשך 15 דקות בכל פעם בחום של 65 מעלות צלזיוס עם סיבוב.השתמש בפינצטה כדי להסיר את הממברנה מצינור ההכלאה ולהניח את הממברנה במגן שרוול פלסטיק פתוח. כסו וחשפו ללוחית הדמיה. במידת הצורך, הפשיטו ובדקו מחדש את הכתם בעזרת בדיקה אחרת.כדי להתפשט, מכסים את הממברנה ב -25 מיליליטר של תמיסת פורממיד 2XSSPE של 50 אחוז ודוגרים בחום של 65 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. שופכים את התמיסה למיכל פסולת רדיואקטיבית. הוסף תמיסת כביסה STS פוספט שתיים לצינור ההכלאה, וסובב בחום של 65 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.בדוק את הממברנה עם מונה גייגר כדי לאשר את היעדר האות לפני ביצוע ההיברידיזציה וההכלאה כפי שהודגם קודם לכן. לתמונות ג'ל אלה יש DNA גנומי של שמרים שטופלו עם או בלי אשלגן הידרוקסיד מראים כי התאים חסרי RNH2 שומרים על יותר ריבונוקלאוטידים בגנום. גרסת M644L של פולימראז 2 מפחיתה את היכולת לשלב ריבונוקלאוטידים בעוד שהמוטציה M644G משלבת יותר ריבונוקלאוטידים מאשר פולימראז מסוג בר.ניתן לחקור עוד יותר ג'ל אגרוז אלקליין על ידי ניתוח כתם דרומי ספציפי לגדיל. בדוגמה זו, הבדיקות מחסלות את גדיל ה-DNA המוביל המתהווה בתוך הגן המדווח URA3 שהוכנס קרוב ל-ARS306 בשני כיוונים מנוגדים. תוצאות מייצגות של כתמים דרומיים באמצעות הבדיקות הספציפיות לגדיל המוביל המתהווה מראות דפוס פיצול DNA הנגרם על ידי מחשוף אלקלי בריבונוקלאוטידים וב-DNA של גדילים מובילים מתהווים בזן מסוג בר ובזנים המבטאים את הגרסאות של פולימראזות אלפא, דלתא ואפסילון המופקרות לשילוב ריבונוקלאוטיד.גרף זה מציג את כימות האות הרדיואקטיבי בשבריר מהסך הכולל בכל נתיב מהכתם הדרומי. בעת ניסיון ההליך, חשוב לזכור תמיד להשתמש ב-DNA מבודד טרי מתאי פנים נעולים. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום תיקון ה-DNA לכמת את הצפיפות והגדיל שלתוכו שולבו ריבונוקלאוטידים על ידי פולימראזות ה-DNA המשכפלות.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ריצוף קצה הידרוליטי או HydEn-seq, על מנת לענות על שאלות נוספות כמו מיקום הריבונוקלאוטידים בגנום. אל תשכח שעבודה עם חומרים רדיואקטיביים עלולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כדי למנוע זיהום של שולחן העבודה והציוד בזמן ביצוע הליך זה.

studying-ribonucleotide-incorporation-strand-specific-detection

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מחקרים גנטיים שמרים יכול להיות מועסק לחקור את הפונקציות מולקולרית תאית של הגנים האנושיים במטבוליזם DNA התאי. מתוארות שיטות לאפיון הגנטי של...

מחקרים גנטיים של חלבונים תיקון דנ&quot;א אנושי באמצעות שמרים כמודל למערכת

רמת המצב היציב של mRNAs הספציפי נקבעת על ידי קצב הסינתזה והריקבון של mRNA. שיעורי השפלה mRNA הגנום או שיעורי הריקבון של mRNAs הספציפי יכולים להימדד על ידי קביעת זמן מחצית חיים mRNA. פרוטוקול זה מתמקד במדידה של שיעורי ריקבון mRNA בSaccharomyces cerevisiae.

מדידת שיעורי ריקבון mRNA ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; שימוש ב<em&gt; Rpb1-1</em&gt; זנים

כאן אנו מציגים שיטה חסכונית להגדרת אינטראקציות כימיות-גנטיות בשמרים ניצנים. הגישה בנויה על טכניקות בסיסיות בביולוגיה מולקולרית של שמרים ומתאימה היטב לחקירה מכניסטית של אוספים קטנים עד בינוניים של כימיקלים וסביבות מדיה אחרות.

מהיר זיהוי של אינטראקציות גנטיות כימיות ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

מוצגת אסטרטגיה ליצירת מוטציות בגנים היסטונים במיקומם האנדוגני ב-Saccharomyces cerevisiae.

ממוקד<em&gt; באתרו</em&gt; גני mutagenesis של היסטון שמרים הנץ

כאן נתאר שיטה לבצע בו זמנית quantitate ואת ribonucleotides מפה הגנום כולו ב- DNA מאוד שלם ברזולוציה נוקלאוטיד יחיד, המשלב המחשוף אנזימטי של דנ א גנומי עם הידרוליזה אלקליין שלה סוף-5´ הבאים . רצף.

מיפוי בו זמנית, כימות של Ribonucleotides ב- DNA מיטוכונדריאלי אנושי

תקנה translational ממלא תפקיד חשוב בבקרה על שפע חלבונים. כאן, אנו מתארים שיטה תפוקה גבוהה לניתוח כמותי של תרגום שמרים ניצני האפייה.

הגנום כולו כימות של תרגום ניצני שמרים על-ידי יצירת פרופיל ריבוזום

הפרוטוקול המתואר כאן מבוסס על כימות ברמת הגנום של mRNA החדש מסונתז מטוהרים מתאי שמרים עם 4-thiouracil תוויות. שיטה זו מאפשרת למדוד את סינתזת mRNA חשיפות מהשחתה mRNA ומספק, לפיכך, מדידה מדויקת של RNA פולימראז II שעתוק.

שמר האפייה מטבולית תיוג עם 4-thiouracil, כימות של לאחרונה מסונתז mRNA כמדד לפעילות RNA פולימראז II

הציגו כאן הם ארבעה פרוטוקולים כדי לבנות ולנצל שמרים סכביסים כתבת הכתב כדי לחקור את הפוטנציאל האנושי P53 transactivation הפעלה, השפעות של מוטציות הקשורות לסרטן השונים שלה, שיתוף הביע אינטראקציה חלבונים, ו ההשפעות של מולקולות קטנות ספציפיות.

שמרים כתושבת לפיתוח Assays פונקציונלי ללמוד אנושי האדם

כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור הפצילות תלויי-RNA של רנ א. זה מאפשר ניתוח מהיר ותלוי האתר של RNA 2 '-או-מתילציה. גישה זו יכולה לשמש להערכה ראשונית או מרכזית של פעילות הסנחנה.

ניתוח מותנה של rRNA 2 '-או-מתילציה

פרוטוקול זה מתאר תסה לא רדיואקטיבית כדי למדוד פעילות קינאז של קינאז פולינוקלאוטיד (PNKs) על מצעי DNA ו RNA קטנים.

תרגום לא רדיואקטיבי למדוד פוספורילציה פולינוקלאוטיד של מצעי נוקלאוטיד קטנים

אנו מתארים שני פרוטוקולים משלימים לקביעה מדויקת של משך שלב ה-S ב-S. cerevisiae באמצעות EdU, אנלוגי של תימידין, המשולב ב-vivo ומזוהה באמצעות כימיה של קליק על ידי מיקרוסקופיה וציטומטריית זרימה. היא מאפשרת אפיון קל של משך שכפול הדנ"א והתעלמות מפגמי שכפול במוטציות.

קביעת משך שלב S באמצעות שילוב 5-אתיניל-2'-דאוקסיורידין בסקרומיצס cerevisiae

למדו שיטות לזיהוי שילוב ריבונוקלאוטידים ב-DNA בשמרים באמצעות אלקטרופורזה בסיסית ובלוטינג סאות'רן. שיטות אלו מאפשרות מדידה מדויקת של יציבות גנומית ומוטגנזה מכוונת במחקר תאי.

לומד Ribonucleotide התאגדות: זיהוי סטרנד ספציפיים של Ribonucleotides הגנום שמרים, מדידה Ribonucleotide-induced מוטגנזה מכוונת

גלה סרטונים נוספים