לומד Ribonucleotide התאגדות: זיהוי סטרנד ספציפיים של Ribonucleotides הגנום שמרים, מדידה Ribonucleotide-induced מוטגנזה מכוונת
26 ביולי 2018
Ribonucleotides הם בין נוקלאוטידים קאנונית הנפוץ ביותר שולבו הגנום במהלך שכפול ה-DNA הגרעיני האיקריוטים. אם לא כראוי הוסר, ribonucleotides עלול לגרום נזק לדנ א מוטגנזה מכוונת. כאן, אנו מציגים שתי גישות ניסיוניות אשר משמשים כדי להעריך את השפע של השתלבות ribonucleotide הדנ א ואת השפעותיו מוטגניות.
שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות כמו כמה ריבונוקלאוטידים משולבים ב-DNA גדיל מתהווה, מוביל ומפגר בגנום. למרות ששיטה זו יכולה לספק מידע כמותי ואיכותי לגבי צפיפות ריבונוקלאוטידים בגנום השמרים, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות כגון גנומים של יונקים. אלקטרופורזה של ג'ל אלקליין מספקת תצוגה כמותית למחצה של שילוב ריבונוקלאוטידים בגנום כולו ובכתמים דרומיים ספציפיים לגדיל מאפשרים רגישות וכימות גדולים יותר בלוקוס גנומי ספציפי.
כדי להתחיל בהליך זה, הוסף שישה מיקרוליטרים של אשלגן הידרוקסיד מולארי אחד לכל דגימה של DNA גנומי של שמרים טריים ודגירה בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. לאחר שעתיים, דגרו את הדגימות על קרח למשך חמש דקות. לאחר מכן הוסף לכל דגימה ארבעה מיקרוליטרים של 6-6 מאגר טעינת DNA אלקליין.
יצקו ג'ל אלקליין המורכב מאחוז אחד של אגרוז, 50 מילי-מולרי נתרן הידרוקסיד ומילימולרית אחת EDTA pH שמונה עם מסרק המאפשר טעינת 24 מיקרוליטר של דגימת DNA לכל נתיב. סובב את צינורות הדגימות בקצרה. טען את כל 24 המיקרוליטרים של כל דגימה לתוך ג'ל האגרוז האלקליין.
כלול סמן גודל DNA מתאים. אלקטרופורזה ב -30 וולט למשך 30 דקות. לאחר מכן הורד את המתח ל -10 וולט ואלקטרופורזה למשך 18 עד 20 שעות.
למחרת יש לנטרל את הג'ל. טבלו את הג'ל במאגר נטרול אחד ודגרו בטמפרטורת החדר בתסיסה עדינה למשך 45 דקות. החלף את תערובת מאגר הנטרול במאגר טרי.
ולדגור עוד 45 דקות. כדי להכתים את ה-DNA, יש להשרות את הג'ל המנוטרל ב-200 מיליליטר מים המכילים דילול של 1 עד 10000 של כתם זהב sybr בטמפרטורת החדר עם ניעור עדין למשך שעתיים. דמיין את ה-DNA באמצעות טרנסמאייטור UV.
ה-DNA מהג'ל האלקליין יועבר לקרום ניילון טעון חיובי על ידי פעולה נימית. ראשית יש להשרות את הג'ל האלקליין בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות במאגר העברה אלקליין. לאחר מכן, הרטיבו את קרום הניילון לזמן קצר במים והשרו אותו במאגר העברה אלקליין למשך חמש דקות.
הגדר את פלטפורמת ההעברה על ידי היפוך שלוש כוסות זכוכית של 100 מיליליטר בתבנית אפייה מזכוכית הגדולה מעט מגודל ג'ל האגרוז. הניחו צלחת זכוכית על גבי כוסות הזכוכית. עטפו שתי חתיכות גדולות של שלושה נייר כרומטוגרפיה MMCHR מעל לוחית הזכוכית.
יוצקים מאגר העברה אלקליין על נייר הכרומטוגרפיה וממלאים חצי את צלחת הזכוכית. החלק את הבועות בעזרת פיפטת זכוכית של חמישה מיליליטר. מניחים מעל את ג'ל האגרוז.
שוב, החלקת הבועות. הקיפו את כל קצוות הג'ל בפרפילם. יוצקים כמות קטנה של מאגר העברה אלקליין על הג'ל.
מניחים את קרום הניילון הספוג מראש על גבי הג'ל ומחליקים את הבועות. שים שתי חתיכות נייר כרומטוגרפיה חתוכות לגודל ג'ל האגרוז. הניחו אותם על גבי הממברנה והחליקו את כל הבועות.
מניחים ערימה גדולה של מגבות נייר על גבי כריך ההעברה ומניחים בזהירות צלחת זכוכית על גבי מגבות הנייר. הוסף חפץ משוקלל למעלה ותן להעברה להמשיך בטמפרטורת החדר למשך הלילה. למחרת, פרק בזהירות את ערימת ההעברה.
משרים את הממברנה בטמפרטורת החדר במאגר נטרול שניים למשך 15 דקות. קשר את ה-DNA לקרום הניילון הטעון באמצעות קישור צולב UV. השתמש בהגדרת קישור צולב אוטומטי.
לפני תחילת הליך ההכלאה, הכן את הגשושית עם תווית הרדיו כמתואר בפרוטוקול הטקסט. מגלגלים את הממברנה הרטובה לצינור הכלאה ומוסיפים 25 מיליליטר של מאגר הכלאה טרי. דגירה של 65 מעלות צלזיוס עם סיבוב בתנור הכלאה למשך שעה עד שעתיים.
שפכו בזהירות את התמיסה והוסיפו 25 מיליליטר של מאגר הכלאה בתוספת הבדיקה. דגירה בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 16 עד 18 שעות עם סיבוב. לאחר מכן, שפכו את התמיסה למיכל פסולת רדיואקטיבית.
הוסף תמיסת כביסה STS פוספט אחת לצינור ההכלאה וסובב בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. באופן זה, בצע חמש כביסות של חמש דקות כל אחת עם תמיסת כביסה STS פוספט אחת. לאחר הכביסה החמישית עם תמיסת כביסה STS פוספט אחת, שטפו את הממברנה פעמיים עם תמיסת כביסה STS פוספט, שתיים למשך 15 דקות בכל פעם בחום של 65 מעלות צלזיוס עם סיבוב.
השתמש בפינצטה כדי להסיר את הממברנה מצינור ההכלאה ולהניח את הממברנה במגן שרוול פלסטיק פתוח. כסו וחשפו ללוחית הדמיה. במידת הצורך, הפשיטו ובדקו מחדש את הכתם בעזרת בדיקה אחרת.
כדי להתפשט, מכסים את הממברנה ב -25 מיליליטר של תמיסת פורממיד 2XSSPE של 50 אחוז ודוגרים בחום של 65 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. שופכים את התמיסה למיכל פסולת רדיואקטיבית. הוסף תמיסת כביסה STS פוספט שתיים לצינור ההכלאה, וסובב בחום של 65 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
בדוק את הממברנה עם מונה גייגר כדי לאשר את היעדר האות לפני ביצוע ההיברידיזציה וההכלאה כפי שהודגם קודם לכן. לתמונות ג'ל אלה יש DNA גנומי של שמרים שטופלו עם או בלי אשלגן הידרוקסיד מראים כי התאים חסרי RNH2 שומרים על יותר ריבונוקלאוטידים בגנום. גרסת M644L של פולימראז 2 מפחיתה את היכולת לשלב ריבונוקלאוטידים בעוד שהמוטציה M644G משלבת יותר ריבונוקלאוטידים מאשר פולימראז מסוג בר.
ניתן לחקור עוד יותר ג'ל אגרוז אלקליין על ידי ניתוח כתם דרומי ספציפי לגדיל. בדוגמה זו, הבדיקות מחסלות את גדיל ה-DNA המוביל המתהווה בתוך הגן המדווח URA3 שהוכנס קרוב ל-ARS306 בשני כיוונים מנוגדים. תוצאות מייצגות של כתמים דרומיים באמצעות הבדיקות הספציפיות לגדיל המוביל המתהווה מראות דפוס פיצול DNA הנגרם על ידי מחשוף אלקלי בריבונוקלאוטידים וב-DNA של גדילים מובילים מתהווים בזן מסוג בר ובזנים המבטאים את הגרסאות של פולימראזות אלפא, דלתא ואפסילון המופקרות לשילוב ריבונוקלאוטיד.
גרף זה מציג את כימות האות הרדיואקטיבי בשבריר מהסך הכולל בכל נתיב מהכתם הדרומי. בעת ניסיון ההליך, חשוב לזכור תמיד להשתמש ב-DNA מבודד טרי מתאי פנים נעולים. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום תיקון ה-DNA לכמת את הצפיפות והגדיל שלתוכו שולבו ריבונוקלאוטידים על ידי פולימראזות ה-DNA המשכפלות.
בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ריצוף קצה הידרוליטי או HydEn-seq, על מנת לענות על שאלות נוספות כמו מיקום הריבונוקלאוטידים בגנום. אל תשכח שעבודה עם חומרים רדיואקטיביים עלולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כדי למנוע זיהום של שולחן העבודה והציוד בזמן ביצוע הליך זה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג גישות ניסיוניות להערכת שילוב של ריבנוקלאוטידים ב-DNA במהלך שכפול DNA גרעיני של איקריוטים. הוא מדגיש את ההשפעות המוטגניות הפוטנציאליות של ריבנוקלאוטידים במידה ואינם מוסרים כראוי.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- שכפול DNA
- יציבות גנומית
- מוטגנזה
רקע
- ריבונוקלאוטידים הם נוקלאוטידים לא קנוניים המצויים ב-DNA.
- הם עלולים להוביל לנזק ל-DNA אם לא יוסרו.
- הבנת שילובם חיונית לשמירה על השלמות הגנומית.
- יש צורך בשיטות לכימות השילוב של ריבונוקלאוטידים.
מטרת המחקר
- לכימות שילוב של ריבנוקלאוטידים ב-DNA.
- להערכת ההשפעות המוטגניות של ריבנוקלאוטידים.
- לפיתוח שיטות הישימות למערכות גנומיות שונות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- אלקטרופורזה של ג'ל בסיסי לאנליזה חצי-כמותית.
- סאת'רן בלוטינג (Southern blotting) ספציפי לגדיל לצורך כימות רגיש.
- שימוש בטיפול במי פוטסיום הידרוקסיד עבור דגימות DNA.
- אינקובציה בטמפרטורות מבוקרות לקבלת תוצאות אופטימליות.
תוצאות עיקריות
- נתונים כמותיים על השילוב של ריבנוקלאוטידים ב-DNA של שמרים.
- השוואה של השילוב בחוט המוביל ובחוט המפגר.
- תובנות לגבי הפוטנציאל המוטגני של ריבנוקלאוטידים.
- היתכנות של יישום השיטות על גנומים של יונקים.
מסקנות
- ריבונוקלאוטידים מהווים סיכון ליציבות הגנומית.
- השיטות שפותחו יעילות לכימות ההטמעה.
- לממצאים יש השלכות על הבנת מנגנוני הנזק ל-DNA.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הטמעה של ריבונוקלאוטידים ב-DNA גנומי מהווה מקור לחוסר יציבות שעלול להכשיל מאמצים של תיקוף מטרות וזיהוי מובילים בתהליכי גילוי תרופות. כימות של הטמעה זו מאפשר הפחתת סיכונים מנגנונית על ידי הבהרת מקורות של מוטגנזה ספונטנית שעלולה להסוות קשרים בין פנוטיפ לגנוטיפ במודלים פרה-קליניים. יכולת זו תומכת בביטחון חיזוי בשלבי גילוי מוקדמים על ידי הבחנה בין אותות טיפוליים אמיתיים לבין ארטיפקטים של נזקי DNA.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן האם הפנוטיפים שנצפו נובעים ממודולציה של המטרה המיועדת או מנזק ל-DNA המושרה על ידי ריבונוקלאוטידים.
- ערך תפעולי: מספק כימות ספציפי לגדיל כדי להפחית סיכונים בהיפותזות לגבי תפקוד גנים במערכות סריקה מבוססות שמרים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מאפשר הכנה של זני שמרים איזוגניים עם רמות ריבנוקלאוטידים מוגדרות לצורך רקעי בדיקה עקביים.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה לבקרת איכות של DNA גנומי כדי להפחית שונות בבדיקות תנודה (fluctuation assays) ובתיקוף של גנים מדווחים (reporter genes).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מודד שיעורי מוטגנזה המושרים על ידי ריבנוקלאוטידים כדי להעריך את היציבות הגנטית של מערכות רלוונטיות למחלה לאורך תרבית ממושכת.
- ערך תפעולי: תומך בניטור אורך של שלמות הגנום במודלים פרה-קליניים המשמשים לאופטימיזציה של תרופות מובילות.
שילוב תהליכי עבודה (Pipeline & Workflow)
השיטה משתלבת בתהליכי עבודה של גילוי מוקדם, שבהם תיקוף המטרה מחייב רקעים גנטיים נקיים, בייחוד בעת שימוש במודלים של שמרים לחקירת מסלולים או לסריקה פנוטיפית.
- ביולוגיה של גילוי: מבהיר האם שילוב של ריבנוקליאוטידים תורם למוטגנזה של רקע בבדיקות תנודה המשמשות לתיקוף מטרות.
- סריקה: מבטיח עקביות של ריאגנטים על ידי הסמכה של דגימות DNA המשמשות לתיקוף של מבנים גנטיים המבוסס על Southern blot.
- אנליטיקה: מייצר נתונים כמותיים ספציפיים לגדיל המאפשרים השוואה בין וריאנטים של פולימראז או רקעים גנטיים במסעות לזיהוי מובילים.
- מחקר תרגומי: עוקב אחר מדדי יציבות גנומית המנחים קידום מותאם סיכון משלבי hit-to-lead.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס נקודת בקרה (QC) לשימוש חוזר עבור שלמות של DNA גנומי בפנימיות גילוי מרובות המבוססות על שמרים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית על ידי כימות של מקור ידוע למוטגנזה ספונטנית בסריקות גנטיות.
- ערך תפעולי: מציג סטנדרטיזציה להכנת דגימות DNA המשפרת את השחזוריות במבחני תנודה (fluctuation assays) ובסאות'רן בלוטינג (southern blotting).
- ערך אסטרטגי: מגביר את הביטחון בקבלת החלטות go/no-go על ידי בקרה של גורמים מתבלבלים של נזקי DNA בנתוני תיקוף של מטרות.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכון על ידי סימון מודלים עם רמות ריבנוקלאוטידים מוגברות שעשויות לדרוש אסטרטגיות הפחתה.
שיקולי יישום
- מומחיות בטיפול בחומצות גרעיניות, בטכניקות של גששים רדיואקטיביים ובהיברידיזציה של southern blot.
- ציוד לאלקטרופורזה של ג'ל בסיסי, UV cross-linker ומכשיר phosphorimager לזיהוי אותות.
- פרוטוקולים סטנדרטיים לטיפול ב-potassium hydroxide, ניטרול והעברה לממברנה כדי להבטיח עקביות בין מעבדות.
- שיקולי התאמה כוללים אופטימיזציה של עיצוב הגשש עבור לוקוסים גנומיים שונים והתאמת זמני הידרוליזה לאיכויות משתנות של דגימות DNA.
- מגבלות מעשיות כוללות את האופי החצי-כמותי של ג'לים בסיסיים ללא southern blotting וסיכונים הקשורים לחומרים רדיואקטיביים הדורשים טיפול ייעודי בפסולת.
