ביטוי של חלבונים פיוז'ן פלואורסצנט תאים דנדריטים הנגזרות מח עצם מאתר ו מקרופאגים

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומים של מקרופאג וביולוגיה של תאים דנדריטיים על לוקליזציה תת-תאית ודינמיקה של חלבונים שונים בסוגי תאים אלה. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא פשוטה יחסית, זולה, ומדגימה יעילות ויציבות ביטוי טובות יותר מרוב השיטות הזמינות האחרות. הפגנת ההליך תהיה ג'רמילה קרלובה, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלי.

כדי לייצר את הרטרווירוס, צלחת השעיה חד-תאית של תאי אריזה אקולוגית פלטינה בצלחת פטרי 10 ס"מ ולטפח את התאים ב 15 מיליליטר של DMEM, בתוספת 10% סרום בקר עוברי, או FBS, עד התרבות היא 50 עד 60% confluent. למחרת, להוסיף 20 מיקרוגרם של המבנה רטרו-ויראלי של עניין ו 10 מיקרוגרם של וקטור אריזה אקולוגית PCL ל 1 מיליליטר של DMEM ללא סרום, עם ערבוב עדין. הוסף 75 microliters של PEI ב 1 מיליליטר של DMEM ללא סרום ואנטיביוטיקה לצינור השני עבור דגירה חמש דקות בטמפרטורת החדר, ומערבבים את התוכן של שני הצינורות יחד עבור דגירה נוספת 10 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, החליפו בזהירות את המדיום בתאי פלטינום אקו ב-8 מיליליטר של DMEM טרי של 37 מעלות צלזיוס בתוספת 2%FBS והוסיפו בזהירות את תערובת ההטרנספיה בטיפות לצלחת. לאחר דגירה של 4 שעות ב-37 מעלות צלזיוס, החליפו את העל-טבעי ב-10 מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס DMEM, בתוספת 10% FBS עבור דגירה של 24 שעות ב-37 מעלות צלזיוס. למחרת, להשתמש פיפטה 5 מיליליטר כדי להעביר את החלקיק רטרו-ויראלי ecotropic המכיל על טבעי לצינור צנטריפוגה 15 מיליליטר ולהסיר את הפסולת המכיל תאים על ידי צנטריפוגה.

בינתיים, הוסיפו 10 מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס DMEM ועוד 10% FBS לצלחת התרבות לעוד דגירה של 24 שעות ב-37 מעלות צלזיוס ואספו סיבוב שני של חלקיקים נגיפיים כפי שהודגם זה הרגע. כדי לקצור את מח העצם, במכסה המנוע של תרבות הרקמה, השתמש בפינצטה ומספריים כדי להסיר את העור וחלק מהשרירים מהגפיים האחוריות ולנתק בזהירות את האצטבולום ממפרק הירך מבלי לשבור את עצם הירך. חותכים את הכפות במפרקי הקרסול ומרססים את העצמות עם 70% אתנול.

לאחר מכן להסיר את שאר השריר עם מגבת נייר ומניחים את העצמות בצלחת פטרי 5 ס"מ של PBS בתוספת 2%FBS. לאחר מכן, לכופף את מפרק הברך של כל סט עצם בזהירות להפריד את העצמות עם מספריים. השתמש במספריים כדי להסיר על אחד עד שני מילימטרים של כל epiphysis של עצם אחת ולהשתמש מזרק שניים או חמישה מיליליטר מצויד מחט 30 מד טעון עם PBS טרי בתוספת FBS כדי לשטוף את מח העצם משני קצות העצם לתוך צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר.

כאשר מח העצם נאסף מכל אחת מהעצמות, גלולה תאי העצם על ידי צנטריפוגה מחדש להשעות את גלולה ב 2.5 מיליליטר של חיץ תמוגה תא דם אדום במשך שתיים עד שלוש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר lysing, לסנן את התאים דרך מסננת תאים 100 מיקרומטר לתוך צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר חדש ולשחזר את העקשנות עם 12 מיליליטר של PBS בתוספת FBS. להשעות מחדש את גלולה ב DMEM, בתוספת 10%FBS ואנטיביוטיקה לספירה צלחת חמש עד 10 פעמים 10 לתאי מח העצם השישי ב 10 ס"מ, תרבות שאינה רקמה מטופלים צלחת פטרי ב 10 מיליליטר של DMEM בתוספת סרום ומושבת מקרופאג מגרה גורם, או MCSF.

ביום החמישי לתרבות, להטות בזהירות את צלחת תרבות התא ולהסיר את כל אבל כ 5 מיליליטר של מדיום מפני השטח ליד קצה המנה. לאחר מכן הוסיפו 20 מיליליטר של מדיום טרי של 37 מעלות צלזיוס בתוספת FBS ו- MCSF לצלחת והחזירו את התאים לחממת תרבות התאים. כדי לקצור את התאים, ביום שש עד שבע, להסיר את כל התאים הבינוניים וצפים ולשטוף את התרבות עם 37 מעלות צלזיוס PBS.

נתק את התאים החסידיים עם חמישה מיליליטר של 0.02%EDTA ו- PBS למשך שלוש עד חמש דקות ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור תרמת הרקמה ולהשתמש בפיפטה של חמישה מיליליטר כדי לשטוף בעדינות את התאים המנותקים מתחתית הלוח. ואז להעביר את התאים לצינור צנטריפוגה 50 מיליליטר המכיל 25 מיליליטר של PBS טרי. כדי לגרום EGFP מתויג ביטוי חלבון במח העצם נגזר אנטיגן מציג תאים, בתחילת פרוטוקול בידול התא, לדלל את תאי מח העצם פעמיים עד חמש פעמים 10 לתאים השישי למיליליטר של DMEM בתוספת FBS ואנטיביוטיקה conentration צלחת התאים של מיליליטר אחד של בינוני ל הבאר, בתוספת ציטוקינים ההידול המתאים.

לאחר ארבע עד שש שעות באינקובטור תרבות התא, להוסיף שני מיליליטר של הסיבוב הראשון של הנגיף שנאסף בתוספת פוליברן ולתמר את תרבות התא על ידי צנטריפוגה אינקובציה ארבע שעות באינקובטור תרבות התא. בסוף תקופת ההעתקה, להעביר את התאים הלא עקביים מכל באר לתוך צינורות צנטריפוגה בודדים 15 מיליליטר ולאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה. אם יש צורך בכמות גדולה יותר של תאים, התאים יכולים להיות נגועים באותם חסרונות בארות מרובות ומאגר לפני ההידול.

ואז להשעות מחדש את כדורי 10 מיליליטר של מדיום תרבות בתוספת ציטוקינים ההבחנה המתאימה צלחת התאים על אחד 10 ס"מ לא רקמה תרבות מטופלים צלחת פטרי לכל צינור, עבור תרבות שישה עד שמונה ימים שלהם, כפי שהודגם רק. הערכה של היעילות של פלטינום אקו transfection על ידי cytometry זרימה לאחר האוסף של הנגיף השני המכיל על טבעי מגלה יעילות transfection ממוצע של 62%עבור PSTPIP2-EGFP ו 53%עבור OPAL1-EGFP. התברות רטרו-ויראלית אינה משפיעה על מצב ההידול של תאי מח העצם המופקים עם יותר מ -90% מהתאים בשתי התרבויות המדגימים חיוביות עבור סמנים בהתאמה שלהם לאחר ההעתקה עם כל אחד מהווירוסים.

ועם השינויים המורפולוגיים המתאימים והמאפיינים שנצפו עבור שני סוגי התאים המובחנים. שימו לב, הביטוי הכולל של EGFP היה נמוך יותר בתרבויות תאים דנדריטיים שמקורם במח העצם בהשוואה לביטוי EGFP שמקורו במח העצם, ללא קשר לסוג הרטרווירוס. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להשתמש במנות פלסטיק שאינן רקמה, תרבות מטופלות המשמשות בדרך כלל לטיפוח חיידקים אם אתם מתכננים להסיר תאים מהצלחת לניסוי.

בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בשיטות אחרות להדמיית תאים חיים, מיקרוסקופיה ברזולוציית-על או סוגים אחרים של מיקרוסקופיה כדי לענות על שאלות נוספות על לוקליזציה תת-תאית ודינמיקה של חלבונים דנדריטיים של תאים ומאקרופאגים מעניינים. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום האימונולוגיה לחקור את ההפצה ואת היחסים המ spacial של חלבונים לידי ביטוי מקרופאגים ותאים דנדריטיים ולקדם את ההבנה שלנו של הפונקציה של חלבון אלה במהלך התגובות החיסונית. אל תשכח כי עבודה עם חלקיקים ויראליים יכול להיות מסוכן מאוד, כי אמצעי זהירות, כגון מינימליזציה של ייצור תרסיס, לובש ציוד מגן, ושימוש ברדס זרימה למינארית, תמיד צריך להילקח בעת ביצוע הליך זה.