Name: במבחנה הבידול של העכבר גורם גרנולוציט-מקרופאג-המושבה-מגרה (GM-CSF)-הפקת תאי T Helper (THGM) (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: למד להבדיל תאי T helper מייצרי GM-CSF מתאי CD4+ נאיביים של עכבר. פרוטוקול זה מייצר מעל 50% תאים מבטאי GM-CSF לחקר מחלות דלקתיות כמו טרשת נפוצה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי מענקים באוניברסיטה הלאומית לבריאות מערכת של סינגפור (T1-2014 Oct-12 ו T1-2015 Sep-10).

כל העכברים המשמשים פרוטוקול זה היו על רקע גנטי C57BL/6, תחת תנאים מסוימים ללא הפתוגן באוניברסיטה הלאומית של סינגפור. כל הניסויים בוצעו באמצעות פרוטוקולים אושרה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים שימוש הוועדה באוניברסיטה הלאומית של סינגפור.
1. מגיב והכנת חומרים
<ol><li>הכנת 500 מ"ל תמיסת באגירה פוספט (PBS) המכיל 2% סרום שור עוברית (FBS) וחומצה ethylenediaminetetraacetic 1 מ מ (EDTA). הערה: לשמור על המאגר על קרח לאורך כל התהליך לקבלת תוצאות אופטימליות.</li>
	<li>להכין 50 מ של המדיה RPMI מלאה המכילה פניצילין-סטרפטומיצין RPMI 1640, 10% FBS ו- 1%. השתמש המדיה RPMI מלאה המכילה 50 מיקרומטר β-mercaptoethanol עבור הבידול תא THGM. הוסף את β-mercaptoethanol בשכונה fume.</li>
	<li>הכן 7.5 mL של תערובת נוגדן anti-CD3e על ידי דילול מניות anti-CD3e מרוכז μg/mL 3 ב- PBS. מעיל 48-ובכן הצלחות על-ידי הוספת μL 150 של תערובת נוגדן מכל קידוח, דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך לפחות שעה, או ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.</li>
	<li>לעקר את זוג מלקחיים ומספריים ולשמור אותם 70% אתנול בין והניתוחים.</li>
</ol>2. הכנת מאתר Splenocytes
<ol><li>המתת חסד העכבר (של בן 6-8 שבועות) באמצעות אישור כמוסד CO2 חנק או נקע בצוואר הרחם. לרסס את העכבר עם 70% אתנול והר זה על בלוק פוליסטירן על גבו. העבר את העכבר בטיחות ביולוגית בארון כדי להמשיך השלבים הבאים.</li>
	<li>להחזיק העור באמצעות זוג מלקחיים, לחתוך את העור מתחת כלוב הצלעות בצד שמאל כ 4 ס מ, בעזרת זוג מספריים. פתח את השק הצפק. לחשוף את הטחול ולהשתמש מלקחיים סטרילי כדי לחלץ את הטחול.</li>
	<li>מניחים מסננת תא 70 μm על שפופרת 50 מ ל, טרום רטוב זה עם 2 מ של המאגר. מניחים את טחולים על מסננת התא (2-3 טחולים עבור תא אחד מסננת), macerate אותם באמצעות סוף פומפה מזרק 5 מ.</li>
	<li>יש לשטוף את מסננת ואת התחתית מספר פעמים עם 1-2 מ ל תא בידוד מאגר עד כל התאים הם סמוקים לתוך הצינור. למחוק את מסננת תא, centrifuge את התאים ב x 350 גרם במשך 5 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע.</li>
	<li>Resuspend בגדר תא עם 5 מ של קרים (4 ° C) אמוניום כלוריד-אשלגן (ACK) lysing מאגר (NH 150 מ מ4קלרנית, KHCO 10 מ מ3, 0.1 מ מ נה2EDTA; pH 7.2-7.4) ומערבבים אותם בעדינות על 2 דק להוסיף 10 מ של מדיה RPMI מלאה כדי לנטרל את ג'ק מאגר, מיד centrifuge את התאים ב x 350 גרם במשך 5 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע לאחר צנטריפוגה.</li>
</ol>3. בידוד של CD4 + T תאים באמצעות גרגרי CD4 מגנטי ועמודה ההפרדה תא
<ol><li>Resuspend בגדר תא ב 5 מ של תא בידוד מאגר. לסנן את המתלים התא באמצעות מסנן הכנה להפרדות צבע (30 μm) לתוך צינור 15-mL החדש כדי להסיר את כל הלכלוך.</li>
	<li>לקחת 10 μL של התליה תא ולעשות לדילול 10 x על-ידי הוספת μL 90 המאגר. קח 10 μL של התליה תא מדולל, ערבב את זה עם 10 μL של trypan blue לספירת תאים. לספור התאים hemocytometer כדי לקבוע את התשואה של התאים קיימא.</li>
	<li>Centrifuge התאים ב x 350 גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C וזורקים את תגובת שיקוע.</li>
	<li>Resuspend תאי μL 90 מאגר לכל 107 תאים. להוסיף 10 μL של גרגרי CD4 מגנטי לכל 107 תאים. דגירה התאים למשך 15 דקות ב 4 º C. לקבלת תוצאות מיטביות, מערבבים התליה תא בעדינות כל 5 דקות בזמן הדגירה.</li>
	<li>בעוד התאים הם המקננת, במקום עמודה ההפרדה על הדוכן מגנטי. טרום רטוב את העמודה עם 2 מ של המאגר.</li>
	<li>בסוף הדגירה תא/חרוז, לשטוף את התאים עם 5 מ של המאגר, centrifuge אותם ב 350 x גרם במשך 5 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע.</li>
	<li>Resuspend תאי 1 מ"ל של המאגר, לטעון את הדגימה לתוך העמודה ההפרדה תא, תני לזה לזרום דרך. להשתמש שפופרת צנטרפוגה 15-mL כדי לאסוף את השבר תאי CD4. להוסיף 1 מ"ל של מאגר לשטוף המאגר לפני זה יבש. חזור על השלב כביסה 2 x.</li>
	<li>הסר את העמודה ההפרדה תא הדוכן מגנטי ומניחים אותו על שפופרת צנטרפוגה 15 mL החדש. להוסיף 2 מ"ל תא בידוד מאגר העמודה ההפרדה תא ולהחיל על הבוכנה בחוזקה כדי לאלץ את התאים מחוץ העמודה.</li>
	<li>Centrifuge את השבר ב x 350 גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C כדי להשיג תאי CD4 +. למחוק את תגובת שיקוע.</li>
</ol>4. טיהור של תאי T CD4 + נאיבי (CD4+CD25–CD44הלאוCD62Lשלום) על ידי בידול THGM ומיון תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית
<ol><li>Resuspend שהושג CD4 + תא בגדר ב 500 µL של המאגר. מערבבים את התאים עם תערובת נוגדנים מצומדת פלורסנט המכילה CD4-PerCp (2.8 µg/mL), CD44-APC (2.4 µg/mL), CD25-PE (2 µg/mL), ו- CD62L-FITC (10 µg/mL) (טבלה 1). דגירה התאים על קרח למשך 20-30 דקות, ולהגן עליהם מפני אור. הערה: ריכוזי הנוגדנים אופטימציה בעבר במעבדה. המספר של נוגדנים הרשומים הוא עבור תאים של 1 – 2 עכברים.</li>
	<li>לאחר הדגירה, לשטוף את התאים עם 5 מ של המאגר, centrifuge את התאים ב x 350 גרם במשך 5 דקות ב 4 º C.</li>
	<li>למחוק את תגובת שיקוע, resuspend תאי µL 500 המאגר. לסנן את התאים שוב באמצעות רשת ניילון.</li>
	<li>העברה התליה תא צינור FACS למיון התא. Precoat הצינורות FACS אוסף עם 500 µL של המאגר.</li>
	<li>להשיג CD4+CD25–CD44הלאוCD62Lשלום האוכלוסייה (של תמים CD4+ T תאים) על-ידי מיון FACS. שער-CD4+CD25– הראשונה ולאחר מכן בחר CD44הלאוCD62Lשלום תאים של אוכלוסייה זו.</li>
	<li>לאסוף נאיבי CD4+ T תא שברים לתוך שפופרת צנטרפוגה 15-mL החדש. Centrifuge התאים ב x 350 גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C וזורקים את תגובת שיקוע.</li>
	<li>Resuspend תאי CD4 + T נאיביים-ריכוז של 106 תאים למ"ל בתקשורת RPMI מלאה המכילה 50 מיקרומטר β-mercaptoethanol.</li>
	<li>האחות נוגדנים anti-CD3e משמש precoating בצלחת 48-. טוב. זרע 0.25 מיליון תאים (250 µL) כל היטב עם איל-7 (2 ng/mL), אנטי-CD28 (1 µg/mL), אנטי-IFNγ (10 µg/mL) (טבלה 1). הערה: ריכוזי ציטוקין נוגדנים אופטימציה בעבר במעבדה על הבחנה תא THGM.</li>
	<li>תקופת דגירה התאים ב 37 ° C עם 5% CO2 של 3 ימים. אל תשנה את המדיום בתקופת הדגירה.</li>
</ol>5. ניתוח של העכבר THGM התאים שנוצר במבחנה
<ol><li>באמצעות מיקרוסקופ, בדוק את הבידול תא בתלת-ממד לאחר הבידול. לקצור את התאים, centrifuge אותם ב 350 x גרם במשך 5 דקות ב 4 º C. לשטוף את התאים 2 x עם מדיה RPMI מלאה. הערה: תאים הם גדולה יותר תאי CD4 + T נאיביים.</li>
	<li>Resuspend תאי 1 מ"ל של מדיה RPMI מלאה. לקחת 10 μL של השעיה תא ולערבב היטב עם μL 10 של trypan כחול כדי לקבוע את המספר הנייד עם hemocytometer. לחלק תאים שיקויים שלושה לרסטימולציה, ניתוח. הערה: ציטוקין תאיים מכתים, אליסה מבחני לדרוש ≥0.5 מיליון תאים, ומחייב ניתוח qPCR ≥ 1 מיליון תאים.</li>
	<li>
עבור ציטוקין תאיים מכתים, restimulate את התאים עם 13 12-פעילים phorbol-אצטט (PMA) (100 ng/mL), ionomycin (1 μg/mL) בנוכחות מעכב תחבורה חלבון (1 µL/mL) עבור 4-6 שעות.
	<ol>
<li>לקצור את התאים ואת תכתים אותם עם נוגדן anti-CD4 (PerCP-מצומדת, 0.2 מ"ג/מ"ל, דילול בטחונות; או מצומדת FITC, 0.5 מ"ג/מ"ל, דילול מטריים) למשך 30 דקות.</li>
		<li>לתקן את התאים μL 200 קיבוע מאגר למשך 20-60 דקות. לאחר הקיבעון, לשטוף את התאים 2 x 1 מ ל permeabilization מאגר.</li>
		<li>לבצע צביעת תאיים עם נוגדנים נגד GM-CSF (PE-מצומדת, 0.2 מ"ג/מ"ל, דילול מטריים), IL-17A (FITC-מצומדת, 0.5 מ"ג/מ"ל, דילול בטחונות; APC-conjugated, 0.2 מ"ג/מ"ל, דילול מטריים), IL-4 (APC-מצומדת, 0.2 מ"ג/מ"ל, דילול מטריים), ו- IFNγ (APC-מצומדת, 0.2 מ"ג/מ"ל, דילול בטחונות; PE-conjugated, 0.2 מ"ג/מ"ל, דילול מטריים) במשך 30 דקות בחושך.</li>
	</ol>
</li>
	<li>עבור ניתוח qPCR של ציטוקין בביטוי הגן על ידי תאים, להפעיל את התאים עם צלחת מכורך אנטי-CD3e (3 μg/mL) (precoating את הצלחת כפי שמתואר בשלב 1.3). ב-3 שעות לאחר הגירוי, לקצור את התאים כדי לבודד הכולל RNA באמצעות פנול RNA החילוץ ריאגנט להתכונן cDNA qPCR. צבעי יסוד ואת תוכנית המשמש את qPCR מוצגים לוחות 2 ו- 3, בהתאמה.</li>
	<li>לניתוח של הפרשת חלבונים ציטוקינים על ידי תאים, restimulate את התאים עם צלחת מכורך אנטי-CD3e (3 μg/mL) במשך 24 שעות ביממה (precoating את הצלחת כפי שמתואר בשלב 1.3). הקציר התרבות תא supernatant IL-17 ו- GM-CSF אליסה לקביעת ריכוזים שלהם.</li>
</ol>

<ol><li>Zhu, J., Paul, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4+T+cells%3A+fates%2C+functions%2C+and+faults%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD4 T cells: fates, functions, and faults.</a> Blood. 112, 1557-1569 (2008).</li>
<li>Kara, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailored+immune+responses%3A+novel+effector+helper+T+cell+subsets+in+protective+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Tailored immune responses: novel effector helper T cell subsets in protective immunity.</a> PLoS Pathogens. 10, e1003905(2014).</li>
<li>Bou Nasser Eddine, F., Ramia, E., Tosi, G., Forlani, G., Accolla, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Immunology+meets...Immunology%3A+Modified+cancer+cells+as+professional+APC+for+priming+naive+tumor-specific+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Tumor Immunology meets...Immunology: Modified cancer cells as professional APC for priming naive tumor-specific CD4+ T cells.</a> Oncoimmunology. 6, e1356149(2017).</li>
<li>Dong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TH17+cells+in+development%3A+an+updated+view+of+their+molecular+identity+and+genetic+programming%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and genetic programming.</a> Nature Reviews. Immunology. 8, 337-348 (2008).</li>
<li>Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-17+and+Th17+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">IL-17 and Th17 Cells.</a> Annual Review of Immunology. 27, 485-517 (2009).</li>
<li>Sheng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT5+programs+a+distinct+subset+of+GM-CSF-producing+T+helper+cells+that+is+essential+for+autoimmune+neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">STAT5 programs a distinct subset of GM-CSF-producing T helper cells that is essential for autoimmune neuroinflammation.</a> Cell Research. 24, 1387-1402 (2014).</li>
<li>Codarri, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RORgammat+drives+production+of+the+cytokine+GM-CSF+in+helper+T+cells%2C+which+is+essential+for+the+effector+phase+of+autoimmune+neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">RORgammat drives production of the cytokine GM-CSF in helper T cells, which is essential for the effector phase of autoimmune neuroinflammation.</a> Nature Immunology. 12, 560-567 (2011).</li>
<li>El-Behi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+encephalitogenicity+of+T%28H%2917+cells+is+dependent+on+IL-1-+and+IL-23-induced+production+of+the+cytokine+GM-CSF%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">The encephalitogenicity of T(H)17 cells is dependent on IL-1- and IL-23-induced production of the cytokine GM-CSF.</a> Nature Immunology. 12, 568-575 (2011).</li>
<li>Ivanov, I. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+orphan+nuclear+receptor+RORgammat+directs+the+differentiation+program+of+proinflammatory+IL-17%2B+T+helper+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells.</a> Cell. 126, 1121-1133 (2006).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+subset+of+helper+T+cells+promotes+immune+responses+by+secreting+GM-CSF%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">A novel subset of helper T cells promotes immune responses by secreting GM-CSF.</a> Cell Death and Differentiation. 20, 1731-1741 (2013).</li>
<li>Croxford, A. L., Spath, S., Becher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF+in+Neuroinflammation%3A+Licensing+Myeloid+Cells+for+Tissue+Damage%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">GM-CSF in Neuroinflammation: Licensing Myeloid Cells for Tissue Damage.</a> Trends in Immunology. 36, 651-662 (2015).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

כאן אנחנו תיאר פרוטוקול בידול THGM במבחנה מתאי תמים CD4 + עכבר, ואחריו ניתוח של התאים הבדיל כדי לאמת את השיטה. ראוי לציין, הן הטחול ובלוטות הלימפה יכול לשמש עבור תמים CD4 + תא T טיהור ובידול THGM. הביטוי ציטוקין נקבעים על-ידי ציטוקינים תאיים מכתים בשילוב עם cytometry זרימה הראה כי כ-55% של התאים היו המושרה להיות GM-CSF-הבעת ' התאים בתנאי THGM (איור 1 א'). בהשוואה לתאי THבידול 17 בתנאי, התאים הבדיל בתנאי THGM הכלולים לרמת הרקע או...

תאי CD4 + T helper (TH) הם מרכיבים חיוניים של המערכת החיסונית, יש תפקיד מכריע ההגנה מארח נגד חיידקים פתוגנים, מעקב סרטן, מחלת חיסון עצמי1,2,3. בעת הפעלת קולטן (TCR) תא T, תאי CD4 + T נאיבי יכול להיות מובחן TH1, TH2, TH 17, כתוצאה מתקנות או תאי T (Treg) תחת ההשפעה של ציטוקינים שונים milieus2,4, 5. לאחרונה, ערכה חדשה של תאי TH , המייצרת בעיקר GM-CSF, היה מזוהה, בשם THGM6. הבידול בתאי THGM מונעת על ידי IL-7 באמצעות הפעלת אות מתמר activator של שעתוק 5 (STAT5). תאים אלה אקספרס כמות גדולה של GM-CSF תוך ביטוי נמוך של אחרים TH-תא החתימה ציטוקינים כגון IFNγ ו- IL-176. GM-CSF נמצאה לשחק תפקיד קריטי בהתפתחות של CD4 + T תאית neuroinflammation7,8. בהשוואה ל IFNγ - או איל-17-לבטא autoreactive T תאים, GM-CSF-הבעת ' T תאים שהועברו אל פראי-סוג עכברים (WT) גרם של תחילת המחלה מוקדם יותר וחומרת המחלה גבוהה יותר. בנוסף, תאי T Csf2- / - נכשלה לזירוז ניסיוני אוטואימוניות דלקת המוח וחוט השדרה (EAE) לאחר להיות הועבר adoptively לנמענים WT, ואילו תאי T IFNγ או איל-17A שמר את היכולת לתווך EAE7. יתר על כן, מצור של GM-CSF באמצעות נוגדנים נטרול יושבחו חומרת המחלה EAE8. יתר על כן, מחסור של STAT5 בתאי T בעכברים הביא דור THGM מופחתת ו, לכן, ב התנגדות של העכברים EAE פיתוח6. ממצאים אלו מדגישים את החשיבות של תאי T GM-CSF-הבעת 'H neuroinflammatory חיסון למחלה. לפיכך, קביעת שיטה להבדיל בין תאי T GM-CSF-הבעת 'H מתאי CD4 + T נאיביים יהיה חשוב בחקר בפתוגנזה של neuroinflammation אוטואימונית ותגובות החיסון T תאית. עם זאת, פרוטוקול זה ביעילות מייצר תאי THGM מ מאתר תמים ש-cd4 + לא הוכח.
כאן אנו מציגים שיטה מבדיל בין תאי THGM מאתר מתאי CD4 + T נאיביים. פרוטוקול זה מתאר את כל התהליך, כולל החילוץ של הטחול מהעכבר, ההכנה של השעיה מתא בודד, הבחירה חיובי CD4, תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) לתא TH בידול וניתוח. התאים helper T הבדיל מנותחים על-ידי ציטוקינים תאיים מכתים משולב עם cytometry זרימה כדי לקבוע את הביטוי ציטוקין ברמה תא יחיד, מאת-אמת ה-PCR כמותי כדי לקבוע את הביטוי ציטוקין ברמת mRNA, ו מאת אליסה כדי להעריך את הביטוי ציטוקין ברמת חלבון. בשיטה זו ניתן להחיל מחקרים של ביולוגיה של התא THGM בתנאים שונים, כגון EAE, איפה GM-CSF ממלא תפקיד חשוב בפתוגנזה.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Biowest</td><td>L0500-500</td><td></td></tr><tr>FBS <td>גדי</td><td>מומת בחום</td><td>FBS-HI-12A</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>בסיס ראשון</td><td>BUF-2040-10</td><td>מדולל ל-1x PBS במים סטריליים</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>בסיס ראשון</td><td>BUF-1053-100ml-pH8.0</td><td></td></tr><tr><td>10x מאגר</td> <td>ACKBiolegend</td><td>420301</td><td>מדולל במים סטריליים</td></tr><tr><td>מסננת תאים</td><td>SPL מדעי החיים</td><td>93070</td><td></td></tr><tr><td>CD4 מיקרו-חרוזים</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-049-201</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>עמודת LS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>מעמד מגנטי</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>מזרק 1 מ"ל</td><td>Terumo</td><td>SS+01T</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>אפנדורף</td><td>אפנדורף 5810R</td><td></td></tr><tr><td>סוני SY3200</td><td>סדרן תאים Sony Sony SY3200 ממיין תאים</td><td></td> 50 מ"ל צינור צנטריפוגה חרוטי גריינר ביו-וואן 210261 15 מ"ל צינור צנטריפוגה חרוטי גריינר ביו-וואן 188271 FACS <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Corning</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>24 באר צלחת תרבית תאים</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>נגד עכבר CD4 PerCP-eFluor 710</td><td>eBioscience</td><td>46-0041-82</td><td></td></tr><tr><td>PE מצומד נגד עכבר CD25 (IL-2Ra, p55)</td> <td>eBioscience</td><td>12-0251-82</td><td></td></tr><tr><td>אנטי אדם/עכבר CD44 APC</td><td>eBioscience</td><td>17-0441-82</td><td></td></tr><tr><td>נגד עכבר CD62L FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0621-85</td><td></td></tr><tr><td>תא ספירה משופר נויבאואר</td><td>Marienfeld</td><td>640010</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone Trypan Blue Solution</td><td>GE healthcare Life Sciences</td><td>SV30084.01</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td></td><td>ניקון Nikon Elipse TS100</td><td></td></tr><tr><td>Purified&nbsp; CD3e&nbsp נגד עכבר; נוגדן</td><td>Biolegend</td><td>100314</td><td></td></tr><tr><td>אוגר מטוהר נגד עכבר CD28</td><td>BD Biosciences</td><td>553295</td><td></td></tr><tr><td>חולדה מטוהרת&nbsp; IFN&gamma נגד עכברים; &nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>16-7312-85</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן IL-4 מטוהר נגד עכבר</td><td>Biolegend</td><td>504102</td><td></td></tr><tr><td>עכבר רקומביננטי IL-7 חלבון</td><td>R& מערכת D</td><td>407-ML</td><td></td></tr><tr><td>רקומביננטי אנושי TGF-beta</td><td>R& D system</td><td>240-B-010</td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>Merck Millipore</td><td>19-144</td><td></td></tr><tr><td>Ionomycin</td><td>Sigma</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>GolgiPlug מעכב הובלת חלבון</td><td>BD Biosciences</td><td>51-2301KZ</td><td></td></tr><tr><td>קיבוע תוך תאי & סט מאגר פרמיביליזציה</td><td>eBioscience</td><td>88-8824-00</td><td></td></tr><tr><td>אנטי עכבר GM-CSF PE</td><td>eBioscience</td><td>12-7331-82</td><td></td></tr><tr><td>FITC נגד עכבר IL-17A</td><td>Biolegend</td><td>506908</td><td></td></tr><tr><td>APC נגד עכבר IFN-gamma</td><td>Biolegend</td><td>505810</td><td></td></tr><tr><td>GO Taq qPCR מאסטר מיקס</td><td>Promega</td><td>A6002</td><td></td></tr><tr><td>עכבר GM-CSF ELISA Ready-SET-Go!</td><td>invitrogen</td><td>88-7334-88</td><td></td></tr><tr><td>עכבר IL-17A ללא יציאה ELISA</td><td>invitrogen</td><td>88-7371-22</td><td></td></tr></tbody></table>

במבחנה הבידול של העכבר גורם גרנולוציט-מקרופאג-המושבה-מגרה (gm-csf)-הפקת תאי t helper (thgm)

In Vitro Differentiation of Mouse Granulocyte-macrophage-colony-stimulating Factor (GM-CSF)-producing T Helper (THGM) Cells

הגורם גרנולוציט-מקרופאג-המושבה-מגרה (GM-CSF)-ייצור תא T מסייע (THGM) היא תת-קבוצה תא מסייע T שזוהה בעיקר מפריש GM-CSF מבלי לייצר אינטרפרון (IFN) וγ או אינטרלוקין (IL)-17, נמצא לשחק תפקיד חיוני neuroinflammation אוטואימונית. שיטה של בידוד של תמים CD4 + T תאים מתא בודד השעיה של splenocytes ויצירת תא THGM מתאי CD4 + T נאיביים יהיה טכניקה שימושית במחקר של חסינות T תאית ומחלות אוטואימוניות. כאן נתאר שיטת מבדיל בין בעכבר נאיבי CD4 + T תאים לתאי THGM קידום על ידי IL-7. התוצאה של הבידול הוערכה על ידי הניתוח של הביטוי ציטוקינים באמצעות טכניקות שונות, כולל ציטוקין תאיים מכתים משולב עם cytometry זרימה, כמותיים בזמן אמת תגובת שרשרת פולימראזית (PCR), ו מבחני מקושרים-אנזים immunosorbent (אליסה). כ-55% של התאים באמצעות פרוטוקול בידול THGM כפי שמתואר כאן, הביע GM-CSF עם ביטוי מינימלי של IFNα או IL-17. הביטוי העיקרי של GM-CSF על-ידי תאי THGM אושר עוד יותר על ידי הניתוח של הביטוי של GM-CSF, IFNα ו- IL-17 ברמות ה-mRNA וגם חלבון. לכן, בשיטה זו ניתן להשתמש כדי להבדיל תמים CD4 + T תאים THGM תאי במבחנה, אשר יהיה שימושי במחקר של ביולוגיה של התא THGM.

תאי CD4 + T נאיבי מבודד שני בן שבוע 8 זכר C57BL/6 עכברים חולקו לשלושה חלקים. חלק אחד של התאים היה הבדיל לתאי THGM בעקבות הפרוטוקול המתואר. בחלק אחר היה תרבותי בתנאי THGM בנוכחות נוגדן anti-IL-4 (10 µg/mL) כדי לבחון את השפעת המצור IL-4 הבידול של THGM. החלק האחרון היה תרבותי בתנאי בידול 17 TH(3 µg/mL anti-CD3e נגד µg/mL 1-CD28..., 10 ננוגרם למ"ל TGFβ, 30 ננוגרם למ"ל IL-6, 10 µg/mL anti-IFNγ, µg 10/mL אנטי-IL-4). אחרי 3 ימים של בידול, התאים היו קוצ...

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול להבדיל מאתר granulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor-producing T helper (THGM) תאים מתאי CD4 + T נאיביים, כולל בידוד תאי CD4 + T נאיבי, הבידול של THGM, ו- ניתוח של תאים THGM. בשיטה זו ניתן ליישם לימודי ההוראה ותפקוד תאי THGM.

במבחנה הבידול של העכבר גורם גרנולוציט-מקרופאג-המושבה-מגרה (GM-CSF)-הפקת תאי T Helper (THGM)

The granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor (GM-CSF)-producing T helper (THGM) cell is a newly identified T helper cell subset that predominantly ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום תאי ה-T CD4 כגון איזו תת-קבוצה של תאי T-helper היא המקור העיקרי ל-GM-CSF בפתוגנזה של מחלות דלקתיות כגון טרשת נפוצה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מייצרת יותר מ-50% GM-CSF המבטאים תאי T מתאי T CD4 נאיביים ללא או מעט תאי ביטוי גמא OI17 מפריעים המספקים מקור תאי חיוני לחקירת רגרסיה ותפקוד של THGM, תת-קבוצה חדשה של תאי T-helper. מי שתדגים את ההליך תהיה יי לו, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלי.התחל בשימוש במלקחיים כדי להרים את העור מעל הבטן של עכבר בן שישה עד שמונה שבועות ולבצע חתך של כארבעה סנטימטרים מתחת לכלוב הצלעות בצד שמאל של החיה. פתח את שק הצפק כדי לחשוף את הטחול והשתמש במלקחיים סטריליים כדי להעביר את הטחול על מסננת של 70 מיקרומטר רטובה מראש עם שני מיליליטר של מאגר בידוד תאים. לאחר שנאספו שניים עד שלושה טחולים, השתמש בקצה של מזרק של חמישה מיליליטר כדי להשרות את רקמת הטחול ולשטוף את המסננת מספר פעמים עם מיליליטר עד שניים של מאגר בידוד תאים עד שכל התאים נשטפו לתוך הצינור.אסוף את התאים על ידי צנטריפוגה והשהה מחדש את הגלולה בחמישה מיליליטר של ארבע מעלות צלזיוס אמוניום כלוריד אשלגן ליזה. לאחר שתי דקות של ערבוב עדין, עצרו את הליזיס עם 10 מיליליטר של מדיום RPMI שלם ומיד צנטריפוגה את התאים. כדי לבודד את תאי ה-T החיוביים ל-CD4, השעו מחדש את כדור תאי הדם הלבנים בחמישה מיליליטר של מאגר בידוד תאים וסנן את תרחיף התאים דרך מסננת של 30 מיקרומטר לתוך צינור חדש של 15 מיליליטר כדי להסיר פסולת.לאחר הספירה, השעו מחדש את התאים באחת כפול 10 לתאים השביעיים לכל 90 מיקרוליטר של ריכוז חיץ והוסיפו 10 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים מצומדים נגד CD4 לכל אחד כפול 10 לתאים השביעיים לדגירה של 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס עם ערבוב כל חמש דקות. בזמן שהתאים דוגרים, הנח עמוד הפרדה על מעמד מגנטי והרטיב מראש את העמוד בשני מיליליטר חיץ. לאחר מכן, שטפו את התאים בחמישה מיליליטר חיץ והשעו מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של חיץ.טען את הדגימה על העמודה ואסוף את השבר השלילי CD4 בצינור חרוטי של 15 מיליליטר. כאשר כל התאים עברו דרך העמודה, שטפו את המאגר שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של חיץ לכל שטיפה לפני שהוא מתייבש. לאחר הכביסה האחרונה, העבירו את העמוד לצינור חרוטי חדש של 15 מיליליטר וצללו את העמודה עם שני מיליליטר של מאגר בידוד תאים כדי להוציא את שבר החרוזים החיובי.לאחר מכן, אסוף את התאים החיוביים CD4 על ידי צנטריפוגה. למיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות של תאי ה-T הנאיביים, השעו מחדש את גלולת התאים החיוביים CD4 הממוינים בחרוזים ב-500 מיקרוליטר של מאגר וערבבו את התאים עם קוקטייל נוגדנים מצומד פלואורסצנטי מתאים. לאחר 20 עד 30 דקות על קרח מוגן מאור, שטפו את התאים בחמישה מיליליטר של חיץ טרי והשעו מחדש את הגלולה ב-500 מיקרוליטר של חיץ טרי.מסננים את התאים דרך רשת ניילון ומעבירים את התאים לצינור FACS המצופה מראש ב-500 מיקרוליטר של חיץ. שער לבחירת אוכלוסיות התאים הגבוהות CD25 שליליות CD4 חיוביות ו-CD44 נמוכות CD62 ליגנד. לאחר מכן, מיין את ה-CD4 החיובי הנאיבי CD25 שלילי CD44 CD62 נמוך, ליגנד תאי T גבוהים לצינור צנטריפוגה חדש של 15 מיליליטר וגלולה את תאי ה-T החיוביים הנאיביים CD4 המבודדים על ידי צנטריפוגה.עבור גורם מגרה של מושבת מקרופאגים גרנולוציטים או התמיינות תאי T מסייעים GM-CSF, השעו מחדש את תאי ה-T הממוינים בריכוז של 10 עד 10 עד שישית תאים למיליליטר במדיום RPMI שלם המכיל 50 מיקרו-מולרי בטא-מרקפטואתנול ושאבו את נוגדן האפסילון נגד CD3 מכל באר של צלחת מצופה מראש של 48 בארות. לאחר מכן, זרעו 2.5 פעמים 10 עד 5 תאים לכל באר יחד עם IL7, anti-CD28 ו-anti-IFN gamma ודגרו על התאים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך שלושה ימים. ביום השלישי של התרבית, השתמש במיקרוסקופ כדי לבדוק את התמיינות התאים ולקצור את התאים לצנטריפוגה.השעו מחדש את הגלולה במדיום RPMI שלם טרי למשך שתי כביסות, והשעו מחדש את התאים במיליליטר אחד של מדיום שלם טרי לאחר הכביסה השנייה לספירה. פצלו את התאים לשלושה נפחים שווים ועוררו מחדש את המנה הראשונה של תאים עם PMA ו-Ionomycin בנוכחות מעכב הובלת חלבון למשך ארבע עד שש שעות. בתום הגירוי, קצרו את התאים לצביעה בנוגדנים נגד CD4.לאחר 30 דקות, תקן את התאים עם 200 מיקרוליטר של מאגר קיבוע למשך 20 עד 60 דקות, ולאחר מכן שתי שטיפות במיליליטר אחד של מאגר חדירות לכל שטיפה. לאחר מכן, צבע לביטוי ציטוקינים תוך תאיים למשך 30 דקות בחושך. לניתוח PCR כמותי של ביטוי הגן של ציטוקינים בתא מובחן, הפעל את התאים עם אפסילון אנטי-CD3 הקשור לצלחת למשך שלוש שעות.לאחר מכן, השתמש במגיב מיצוי RNA פנול כדי לבודד את ה-RNA הכולל כדי לאפשר הכנת cDNA ל-PCR כמותי. כדי להעריך את הפרשת חלבון הציטוקינים על ידי התאים הממויינים, עורר מחדש את התאים עם אפסילון אנטי-CD3 הקשור לצלחת למשך 24 שעות ונתח את הסופרנטנטים התרבית עבור IL17 ו-GM-CSF על ידי ELISA. כ-55% מהתאים שגודלו בתנאי התמיינות תאי T-helper של GM-CSF ביטאו GM-CSF בעוד שרק כ-2% מהתאים שהתמיינו בתנאי T-helper 17 ביטאו ציטוקין זה.בהשוואה לתנאי התמיינות T-helper 17 המביאים לייצור IL17 על ידי כ-8% מהתאים, תנאי התמיינות תאי T-helper GM-CSF גרמו לביטוי IL17 רק בכ-1% מהתאים. יש לציין שרק חלק קטן מהתאים מבטא IFN gamma או IL4 בכל אחד מתנאי התרבית. תאים מובחנים GM-CSF T-helper מפגינים ביטוי גבוה משמעותית של CSF2 mRNA, אך ביטוי נמוך בהרבה של IL17 בהשוואה לתאי T-helper 17.זה מתואם עם ביטוי חלבון GM-CSF שנצפה בסופרנטנטים של תרביות מתאי T-helper GM-CSF ו-T-helper 17, עם ריכוז גבוה פי שלושה של הציטוקין שזוהה בתרביות תאי GM-CSF של T-helper וללא IL17 מדיד כלל. תאי GM-CSF מסייעים ל-T מציגים גם ביטוי מעט נמוך יותר של Rorc, ביטוי Stat5 גבוה יותר וביטוי מעט נמוך יותר של Stat3 מאשר תאי T-helper 17, מה שמצביע על כך שלמרות שהתמיינות GM-CSF ו-IL17 של תאי T-helper נשלטים על ידי גורמי שעתוק שונים, הם עשויים לחלוק כמה מאפיינים משותפים. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לבצע את כל השלבים בארון הבטיחות הביולוגי כדי לשמור על התאים והריאגנטים סטריליים.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ניתוח טרנסקריפטום כדי לענות על שאלות נוספות כגון, מהם הגנים החשובים המתבטאים על ידי תאי THGM? לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום האימונולוגיה לחקור כיצד GM-CSF שמקורו בתאי T תורם לדלקת במכרסמים. אל תשכח שעבודה עם מגיב בטא-מרקפטואתנול ומיצוי RNA עלולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון שימוש במכסי אדים בזמן השימוש בריאגנטים אלה.

in-vitro-differentiation-mouse-granulocyte-macrophage-colony

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

סרטון זה מדגים את הפרימיום של מונוציטים ראשוניים למקרופאגים. מונוציטים אנושיים ראשוניים יכולים להיות מבודדים ומובחנים לפנוטיפ פרו-דלקתי דמוי M1 באמצעות גורם מגרה מושבת גרנולוציטים-מקרופאגים (GM-CSF) או לפנוטיפ אנטי-דלקתי דמוי M2 באמצעות גורם מגרה מושבת מקרופאגים (M-CSF).

תרבית חוץ גופית והתמיינות של מונוציטים ראשוניים למקרופאגים

סרטון זה מתאר שיטה במבחנה ליצירת מקרופאגים מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (iPSCs). יצירת מקרופאגים מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים מתרחשת בשלושה שלבים: (i) צבירה של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים בתרחיף ליצירת גופים עובריים תלת-ממדיים (EBs) המתמיינים לתאים מזודרמליים, (ii) היווצרות תאים מקדימים של מקרופאגים מה-EBs המתמיינים, ו-(iii) התמיינות של התאים המקדומים של המקרופאגים למקרופאגים בוגרים ומתפקדים.

התמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי אדם למקרופאגים

סרטון זה מדגים את התמיינות החוץ גופית של גרנולוציטים-מקרופאגים-גורם מגרה מושבה או תאי T מסייעים מייצרי GM-CSF (THGM). תאי T נאיביים מבודדים עוברים גירוי לצורך התמיינות ל-THGM, אשר מאושר על ידי זיהוי ייצור GM-CSF תוך-תאי גבוה וביטוי נמוך של ציטוקינים ספציפיים אחרים לתאי T עוזרים.

טכניקת In Vitro להבדיל בין GM-CSF המייצרים תאי T מסייעים לבין תאי T נאיביים

ניתן להתמיין בתאי גזע עובריים של עכבר לתאי T במבחנה באמצעות מערכת התרבות המשותפת OP9-DL1. הצלחה בהליך זה דורשת תשומת לב קפדנית לתחזוקת ריאגנט/תאים, ושלבים רגישים לטכניקה מרכזית. כאן אנו דנים בפרמטרים קריטיים אלה ומספקים פרוטוקול מפורט לעידוד אימוץ טכנולוגיה זו.

גזירה של תאי T במבחנה מתאי עכבר גזע העובריים

תאי מח עצם שגודלו עם גורם מגרה מושבת מקרופאגים גרנולוציטים (GM-CSF) מייצרים תרבית הטרוגנית המכילה מקרופאגים ותאים דנדריטיים (DCs). שיטה זו מדגישה שימוש בקשירת MHCII והיאלורונן (HA) כדי להבדיל בין מקרופאגים ל-DCs בתרבית GM-CSF. למקרופאגים בתרבות זו יש קווי דמיון רבים למקרופאגים המכתשית.

דור וזיהוי GM-CSF נגזר מכתשיים דמוי מאקרופאגים דנדריטים תאי עכבר מח עצם

מוצג פרוטוקול לתרבית תאים של מקרופאגים שמקורם בגורם מגרה מושבת מקרופאגים (M-CSF). הפרוטוקול משתמש בשימור בהקפאה של מונוציטים יחד עם התמיינות בתפזורת שלהם למקרופאגים. לאחר מכן ניתן לזרוע מקרופאגים שנקטפו לבארות תרבית בצפיפות התאים הנדרשת לביצוע ניסויים.

תרבות של Macrophage מושבה מגרה פקטור בדיל אדם המקרופאגים מונוציטים הנגזר

כאן מוצגים נתונים היסטוריים פרוטוקולים culturing הקו תא 32D/G-CSF-R מאתר קודמן מיאלואידית, ביצוע זיהומים נגיפיים של ביצוע מבחני התפשטות ובידול. הקו תא מתאים ללמוד פיתוח התאים מיאלואידית, ואת התפקיד של גנים של עניין גדילת התאים מיאלואידית ובידול neutrophilic.

התפשטות ובידול של קודמן מיאלואידית מאתר 32D/G-CSF-R תאים

במאמר זה, אנו מספקים שפרוטוקול מפורט עבור הביטוי של פיוז'ן פלורסנט חלבונים במח העצם מאתר נגזר התאים הדנדריטים ומקרופגים. השיטה מבוססת על התמרה חושית של מח העצם אבות עם בונה retroviral ואחריו בידול לתוך מקרופאגים, הדנדריטים תאים במבחנה.

ביטוי של חלבונים פיוז'ן פלואורסצנט תאים דנדריטים הנגזרות מח עצם מאתר ו מקרופאגים

מחקר זה מתאר שיטה לבודד שלשולים חוץ-תאיים מועשרים אקסוזום הנושאים גורמים מעוררי גרנולוציטים מקרופטים למושבה מגרה את המעי הגס מתאי גזע עובריים.

בידוד של שלשלות חוץ-תאיות מועשרות אקסוזום הנושאות גרנולוציט-מקרופאג' גורם מעורר מושבה מתאי גזע עובריים

פרוטוקול זה מתאר את הדור החזק של מקרופאגים מתאי גזע המושרה האדם pluripotent ושיטות לאפיון הבאים שלהם. ביטוי לסמן תא המשטח, ביטוי הגנים, ומוסר פונקציונלי משמשים כדי להעריך את הפנוטיפים ואת התפקוד של מקרופאגים הנגזרות iPSC.

הפקה ואפיון של מקרופאגים האדם מ Pluripotent תאי גזע

למד להבדיל תאי T helper מייצרי GM-CSF מתאי CD4+ נאיביים של עכבר. פרוטוקול זה מייצר מעל 50% תאים מבטאי GM-CSF לחקר מחלות דלקתיות כמו טרשת נפוצה.

במבחנה הבידול של העכבר גורם גרנולוציט-מקרופאג-המושבה-מגרה (GM-CSF)-הפקת תאי T Helper (T_HGM)

גלה סרטונים נוספים