וריאציות גנטיות להמחיש מטרות קצרות, מוטציות נקודה בהקשר רקמות מורפולוגי עם RNA בחיי עיר Assay הכלאה
14 באוגוסט 2018
כאן, אנו מתארים בחיי עיר הכלאה assay המאפשרת זיהוי רגיש וספציפי של רצפי קצר ככל נוקלאוטידים 50 עם רזולוציה נוקלאוטיד יחיד ברמת תא בודד. וזמינותו, אשר יכול להתבצע באופן ידני או אוטומטי, באפשרותך לאפשר ויזואליזציה של גרסאות splice, רצפים קצרים מוטציות בתוך ההקשר רקמות.
שיטה זו יכולה לענות על שאלות מחקר מרכזיות במדעי המוח, אונקולוגיה ומעבר להם, כגון ביטוי ספציפי לסוג התא ומיפוי מרחבי של וריאנטים של חיבור בתוך המוח ומיקרו-סביבות הגידול. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא יכולה לזהות צמתים אקסונים, רצפים קצרים ומוטציות נקודתיות בהקשר הרקמה עם רגישות וסגוליות גבוהות מאוד בתאים בודדים. מי שידגים את ההליך יהיה הל פימנטל, מדען שותף מהמעבדה שלנו.
להכנת הרקמה, יש לתקן אותה מיד לאחר הדיסקציה בפורמלין ניטרלי של 10% בטמפרטורת החדר למשך 16 עד 32 שעות. לאחר מכן, הדגימה מעובדת ומוטמעת בפרפין באמצעות נהלים סטנדרטיים. חותכים את הרקמה המוטמעת לחמישה חלקים פלוס מינוס מיקרון אחד בעזרת מיקרוטום.
הרכיבו את החלקים על שקופיות זכוכית דביקות אלקטרוסטטית וייבשו באוויר בטמפרטורת החדר במהלך הלילה. שעה לפני ביצוע בדיקת ההכלאה של RNA NC2, הניחו את שקופיות הרקמה המותקנות במתלה שקופיות ואפו בתנור אוויר במחזור ב-60 מעלות צלזיוס. לפני שתתחיל בבדיקת ההיברידיזציה של RNA NC2, ודא שתנור ההכלאה מוגדר ל-40 מעלות צלזיוס.
הרטיבו היטב את נייר הלחות, הסירו שאריות מים והניחו את המכסה על מגש בקרת הלחות. הכן 200 מיליליטר של מגיב אחזור מטרה 1X זמין מסחרית על ידי הוספת 20 מיליליטר של מגיב אחזור מטרה 10X ל-180 מיליליטר מים. הניחו שני מחזיקי שקופיות בספינת קיטור.
מלאו מחזיק שקופיות אחד ב-200 מיליליטר של מגיב אחזור מטרה 1X ואת השני ב-200 מיליליטר מים. בעזרת ספינת הקיטור מחממים את שתי התמיסות לרתיחה. יש לחמם את מאגר הכביסה פי 50 ל-40 מעלות צלזיוס למשך 10 עד 20 דקות.
לאחר מכן הכינו שלושה ליטר של מאגר כביסה 1X על ידי דילול 60 מיליליטר של מאגר כביסה 50X שחומם מראש ב-2.94 ליטר מים. בקולט אדים, הכינו 50% מתמיסת ההמטוקסילין של גיל על ידי הוספת 100 מיליליטר של המטוקסילין של גיל ל-100 מיליליטר מים. הכן מגיב כחול על ידי הוספת 1.43 מיליליטר של 20 עד 30% אמוניום הידרוקסיד ל -250 מיליליטר מים.
לחמם מראש את בדיקות המטרה ב-40 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לפני הכלאת הבדיקה. הביאו את שבעת הריאגנטים המגבירים, Amp 0 עד 6, לטמפרטורת החדר. התחל את דה-פריפיניזציה של הדגימה על ידי הוצאת חלקים מהתנור וטבילת שקופיות הרקמה המותקנות בקסילן בתסיסה למשך חמש דקות.
הפזר שוב בקסילן טרי למשך חמש דקות. יש לייבש ב-100% אתנול עם תסיסה למשך שתי דקות. וחזור שוב באתנול 100% טרי למשך שתי דקות.
יבש את המגלשות באוויר בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס בתנור אוויר במחזור במשך חמש דקות עד שהן יבשות לחלוטין. לאחר מכן, דגרו על החלקים עם כארבע טיפות מי חמצן מוכנים לשימוש בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות כדי להרוות את פעילות הפרוקסידאז האנדוגנית. הוציאו את התמיסה מהמגלשות ושטפו אותן פעמיים במים.
טבלו בקצרה את החלקים במים שחוממו מראש ולאחר מכן הניחו את החלקים ב-200 מיליליטר של מגיב אחזור המטרה ב-100 מעלות צלזיוס בספינת הקיטור למשך 15 עד 30 דקות. הסר את השקופיות מאחזור המטרה ושטוף פעמיים במים. טובלים 100% אתנול למשך שלוש דקות.
לאחר מכן יבש את השקופיות בחום של 60 מעלות צלזיוס בתנור אוויר במחזור עד לייבוש מלא. לאחר שהמגלשות יבשות, השתמש בעט הידרופובי כדי לצייר מחסום הידרופובי בגודל של כ-0.75 על 0.75 אינץ' סביב הקטע. הניחו למחסום להתייבש לחלוטין בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת.
הנח את השקופיות במחזיק שקופיות והנח את מחזיק השקופיות במגש מבוקר הלחות שחומם מראש. מוסיפים כארבע טיפות פרוטאז 3 לכל שקופית ודוגרים בחום של 40 מעלות צלזיוס בתנור ההכלאה למשך 15 עד 30 דקות. הוציאו את התמיסה מהמגלשות ושטפו אותן פעמיים במים.
כדי להתחיל בהליך הכלאת הבדיקה, הוסף כארבע טיפות מתמיסת הבדיקה המוכנה לשימוש המתאימה כדי לכסות את כל הקטע. הכלאה של הבדיקות בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס בתנור ההכלאה למשך שעתיים. הוציאו את התמיסה מהמגלשות ושטפו את השקופיות ב-200 מיליליטר של מאגר כביסה 1X בטמפרטורת החדר עם תסיסה מדי פעם למשך שתי דקות.
חזור על הליך הכביסה. השלב הבא הוא הגברת האות על ידי דגירה של החלקים בסדרה של ריאגנטים מגבירים. מוסיפים כארבע טיפות אמפר 0 כדי לכסות את כל החלק בכל שקופית ולדגור בחום של 40 מעלות צלזיוס בתנור ההכלאה למשך 30 דקות.
לאחר מכן שפכו את התמיסה ושטפו את השקופיות ב-200 מיליליטר של מאגר כביסה 1X בטמפרטורת החדר עם תסיסה מדי פעם למשך שתי דקות. חזור על הליך הכביסה. באותו אופן, דגרו את החלקים במגבר 1 עד אמפר 6 בטמפרטורה ולמשך הזמן המצוין בסכימה זו.
לאחר שהשקופיות טופלו בסדרת ריאגנטים להגברה, הכינו פתרון עבודה של צבע אדום מהיר. יש להוסיף את הנפח המתאים של צבע Fast Red-B וצבע Fast Red-A לתוך שפופרת ולערבב היטב. הוציאו את עודפי הנוזלים מהשקופיות והוסיפו את תמיסת העבודה של הצבע האדום המהיר לשקופיות.
דוגרים את השקופיות במגש עם מכסה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לאחר 10 דקות, יש לשפוך את התמיסה האדומה המהירה ולשטוף את המגלשות פעמיים על ידי טבילה למעלה ולמטה במי ברז. כדי לנטרל את חלקי הרקמה, טבלו את השקופיות בתמיסת המטוקסילין של 50% גיל בטמפרטורת החדר למשך שתי דקות.
שטפו את המגלשות במי ברז, וחזרו על כך מספר פעמים עד שהמגלשות נקיות בעוד החלקים נשארים סגולים. טבלו את המגלשות במי אמוניה 02% פעמיים עד שלוש להחלקה. החלף את מי האמוניה במי ברז ושטוף את המגלשות שלוש עד חמש פעמים.
יבש את השקופיות בתנור אוויר במחזור על 60 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות עד לייבוש מלא. הנח טיפה אחת עד שתיים של מגיב הרכבה על החלקת כיסוי והנח את המגלשה מעל החלקת הכיסוי תוך הימנעות מכל לכידה של בועות אוויר. יבש את המגלשות באוויר למשך חמש דקות לפחות.
לבסוף, התבונן בשקופיות תחת מיקרוסקופ שדה בהיר סטנדרטי. בדיקות צומת אקסון כפולות Z תוכננו לקביעת מצב EGFRvIII בשתי דגימות פרפין קבוע פורמלין משובץ, או FFPE גליובלסטומה. שתי הבדיקות מסוג הבר זיהו אות בשתי הדגימות, מה שמצביע על כך ששתי הדגימות מבטאות EGFR מסוג פראי.
עם זאת, הגשושית המוטנטית זיהתה אות רק בדגימה החיובית EGFRvIII ולא בדגימה השלילית EGFRvIII. בדיקות בקרה חיוביות ושליליות נכללו בבדיקה. כאשר בוצעה בדיקת מטרה קצרה על תאי ג'ורקט, שהוכנו ככדור תא FFPE באמצעות בדיקות אנטיסנס או חישה, התמקדות ברצפים באדום, נצפתה צביעה חזקה עם בדיקות אנטיסנס הן עבור CDR3-alpha והן עבור CDR3-beta, בעוד שבדיקות חישה זיהו אות מועט או ללא אות.
dapB שימש כביקורת שלילית. הבדיקה מסוגלת גם לזהות מוטציות נקודתיות. בדוגמה זו, תוכננו שתי בדיקות, האחת לאיתור רצף ה-EGFR המוטנטי L858R והשנייה לאיתור רצף ה-EGFR L858 הפראי.
הגשושית המוטנטית זיהתה אות בקו התאים H1975, שהוא הטרוזיגוט עבור מוטציית EGFR L858R, אך לא זיהתה אות בקו התאים H2229, המבטא רק את הסוג הפראי של EGFR L858. הגשושית מסוג פרא זיהתה אות בשני קווי התאים. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לתקן כראוי את הרקמות שלך, להפעיל בדיקות בקרה חיוביות ושליליות ולהשתמש במערכת עיבוד השקופיות בתנור הכלאה.
בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו IHC עם סמני תאים על מנת לענות על שאלות נוספות כמו זיהוי ביטוי ספציפי לסוג התא של וריאנטים של חיבור או רצפי מטרה קצרים. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים במדעי המוח, אונקולוגיה ומעבר לכך לחקור אירועי שחבור חלופיים בהקשר הרקמה, לזהות מוטציות נקודתיות ממופות מרחבית, ולדמיין רצפים הומולוגיים וקצרים מאוד באתרם. אל תשכח שעבודה עם פורמלין וקסילן ניטרליים עלולה להיות מסוכנת ביותר ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון עבודה במכסה אדים ולבישת ציוד מגן אישי בעת ביצוע הליך זה.
סקירה כללית
מאמר זה מציג בדיקת היברידיזציה באתר (in situ hybridization) המאפשרת זיהוי רגיש וספציפי של רצפי RNA קצרים עד ל-50 נוקלאוטידים ברמת התא הבודד. השיטה ישימה בתחומים שונים, כולל מדעי המוח ואונקולוגיה, ומסייעת בויזואליזציה של וריאנטים של שחזור (splice variants) ומוטציות בתוך הקשרי רקמה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- אונקולוגיה
- ביולוגיה מולקולרית
רקע
- הibridiization in situ היא טכניקה עוצמתית לחקר ביטוי גנים.
- רזולוציה של תא בודד מאפשרת ניתוח מפורט של הטרוגניות תאית.
- זיהוי של וריאנטים של שחזור (splice variants) ומוטציות הוא חיוני להבנת מנגנוני מחלה.
- ניתן לבצע את הבדיקה באופן ידני או אוטומטי, דבר המשפר את נגישותה.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה לזיהוי רצפי RNA קצרים ברגישות גבוהה.
- מתן אפשרות לוויזואליזציה של תבניות ביטוי גנים בדגימות רקמה.
- סיוע במחקר על ביטוי ספציפי לסוגי תאים בהקשרים ביולוגיים שונים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת דגימות רקמה באמצעות קיבוע בפורמלין וטמיעה בפרפין.
- חיתוך הרקמה לפרוסות דקות לצורך היברידיזציה.
- שימוש בריאגנטים לשחזור מטרה ובחיובי (probes) להיברידיזציה.
- הגברת אותות באמצעות סדרת ריאגנטים לשיפור הגילוי.
תוצאות עיקריות
- הבדיקה זיהתה בהצלחה נקודות חיבור של אקסונים ומוטציות נקודתיות.
- הושגה ספציפיות ורגישות גבוהות בניתוחים של תאים בודדים.
- הודגמה ויזואליזציה של וריאנטים של שחלוף (splice variants) ברקמות מוח וגידולים.
- השיטה הראתה פוטנציאל ליישומים רחבים יותר בתחומי מחקר שונים.
מסקנות
- בדיקת ההיברידיזציה באתר (in situ hybridization) זו היא כלי בעל ערך למחקר בביולוגיה מולקולרית.
- היא מספקת תובנות לגבי ביטוי גנים ברמת התא הבודד.
- הטכניקה יכולה לסייע בהבנת תהליכים ביולוגיים ומחלות מורכבות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
זיהוי מדויק של סממנים ביולוגיים (biomarkers) מסוג RNA בהקשר הרקמתי המקורי שלהם הוא קריטי עבור תיקוף מטרות ופיתוח תרופות מונחה-סממנים באונקולוגיה ובמדעי העצבים. בדיקת ההיברידיזציה של RNA in situ זו מאפשרת ויזואליזציה רגישה וספציפית של וריאנטים של שחול (splice variants), רצפים קצרים ומוטציות נקודתיות ברזולוציית תא בודד, ובכך תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים ובסנכרון של סממנים ביולוגיים תרגומיים. על ידי שימור המידע המרחבי המאבד בשיטות של גריסה וקישור (grind-and-bind), היא מגבירה את הביטחון החזוי בבחירת מטרות פרה-קליניות ובהחלטות של תעדוף תיקי פיתוח.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות הדמיה של וריאנטים של שחזור ספציפיים לחיבורי אקסונים, כגון EGFRvIII ו-METΔ14, בהקשר רקמתי.
- ערך תפעולי: מספק נתונים ברזולוציית תא בודד להבהרת הפעלת מסלולים והטרוגניות תאית בסביבות מיקרו של גידולים.
- ערך מדעי: תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי הבחנה בין אללים מוטנטיים לאללים מסוג הפרא ברזולוציית נוקלאיד בודד (למשל, EGFR L858R, KRAS G12A).
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: מזהה מטרות RNA באורך של עד 50 נוקלאוטידים, מה שמאפשר פרופיל רצף CDR3 ברפרטוארים אימונולוגיים לצורך גילוי מטרות לאימუნו-אונקולוגיה.
- ערך תפעולי: תואם לפלטפורמות צביעה אוטומטיות, ובכך תומך בסטנדרטיזציה של הבדיקה וב khả năng הרחבה (scalability) לאורך תוכניות פרה-קליניות.
- ערך מדעי: מייצר תוצאות כמותיות בעלות רזולוציה מרחבית, המסייעות באופטימיזציה של הבדיקה ובהערכת השחזוריות שלה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מדגים את הרלוונטיות למחלה באמצעות זיהוי של וריאנטים בעלי משמעות קלינית במודלים של גליובלסטומה ב-FFPE ובקווי תאים.
- ערך תפעולי: מאפשר רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי שמירה על ההקשר המורפולוגי במהלך הניתוח המולקולרי.
- ערך מדעי: מסייע בהתאמה של ביומרקרים על ידי קישור וריאנטים גנטיים לפנוטיפים תאיים בחתכי רקמה.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
הבדיקה משתלבת ברצף הגילוי, החל מזיהוי המטרה ועד לאופטימיזציה של המולקולות המובילות (lead optimization), במיוחד במקרים שבהם תיקוף מרחבי של שינויים גנטיים תורם לביסוס הוודאות לגבי המטרה ולהפחתת סיכונים.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות לגבי התפקוד של וריאנטים של שחלוף (splice variant) והשפעת מוטציות במבנה רקמה טבעי.
- סריקה: מאפשרת הכנה של מערכות ביולוגיות מאושרות לסריקת תרכובות במצב הבא, באמצעות אישור של מטרות ברזולוציה מרחבית.
- אנליטיקה: מספקת מדידות כמותיות של וריאנטים של RNA ברמת תא בודד, המסייעות בהשוואת תנאי ניסוי ויחסי אללים.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין ממצאים מולקולריים להקשר היסטופתולוגי, ובכך תומכת במודלים של סיווג חולים המבוססים על סמנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מהווה פלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר לצורך ניטור ארוך טווח של ביטוי מטרות במודלים שונים ובהתערvויות טיפוליות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף מטרה על ידי הפחתת עמימות מכניסטית הנובעת משיטות RNA בגישת bulk.
- ערך תפעולי: מבטיח שחזור באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים התואמים לזרימות עבודה ידניות ואוטומטיות.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go על ידי אספקת ראיות עם רזולוציה מרחבית למעורבות המטרה ולשכיחות וריאנטים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעוד עדיפויות של מטרות מותאם סיכון, בהתבסס על ביטוי משותף (co-expression) עם סממנים פנוטיפיים ברקמה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות באימונוהיסטוכימיה, פתולוגיה מולקולרית וטכניקות של היברידיזציה של חומצות גרעיניות.
- תלוי בגישה לתנורי היברידיזציה, מערכות לעיבוד שקופיות ומצבעים אוטומטיים לשימוש בספיקה גבוהה.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית בין ההיסטולוגיה, הביולוגיה המולקולרית והביואינפורמטיקה לצורך עיצוב גששים ועקביות בפרשנות הנתונים.
- חייב להתחשב במשתני קיבוע רקמה (למשל, זמן חדירת הפורמלין) העשויים להשפיע על הנגישות של מטרות RNA קצרות או בעלות מבנה.
- מוגבל על ידי זמינות המטרה; היעילות תלויה בספציפיות של הגשש ובנגישות של האפיטופים בחתכים של FFPE.
שאלות נפוצות בתחום הביופארמה
Chapters in this video
0:04
Title
0:41
Tissue Preparation
1:30
Equipment and Reagent Preparation
3:24
Sample Deparaffinization, Dehydration, and Pre-treatment
5:26
Probe Hybridization, Signal Amplification, and Detection
7:18
Counterstaining, Slide Mounting, and Visualization
8:18
Results: Detection of Splice Variants, Short Sequences, and Point Mutation In Situ
10:00
Conclusion
