בידוד והדמיה פלורסצנטיות עבור שחזור יחיד-חלקיקים של Chlamydomonas Centrioles

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלת מפתח בתחום centriole, כגון לוקליזציה של חלבון לאזור מסוים של centriole. היתרון העיקרי של טכניקות אלה שאנו מספקים את האמצעים להתרכז centriole כדי לקבל אותם בכיוון מרובה. למרות שיטה זו יכולה לספק תובנות לביולוגיה Centriole Chlamydomonas, זה יכול להיות מיושם גם על מערכת אחרת, כגון centrioles אדם ופרמקיום מבודדים.

הפגנת ההליך תהיה דוקטורנט ניקולאי קלנה, דוקטורנט נוסף מאיבה לה גונק, והפוסט-דוקטורט במעבדה Davide Gambarotto. כדי להתחיל בהליך זה, הכן תחילה את כל המדיה והתרבות של התאים C.Reinhardtii כמתואר בפרוטוקול הטקסט. מעבירים את התאים המוכנים לצינורות חרוטיים 50 מיליליטר וצנטריפוגה אותם ב 600 פעמים g במשך 10 דקות.

לשטוף את גלולה פעם אחת עם 50 מיליליטר של 1x PBS ולסובב את התאים שוב ב 600 פעמים גרם במשך 10 דקות. השתמש פיפטה כדי לנצל מחדש את גלולה ב 100 מיליליטר של חיץ deflagellation טמפרטורת החדר. מניחים את המזווה על ערבוב מגנטי, ומוסיפים לאט 0.5 חומצה אצטית טוחה ל- pH סופי של 4.5 עד 4.7.

תן תערובת זו דגירה בטמפרטורת החדר במשך שתי דקות. לאחר מכן לאט להוסיף טיפות של אחד נורמלי אשלגן הידרוקסיד כדי לשחזר את ה- pH ל 7.0, להעביר את התאים 50 צינורות מיליליטר, צנטריפוגה אותם ב 600 פעמים g במשך 10 דקות, כדי להסיר כל דגלה מנותקת. השליכו את העל-טבעי ואחסנו את גלולת הקרח עד שהם מוכנים לכביסה.

כאשר מוכן, לשטוף את גלולה פעמיים באמצעות 50 מיליליטר של 1x PBS בארבע מעלות צלזיוס לכל לשטוף. לסובב את גלולה שטף ב 600 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. תן שימוש חוזר את גלולה ב30 מיליליטר של 1x PBS.

לאחר מכן, לאט לטעון את ההשעיה על כרית 20 מיליליטר של 25% סוכרוז, ללא ערבוב. סובב במהירות של פי 600 גר' ו-4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות כדי להסיר את כל הדגלה שנותרה ולהפיץ את התאים בסופרוס. באמצעות שאפה, בזהירות שאף את supernatant שמירה רק התחתון ביותר 20 מיליליטר.

לשטוף את סוכרוז הנותרים על ידי הוספת 20 מיליליטר של קר 1x PBS. צנטריפוגה ב 600 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. תן מחדש את גלולה ב 10 מיליליטר של 1x PBS בארבע מעלות צלזיוס, לוודא כי אין גושים בפתרון.

מעבירים את גלולת resuspended לבקבוק חדש 250 מיליליטר, מוסיפים את מאגר תיזה, בתוספת 5, 000 יחידות של DNase, לבקבוק המכיל את התאים. דגירה בארבע מעלות צלזיוס במשך שעה אחת, תוך ערבוב כל 15 דקות על ידי היפוך זהיר של הבקבוק. מעבירים את התאים lysed לצינור חרוט 50 מיליליטר וצנטריפוגה ב 600 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.

באמצעות פיפטה, לאסוף את supernatant ולהעמיס אותו לתוך צינור עגול תחתון 30 מיליליטר על קרח המכיל שני מיליליטר של כרית סוכרוז 60%. צנטריפוגה זה ב 10, 000 פעמים g במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שאף את העל-טבעי עד למיליליטר אחד מעל כרית סוכרוז.

שים לב לממשק הצהוב בין המיליליטר היחיד של העל-טבעי שנותר, לבין שני המיליליטרים של כרית סוכרוז. בעזרת קצה P1000 חתוך, מערבבים בעדינות את העל-טבעי הנותר עם הסוכרוז. בריכה כל כריות סוכרוז ולאחסן אותם על קרח.

לאחר מכן, הכינו שיפוע של 40%-70% סוכרוז בצינור פוליפרופילן דק-קירות של 38.5 מיליליטר כמפורט בפרוטוקול הטקסט. טען באיטיות את הממשקים המאגרים לתוך מעבר הצבע. לאזן את הצינורות עם חיץ K-PIPES 10 מילימולאר, וצנטריפוגה ב 68, 320 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך 75 דקות.

לאחר מכן, השתמש במחט 0.8 מילימטר כדי להפוך חור בתחתית הצינור, הקפדה לא להפריע שכבות סוכרוז שונות. השתמש בחור זה כדי לאסוף 12 500 שברי מיקרוליטר בארבע מעלות צלזיוס. בעזרת קצה P200 חתוך, הכינו 10 מיליליטר נוספים מכל שבר שישמש במהלך הכשל החיסוני.

לאחר מכן, להקפיא את השברים בחנקן נוזלי. כדי להתחיל, מניחים כיסוי סטרילי של 12 מילימטרים על הקצה התחתון שקוע של הקונצנטרי, הקפד לשמור על הצד מצופה PDL למטה. מניחים את המתאם ישירות על גבי, כדי לכסות את כיסוי.

לאחר מכן, הפוך את הצינור התחתון העגול והצב אותו מעל הקונצנטרי, הכיסוי והמתאם. באמצעות פינצטה, בעדינות לדחוף את ההרכב עד שהוא מגיע לתחתית הצינור, ולאחר מכן להפוך את הצינור. הוסף 10 מילימולר של מאגר K-PIPES עד שהוא מגיע לראש הקונצנטרי.

ודא כי אין בועות בצילינדר המרכזי של הקונצנטרי. הוסיפו בעדינות 100 מיקרוליטרים של חיץ K-PIPES 10 מילימולרי לאחד האליקוטים של שבר המרכז המועשר ומערבבים ביסודיות באמצעות פיפטה P200. לאחר מכן, הסר 100 מיקרוליטרים של מאגר K-PIPES מהמרכז החלול של הקונצנטרי, והוסף 100 מיקרוליטרים של תערובת שברי המאגר, וודא שהתוכן נשאר במרכז החלול של הקונצנטרי.

מסתובבים ב 10, 000 פעמים גרם במשך 10 דקות בצנטריפוגה כי הוא מקורר מראש לארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, השתמש פינצטה כדי להסיר את הקונצנטרי. הכנס מכשיר מחובר בעבודת יד לתוך החור הנוכחי בקצה מחורר של המתאם ולהרים בעדינות כדי לשחזר את המכסה.

ברגע שהוא מגיע לראש הצינור, להשתמש באצבע כפפה כדי ללכוד את קצה המתאם ולהשתמש פינצטה כדי להסיר את כיסוי, להיות מודע איזה צד של coverslip מכיל centrioles. לאחר מכן, לבצע קיבעון וכתמים immunofluorescence של centrioles מרוכז. כדי להתחיל, דגירה של כיסויים עם centrioles בתיבת מעבדת העברת פוליסטירן גביש מוכן מלא 100% מתנול במינוס 20 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.

בעזרת פינצטה, מעבירים את הכיסויים לקופסת מעבדה שקופה מלאה ב-50 מיליליטר של 1x PBS. תן לשקופיות לשטוף ב- PBS במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, פיפטה 60 מיקרוליטרים של תערובת נוגדנים ראשונית על פיסת איטום מעבדה לעטוף בתא לח.

בזהירות להניח את כיסויים על גבי תערובת הנוגדנים עם centrioles ישירות מול הירידה. תן לכיסויים דגירה במשך 45 דקות. לאחר מכן, להסיר את coverslips ולשטוף אותם בקופסה המכילה PBS במשך חמש דקות.

הדגירה של הכיסויים השטופים למשך 45 דקות, עם נוגדנים משניים ב-PBS 1%BSA ו-0.05%Tween-20. מוציאים את הכיסויים ושוטפים אותם במשך חמש דקות בקופסה המכילה PBS. באמצעות מדיום הרכבה רגיל נגד דהיה, הרכבה של המכסה על שקופית.

לאחר מכן, דמיין את המרכזים המבודדים על מיקרוסקופ קונפוקל ביעד שמן 63X עם N.A.of 1.4, תוך החלת deconvolution. הגדר את המיקום העליון והתחתון של מחסנית Z מעל ומתחת לאות centriole, בהתאמה, ולרכוש ערימה גדולה של תמונות הכולל אות centriole. הקרן את המחסנית ובצע ממוצע של חלקיק יחיד כמפורט בפרוטוקול הטקסט.

כשל חיסוני מייצג מגלה כי שישה שברים מועשרים עבור centrioles מבודדים, עם שיא עבור שבר מספר שלוש, בעוד שני החלקים האחרונים אינם, המציין כי הטיהור הוא מוצלח. רק כ-30 סנטריולים נראים לכל שדה מבט ללא הרכז, בעוד 183 נראים עם הרכז. זה מוכיח כי צעד הרכז הוא מוצלח, ומאפשר העשרה של פי שישה של centrioles באזור מוגדר, מה שהופך אותו קל יותר לזהות ולדמיין אותם.

מיקרוסקופיה ברזולוציה סופר משמשת לאחר מכן לתמונה centrioles מוכתמים עבור טובולין monoglutamylated, תוכנה משמשת כדי ליצור ממוצע כמעט מושלם עבור כל אוריינטציה שנבחרה. לאחר חמש איטראציות, שתי מחלקות של ממוצעים נוצרו של centrioles monoglutamylated:מבט עליון מ 63 אובייקטים ותצוגה צדדית מ 98 חלקיקים. אורך הממוצע של המחלקה בצד התצוגה הוא 260 ננומטר עם קוטר של 250 ננומטר, דומה לאות טובולין monoglutamylated נמדד כי הוא ראה לוקליזציה בתוך הליבה של centriole.

בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לשמור את המרכז המבודד על הקרח ולהקפיא אותם לאחר הבידוד. בעקבות הליך זה, שיטה אחרת, כמו מיקרוסקופ קריו-אלקטרונים וספקטרומטריית מסה יכולה להתבצע על מנת לענות על שאלה נוספת, כגון הארכיטקטורה המקורית של centriole או הרכב חלבון centriole.