מבוסס על צלחת Large-scale טיפוח Caenorhabditis elegans: הכנת הדוגמא על המחקר של שינויים מטבוליים בחולי סוכרת
24 באוגוסט 2018
פרוטוקול זה מתאר שיטה לגידול בקנה מידה גדול Caenorhabditis elegans במדיה מוצק. כחלופה תרבית נוזלית, פרוטוקול זה מאפשר קבלת הפרמטרים של סולמות שונים המעובדים המבוסס על צלחת. פעולה זו מגדילה את comparability של תוצאות על-ידי השמטת את ההבדלים מטבולית מורפולוגיים בין תרבות המדיה נוזלי ומוצק.
בתחום C.elegans, שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח הדורשות ייצור של אוכלוסיות נמטודות גדולות ודגימות באמצעות תרבית צלחות. היתרונות העיקריים של פרוטוקול זה הם הקמתו הקלה, וקלות התיאור שלו, כולל מלכודות ויישומים. לאחר השגת אוכלוסייה מסונכרנת של נמטודות, הוסף כמיליליטר אחד של מאגר M 9 לצלחות, וחלק בזהירות את המאגר על ידי הנפת הצלחות.
לאחר מכן, אספו את הנמטודות בצינור של 15 מיליליטר. כעת, הפוך את הצינור והשתמש במיקרוסקופ כדי להעריך את צפיפות הנמטודות. התאם את צפיפות המתלה לפי הצורך, והמשך להעריך אותו במיקרוסקופ.
מרחו 150 מיקרוליטר מהמתלה ישירות על הצלחות בעזרת קצות פיפט ששונו. כדי להבטיח חלוקה שווה של נמטודות בין הלוחות, הפוך את צינור המתלה במרווחי זמן קבועים. ראשית, שטפו את הנמטודות באמצעות קצה פיפט שונה עם כ-500 מיקרוליטר של מאגר M nine.
בעזרת אותו חיץ, המשיכו לנתק את הנמטודות עד שרוב החיות נאספות בתרחיף. לאחר מכן, קח את הנמטודות עם קצה פיפט שונה, והעביר אותן לצלחת עם OP50. קצות הפיפט ששונו מפחיתים את מתח הגזירה והנזק לנמטודות בגלל קוטר גדול יותר.
לאחר מכן, הניחו לצלחת להתייבש. לפני איסוף הדגימות, הכינו חנקן נוזלי כדי להקפיא את הנמטודות שנאספו. לאחר מכן, הניחו את M 9 buffer על הקרח.
מרחו מיליליטר אחד של מאגר M nine על כל צלחת, וסובבו בעדינות כדי לשטוף כל צלחת. לאחר מכן, קח את הנפח של מאגר M nine, והעביר אותו לצינורות חדשים של 15 מיליליטר. צנטריפוגה את הצינור לזמן קצר ב-800 פעמים גרם, לפני הסרת רוב המאגר M nine.
לאחר מכן, שטפו את הדגימות שלוש פעמים עם 10 מיליליטר של מאגר M nine כדי להסיר חיידקים. בעזרת פיפטת זכוכית מעבירים כל כדור לצינור ריק של 1.5 מיליליטר. השתמש בפיפטת הזכוכית כדי לקחת מיליליטר אחד של מאגר M 9 מהצינור השני של 1.5 מיליליטר, כדי לשטוף את הנמטודות מדופן הפיפטה.
לאחר מכן, שטפו את הנמטודות הנותרות מצינורות 15 מיליליטר, והעבירו אותן לצינורות הדגימה. לאחר מכן, צנטריפוגה את צינורות הדגימה ב-19,000 פעמים גרם למשך דקה אחת, והסר כמה שיותר סופרנטנט. לאחר מכן, אטמו כל צינור בסרט פרפין, והקפיאו אותם מיד בחנקן נוזלי.
אחסן את הצינורות במינוס 80 מעלות צלזיוס עד להכנת ליזאט. הוסף את אותם נפחים של חרוזי תחמוצת זירקוניום 0.5 מילימטר, וכפול מנפח מאגר הליזאט עם קוקטייל מעכב פרוטאינאז לכל דגימה קפואה. לאחר מכן, הניחו את הצינורות בהומוגנייזר למשך דקה אחת במהירות תשע.
צנטריפוגה של הדגימות למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס, ו-19,000 פעמים גרם. לבסוף, העבירו את הסופרנטנט לצינור חדש על קרח, ואחסנו אותו במינוס 80 מעלות צלזיוס לניסויים עתידיים. בפרוטוקול זה, כמויות גדולות של C.elegans תורבבו ליישומים בחקר הסוכרת.
מספר הנמטודות שנאספו נמצא בקורלציה לתפוקת החלבון של הליזאט, מה שמדגים שניתן להשיג בידוד חלבון כמותי הניתן לשחזור באמצעות פרוטוקול זה. ניתוחים ספקטרומטריים של המטבוליט התגובתי מתילגליוקסל, ותוצרי קצה גליקציה מתקדמים שנוצרו על ידי חשיפה למתילגליוקסל מוצגים כאן. נמטודות ובקרות שטופלו בגלוקוז הושוו.
העברת נמטודות באמצעות פיפטה עלולה ליצור מתח גזירה, מה שעלול לפגוע בנמטודות. רמות העקה החמצונית בנמטודות ובנמטודות שהועברו באמצעות חוט מתכת לא היו שונות באמצעות פרוטוקול זה. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו כתם מערבי, על מנת לענות על שאלות נוספות בפרוטאומיקה.
פרוטוקול זה גם מקל על ניסויים המקשרים פרמטרים מרובים לאותה אוכלוסייה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר שיטה לגידול רחב-היקף של Caenorhabditis elegans על מצע מוצק. גישה זו מקלה על הפקת אוכלוסיות ומדגמים גדולים של נמטודות, ובכך משפרת את יכולת ההשוואה של התוצאות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה התפתחותית
- מיקרוביולוגיה
רקע
- Caenorhabditis elegans הוא אורגניזם מודל נפוץ מאוד.
- גידול על מצע מוצק (Plate-based cultivation) מציע יתרונות על פני תרבית נוזלית.
- הבנת הדינמיקה של אוכלוסיות נמטודות היא קריטית ליישומים מחקריים שונים.
- שיטה זו נותנת מענה לשאלות מפתח בתחום ה-C.elegans.
מטרת המחקר
- ביסוס פרוטוקול מהימן לגידול של C.elegans על מצע מוצק.
- מתן אפשרות להפקה של אוכלוסיות נמטודות מסונכרנות.
- סיוע בביצוע ניסויים הדורשים גודלי מדגם גדולים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- סנכרון של אוכלוסיות נמטודות.
- החלת באפר M nine על הצלחות.
- הערכה מיקרוסקופית של צפיפות הנמטודות.
- התאמה של צפיפות התרחף לפי הצורך.
תוצאות עיקריות
- הקמה מוצלחת של תרביות נמטודות בקנה מידה גדול.
- שיפור ההשוואתיות של תוצאות הגידול על מצעי פיתוח (plate-based).
- זיהוי מכשולים פוטנציאליים בפרוטוקול.
- יישומים בהקשרי מחקר שונים.
מסקנות
- פרוטוקול זה מספק שיטה חסונה לגידול של C.elegans.
- הוא משפר את היכולת לבצע ניסויים בקנה מידה גדול.
- השיטה היא פשוטה וניתנת לשחזור.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית לדרג הניהולי
גידול בקנה מידה גדול של C. elegans מאפשר בידוד כמותי וניתן לשחזור של חלבונים לצורך גילוי סמנים ביולוגיים הקשורים לסוכרת, ובכך תומך בתיקוף של מטרות בסיבוכים ניו روندגנרטיביים. שיטה זו מספקת זרימת עבודה ניתנת להרחבה עם מינימום מאמץ גזירה עבור אנליזה פרוטאומיות של AGEs ו-ROS, שניתן ליישמה ישירות להפחתת סיכונים מכניסטיים בשלבים מוקדמים של גילוי תרופות. על ידי הפיסחול של הכנת אוכלוסייה מסונכרנת תחת תנאים מבוקרים, היא מגבירה את רמת הביטחון החזויה במודלים פרה-קליניים של פתולוגיה סוכרתית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות הקושרות חשיפה לגלוקוז להיווצרות AGE ו-ROS במודלים נוירונליים.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות מתאם הדירות של תפוקת חלבון עם מספר הנמטודות.
- ערך ניבוי: מסייע במיון תיקי פיתוח על ידי אספקת נתונים פרוטאומיים כמותיים לזיהוי מועמדים מובילים במסלולי סיבוכי סוכרת.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מכין מערכות ביולוגיות מותקפות עבור יישומים של western blot וספקטרומטריית מסות בהמשך התהליך.
- שחזוריות: סטנדרטיזציה של הכנת הדגימות כדי למזער השפעות פיזיולוגיות ולהבטיח תוצאות פרוטאומיות עקביות.
- יכולת הרחבה: מאפשר שילוב של ניתוחים מרובים תחת תנאי תרבית זהים לצורך תאימות לסריקה בעתקת נתונים גבוהה (high-throughput screening).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: תומך בחקר סיבוכים של סוכרת באמצעות מודלים של C. elegans המראים הצטברות של AGE ו-ROS ללא משתנים מכשילים כליים.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין שלב הגילוי לתיקוף פרה-קליני על ידי אפשור הכנה עקבית של דגימות בתנאים ניסיוניים שונים.
- קידום מותאם סיכון: מספק ליזאטים אמינים לניתוח סמנים ביולוגיים, ובכך מפחית תוצאות חיוביות שגויות בעדפות של מטרות טיפוליות.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד (Pipeline)
שיטה זו ממוקמת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות דרך זיהוי מובילים ועד לאישוש פרה-קליני, והיא תומכת ספציפית במחקר של ניוון עצבי הקשור לסוכרת.
- ביולוגיה של תגליות: תומך בבדיקת היפותזות של שינויים מטבוליים בסוכרת באמצעות אנליזה כמותית של חלבונים ומטבוליטים.
- סריקה: מספק דגימות מוכנות לבדיקה עם צפיפות סטנדרטית ומאמץ גזירה מינימלי להערכה אמינה של תרכובות.
- אנליטיקה: מאפשר מדידה בספקטרומטריית מסות של methylglyoxal ו-AGEs, ומספק תוצאות כמותיות להשוואה בין מצבים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין גילוי פנוטיפ נוירונלי לרצף פרה-קליני באמצעות זרימות עבודה פרוטאומיות עקביות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר לגידול נמטודות בקנה מידה גדול במגוון מחקרים הקשורים לסוכרת.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות על ידי הפחתת עמימות מכניסטית במודלים של סיבוכים סוכרתיים.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה ושחזוריות לאורך תהליכי עבודה פרוטאומיים, תוך מזעור השונות בהכנת הליזאט.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go באמצעות נתוני ביומרקרים אמינים, ובכך מפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים בתוכניות לסוכרת.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של מטרות מותאם סיכון, בהתבסס על נתונים שחזירים של מודולציית AGE ו-ROS.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול ובטכניקות סנכרון של C. elegans.
- מצריך גישה לצנטריפוגות, הומוגניזטורים וחנקן נוזלי לעיבוד דגימות.
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית של הערכת צפיפות הת сусפנסיה ושל פרוטוקולי שטיפה.
- כולל שיקולי התאמה בעת העברה בין צלחות עם תנאים ניסיוניים שונים.
- כולל מגבלות מעשיות הקשורות לצמצום מאמץ גזירה במהלך שלבי הפיפטינג, המטופלות באמצעות טיפים מותאמים.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:04
Title
0:27
Large Scale Culture on Plates
1:15
Transfer of Large Amounts of Caenorhabditis elegans
1:52
Harvest of a Large Caenorhabditis elegans Sample
3:20
Protein Isolation for Mass Spectrometry
3:56
Results: Reproducible Quantitative Protein Isolation and Further Applications of Large-scale C. elegans Culture
4:47
Conclusion
