הערכה של הממשק סינפטית של תאי T האנושי העיקרי של דם היקפיים ורקמות הלימפה
July 30th, 2018
הפרוטוקול מתאר טכניקה ללמוד את היכולת של ראשי תאי T polyclonal האנושי כדי ליצור ממשקים סינפטית באמצעות השומנים מישורי bilayers. אנו משתמשים בטכניקה זו כדי להראות את היכולת היווצרות סינפסה דיפרנציאלית של האדם בתאי T העיקרי נגזר לימפה ודם היקפי.
הגישה שעליה נדבר היום נגזרה כדי להשוות תכונות ופעילויות תפקודיות של תאי T שמקורם ברקמות ותאי T בדם היקפי. חשיבות הנושא מודגמת על ידי העובדה שתאי T בדם היקפי מייצגים רק 20% מכלל תאי ה-T בגוף. היכולת לחקור מספר קטן של תאי T שמקורם ברקמה היא חיונית מאוד, וזה בדיוק מה שהשגנו.
היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא דורשת מספר קטן יותר של תאים ונפחים קטנים יותר של ריאגנטים מאשר טכניקות מסורתיות. התחל בשימוש במלקחיים מסוג מספריים מפוליפרופילן כדי לטבול כיסויי זכוכית בתמיסת פיראנה חומצית שהוכנה טרייה למשך 25 עד 30 דקות. בתום הכביסה יש לשטוף את הכיסויים שבע פעמים בנפח טרי של מים טהורים במיוחד לכל כביסה.
לאחר מכן הניחו את הכיסויים הרטובים בצד כדי לאפשר למים הנותרים להתגלגל מהזכוכית הנקייה. כאשר הכיסויים יבשים, יש לשים שני מיקרוליטר מתערובת הליפוזום הסופית בדיוק במרכז תעלת החלקה דביקה בתוך מכסה זרימה סטרילי. ומיד אך בזהירות יישר כיסוי נקי ויבש אחד עם המגלשה כדי לאפשר להוריד את הכיסוי בעדינות על הצד הדביק של המגלשה.
והשתמש בטבעת החיצונית של המלקחיים מסוג מספריים מפוליפרופילן כדי להפעיל לחץ עדין על המגע ההיקפי של הכיסוי עם המגלשה, וודא שההחלקה מחוברת היטב למגלשה כדי למנוע דליפה. לאחר מכן הפוך את השקופית והשתמש בטוש קבוע כדי לצייר ארבע נקודות סביב השכבה הדו-שכבתית בצד החיצוני של מכלול השקופיות. לפני ההזרקה הראשונה, ייעד יציאה אחת של התעלה כיציאת הכניסה, והשנייה כיציאת היציאה, תוך שמירה על ייעוד זה לאורך כל הניסוי.
כדי למנוע היווצרות בועות, הכנס את קצה קצה הפיפט ישירות לפתח הכניסה עד שתרגיש את אטם הגומי של תעלת ההחלקה חודר עם הקצה. מלאו לאט את התעלה ב-50 מיקרוליטר של מאגר בדיקה חם. הזרקו 200 מיקרוליטר של ניקל (II) כלוריד בתמיסת חסימת קזאין לפתח הכניסה.
והסר 50 מיקרוליטר של המאגר מיציאת היציאה. לאחר דגירה של 45 דקות, הסר את תמיסת הקזאין העודפת מיציאת היציאה. הזרקו 100 מיקרוליטר של ICAM-1 בתמיסת סטרפטווידין לפתח הכניסה לדגירה של 45 דקות בטמפרטורת החדר.
בתום הדגירה, הסר את תמיסת החלבון העודפת מיציאת היציאה. ושטפו את השכבה הדו-שכבתית פעמיים עם 100 מיקרוליטר של מאגר בדיקה לכל כביסה. לאחר מכן סמן את הדו-שכבות ב-100 מיקרוליטר של נוגדן אנטי-CD3 מצומד פלואורו-4 למשך 45 דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן שתי שטיפות ב-100 מיקרוליטר של מאגר בדיקה לכל שטיפה כפי שהודגם. כדי לדמות אינטראקציות דו-שכבתיות של תאי T, הנח את השקופית על השלב המחומם של 37 מעלות צלזיוס של פלואורסצנציה של השתקפות פנימית כוללת, או מיקרוסקופ TIRF. והתאם את ה-stage באמצעות סימני הדיו כדי למרכז את השכבה הדו-שכבתית על המטרה של 100 כוח.
להדמיית שחרור גרגירים, הוסף שברי נוגדנים נגד CD107A מצומדים פלואורסצנטיים לתרחיף תאי CD4 T. ולהשעות מחדש את התאים המסומנים ב-50 מיקרוליטר של מאגר בדיקה להזרקה ליציאת הכניסה של תעלת השקופיות. לאחר מכן בחר את המספר המתאים של שדות הניסוי, והקלט תמונות של כל שדה אחת לדקה למשך 30 דקות לאחר ההזרקה.
בניסוי מייצג זה, לא נצפו הבדלים בין תאי CD8 T שיצרו סינפסות אימונולוגיות קלאסיות על שכבות השומנים שנבנו בתא הזרימה או בשקופית הזרימה הרב-ערוצית. עם האינטראקציה הדו-שכבתית של השומנים, תאי CD4 T יצרו סינפסות חיסוניות בוגרות, אך משחררים או לא משחררים גרגירים, משחררים גרגירים ללא היווצרות סינפסות בוגרות, או לא יוצרים סינפסות ולא משחררים גרגירים. יש לציין כי תאי CD4 T שמקורם בתאים חד-גרעיניים בדם היקפי מסוגלים להתחיל לשחרר גרגירים כמעט פי שניים מהר יותר מאשר תאי CD4 שמקורם בבלוטות הלימפה.
בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לשמור על טמפרטורה קבועה ופיפט לאט כדי שלא ייווצרו בועות. בנוסף ליכולות שלנו לחקור ממשק דו-שכבתי של תאי T, גישה זו תאפשר לנו גם לבצע צביעה בין-תאית של תאי T שנגעו בשכבה הדו-שכבתית. מה שיקל משמעותית על כמות מידע שניתן להשתמש בה כדי לתאר תאי T מסוימים שמקורם ברקמת לימפה או רקמות אחרות.
אל תשכח שעבודה עם תמיסת פיראנה היא מסוכנת ביותר, וחשוב שתלבש PPE מתאים בזמן שאתה מנסה הליך זה.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
פרוטוקול זה מתאר טכניקה לחקר יכולות היווצרות ממשק סינפטי של תאי T פוליקלונליים אנושיים ראשוניים באמצעות דו-שכבות שומן פלנריות. המחקר מדגיש את ההבדלים ביצירת הסינפסה בין תאי T שמקורם בבלוטות הלימפה לבין אלו שמקורם בדם היקפי.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- נוירולוגיה
- אימונולוגיה
- ביולוגיה של התא
רקע
- תאי T בדם היקפי מהווים רק 20% מכלל תאי ה-T בגוף.
- חקר תאי T שמקורם ברקמות חיוני להבנת תגובות חיסוניות.
- הטכניקה מאפשרת ניתוח עם פחות תאים ותגובנים בהשוואה לשיטות מסורתיות.
- דו-שכבות שומן פלנריות מספקות מודל לחקר אינטראקציות תאים.
מטרת המחקר
- להשוות את יכולות יצירת הסינפסה של תאי T שמקורם ברקמות ותאי T מדם היקפי.
- לפתח שיטה הדורשת פחות תאים לניתוח.
- לשפר את ההבנה של פונקציונליות תאי T בסביבות שונות.
שיטות ששימשו
- הכנת מכסי זכוכית באמצעות תמיסת פירניה חומצית.
- שטיפת מכסי זכוכית במים טהורים במיוחד.
- שימוש בדו-שכבות שומן פלנריות לחקר אינטראקציות תאי T.
- הערכת יצירת ממשק סינפטי בין תאי T לבין דו-שכבות שומן.
תוצאות עיקריות
- הוכחה ליכולות שונות של יצירת סינפסה של תאי T ממקורות שונים.
- אימות היעילות של הטכניקה בחקר אוכלוסיות תאים קטנות.
- השגת תובנות לגבי הפעילות הפונקציונלית של תאי T ברקמות שונות.
- הדגשת היתרונות של שימוש בכמות קטנה יותר של תגובנים בהגדרות ניסוייות.
מסקנות
- הפרוטוקול מאפשר בהצלחה את חקר יצירת הסינפסה של תאי T.
- הוא מספק כלי חשוב לחוקרים החוקרים את פונקציונליות תאי T.
- התוצאות עשויות להיות בעלות משמעות להבנת תגובות חיסוניות בבריאות ובמחלות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Direct assessment of synaptic interfaces in primary human T cells from both peripheral blood and lymphoid tissue addresses a critical gap in translational immunology and cell therapy R&D. This technique enables mechanistic de-risking and predictive confidence by allowing functional interrogation of rare tissue-derived T cell populations using minimal sample input. The approach supports portfolio decisions by providing quantitative, reproducible data on T cell activation and granule release kinetics relevant to immune modulation strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct functional comparison of tissue- and blood-derived T cells for target validation.
- Supports mechanistic de-risking by revealing differences in synapse formation and granule release kinetics.
- Facilitates hypothesis testing on immune cell activation pathways using primary human samples.
- Provides quantitative outputs for portfolio triage and early-stage decision making.
Screening & Assay Development
- Establishes a reproducible, low-input assay platform for evaluating T cell activation and effector function.
- Supports assay standardization and scalability by minimizing cell and reagent requirements.
- Enables screening of functional responses in rare or limited primary cell populations.
- Delivers quantitative, time-resolved readouts suitable for compound or biologic evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro findings with disease-relevant tissue T cell phenotypes for translational continuity.
- Enables risk-adjusted advancement by comparing functional outputs across health and disease contexts.
- Supports biomarker discovery by correlating synaptic interface dynamics with functional granule release.
- Provides mechanistic insights to inform preclinical model selection and validation.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery and translational research by enabling direct, quantitative analysis of primary T cell function from both blood and tissue sources.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of T cell activation and synapse formation mechanisms.
- Screening: Provides a standardized, scalable assay for functional screening of T cell responses.
- Analytics: Delivers quantitative, time-resolved measurements of granule release and synaptic interface formation.
- Translational Research: Facilitates alignment of in vitro findings with disease-relevant tissue phenotypes.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for diverse immune cell functional studies across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in T cell functional studies.
- Operational Value: Minimizes sample and reagent requirements, enabling studies with rare or limited primary cells.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust, quantitative data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of immune modulation programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell isolation and advanced fluorescence microscopy.
- Demands access to TIRF microscopy and precise fluid handling instrumentation.
- Standardization of assay conditions is critical for reproducibility across teams.
- Adaptation may be needed for different tissue sources or T cell subsets.
- Careful handling of hazardous reagents and strict adherence to safety protocols are essential.
