הערכה של הממשק סינפטית של תאי T האנושי העיקרי של דם היקפיים ורקמות הלימפה
30 ביולי 2018
הפרוטוקול מתאר טכניקה ללמוד את היכולת של ראשי תאי T polyclonal האנושי כדי ליצור ממשקים סינפטית באמצעות השומנים מישורי bilayers. אנו משתמשים בטכניקה זו כדי להראות את היכולת היווצרות סינפסה דיפרנציאלית של האדם בתאי T העיקרי נגזר לימפה ודם היקפי.
הגישה שעליה נדבר היום נגזרה כדי להשוות תכונות ופעילויות תפקודיות של תאי T שמקורם ברקמות ותאי T בדם היקפי. חשיבות הנושא מודגמת על ידי העובדה שתאי T בדם היקפי מייצגים רק 20% מכלל תאי ה-T בגוף. היכולת לחקור מספר קטן של תאי T שמקורם ברקמה היא חיונית מאוד, וזה בדיוק מה שהשגנו.
היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא דורשת מספר קטן יותר של תאים ונפחים קטנים יותר של ריאגנטים מאשר טכניקות מסורתיות. התחל בשימוש במלקחיים מסוג מספריים מפוליפרופילן כדי לטבול כיסויי זכוכית בתמיסת פיראנה חומצית שהוכנה טרייה למשך 25 עד 30 דקות. בתום הכביסה יש לשטוף את הכיסויים שבע פעמים בנפח טרי של מים טהורים במיוחד לכל כביסה.
לאחר מכן הניחו את הכיסויים הרטובים בצד כדי לאפשר למים הנותרים להתגלגל מהזכוכית הנקייה. כאשר הכיסויים יבשים, יש לשים שני מיקרוליטר מתערובת הליפוזום הסופית בדיוק במרכז תעלת החלקה דביקה בתוך מכסה זרימה סטרילי. ומיד אך בזהירות יישר כיסוי נקי ויבש אחד עם המגלשה כדי לאפשר להוריד את הכיסוי בעדינות על הצד הדביק של המגלשה.
והשתמש בטבעת החיצונית של המלקחיים מסוג מספריים מפוליפרופילן כדי להפעיל לחץ עדין על המגע ההיקפי של הכיסוי עם המגלשה, וודא שההחלקה מחוברת היטב למגלשה כדי למנוע דליפה. לאחר מכן הפוך את השקופית והשתמש בטוש קבוע כדי לצייר ארבע נקודות סביב השכבה הדו-שכבתית בצד החיצוני של מכלול השקופיות. לפני ההזרקה הראשונה, ייעד יציאה אחת של התעלה כיציאת הכניסה, והשנייה כיציאת היציאה, תוך שמירה על ייעוד זה לאורך כל הניסוי.
כדי למנוע היווצרות בועות, הכנס את קצה קצה הפיפט ישירות לפתח הכניסה עד שתרגיש את אטם הגומי של תעלת ההחלקה חודר עם הקצה. מלאו לאט את התעלה ב-50 מיקרוליטר של מאגר בדיקה חם. הזרקו 200 מיקרוליטר של ניקל (II) כלוריד בתמיסת חסימת קזאין לפתח הכניסה.
והסר 50 מיקרוליטר של המאגר מיציאת היציאה. לאחר דגירה של 45 דקות, הסר את תמיסת הקזאין העודפת מיציאת היציאה. הזרקו 100 מיקרוליטר של ICAM-1 בתמיסת סטרפטווידין לפתח הכניסה לדגירה של 45 דקות בטמפרטורת החדר.
בתום הדגירה, הסר את תמיסת החלבון העודפת מיציאת היציאה. ושטפו את השכבה הדו-שכבתית פעמיים עם 100 מיקרוליטר של מאגר בדיקה לכל כביסה. לאחר מכן סמן את הדו-שכבות ב-100 מיקרוליטר של נוגדן אנטי-CD3 מצומד פלואורו-4 למשך 45 דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן שתי שטיפות ב-100 מיקרוליטר של מאגר בדיקה לכל שטיפה כפי שהודגם. כדי לדמות אינטראקציות דו-שכבתיות של תאי T, הנח את השקופית על השלב המחומם של 37 מעלות צלזיוס של פלואורסצנציה של השתקפות פנימית כוללת, או מיקרוסקופ TIRF. והתאם את ה-stage באמצעות סימני הדיו כדי למרכז את השכבה הדו-שכבתית על המטרה של 100 כוח.
להדמיית שחרור גרגירים, הוסף שברי נוגדנים נגד CD107A מצומדים פלואורסצנטיים לתרחיף תאי CD4 T. ולהשעות מחדש את התאים המסומנים ב-50 מיקרוליטר של מאגר בדיקה להזרקה ליציאת הכניסה של תעלת השקופיות. לאחר מכן בחר את המספר המתאים של שדות הניסוי, והקלט תמונות של כל שדה אחת לדקה למשך 30 דקות לאחר ההזרקה.
בניסוי מייצג זה, לא נצפו הבדלים בין תאי CD8 T שיצרו סינפסות אימונולוגיות קלאסיות על שכבות השומנים שנבנו בתא הזרימה או בשקופית הזרימה הרב-ערוצית. עם האינטראקציה הדו-שכבתית של השומנים, תאי CD4 T יצרו סינפסות חיסוניות בוגרות, אך משחררים או לא משחררים גרגירים, משחררים גרגירים ללא היווצרות סינפסות בוגרות, או לא יוצרים סינפסות ולא משחררים גרגירים. יש לציין כי תאי CD4 T שמקורם בתאים חד-גרעיניים בדם היקפי מסוגלים להתחיל לשחרר גרגירים כמעט פי שניים מהר יותר מאשר תאי CD4 שמקורם בבלוטות הלימפה.
בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לשמור על טמפרטורה קבועה ופיפט לאט כדי שלא ייווצרו בועות. בנוסף ליכולות שלנו לחקור ממשק דו-שכבתי של תאי T, גישה זו תאפשר לנו גם לבצע צביעה בין-תאית של תאי T שנגעו בשכבה הדו-שכבתית. מה שיקל משמעותית על כמות מידע שניתן להשתמש בה כדי לתאר תאי T מסוימים שמקורם ברקמת לימפה או רקמות אחרות.
אל תשכח שעבודה עם תמיסת פיראנה היא מסוכנת ביותר, וחשוב שתלבש PPE מתאים בזמן שאתה מנסה הליך זה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מפרט טכניקה לבחינת יכולות ההיווצרות של ממשק סינפטי בתאי T אנושיים פוליקלונליים ראשוניים באמצעות שכבות ליפיד מישוריות (planar lipid bilayers). המחקר מדגיש את ההבדלים ביצירת הסינפסה בין תאי T שהופקו מקשרי לימפה לבין תאים שהופקו מדם פריפרי.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- אימונולוגיה
- ביולוגיה של התא
רקע
- תאי T מדם פריפריאלי מהווים רק 20% מסך תאי ה-T בגוף.
- חקר תאי T המופקים מרקמות הוא חיוני להבנת התגובות החיסוניות.
- הטכניקה מאפשרת ביצוע אנליזה עם פחות תאים וריאגנטים בהשוואה לשיטות מסורתיות.
- שכבות ליפידיות מישוריות (Planar lipid bilayers) מספקות מודל לחקר אינטראקציות בין תאים.
מטרת המחקר
- להשוות את יכולות היווצרות הסינפסים של תאי T המופקים מרקמות לעומת תאי T מדם פריפריאלי.
- לפתח שיטה הדורשת מספר תאים קטן יותר לצורך אנליזה.
- להעמיק את ההבנה של תפקוד תאי T בסביבות שונות.
שיטות שהשתמשו בהן
- הכנת לוחות כיסוי מזכוכית באמצעות תמיסת פיראנה חומצית.
- שטיפת לוחות הכיסוי במים אולטרה-טהורים.
- שימוש בשכבות ליפידיות דו-שכבתיות מישוריות (planar lipid bilayers) למחקרי אינטראקציה של תאי T.
- הערכת היווצרות ממשק סינפטי בין תאי T לשכבות ליפידיות דו-שכבתיות.
תוצאות עיקריות
- הדגמה של יכולות שונות ליצירת סינפסות של תאי T ממקורות שונים.
- אישור יעילותה של הטכניקה בחקר אוכלוסיות תאים קטנות.
- אספקת תובנות לגבי פעילויות תפקודיות של תאי T ברקמות שונות.
- הדגשת היתרונות שבשימוש בכמות קטנה יותר של ריאגנטים במערכים ניסיוניים.
מסקנות
- הפרוטוקול מאפשר בצורה מוצלחת את חקר היווצרות הסינפסה של תאי T.
- הוא מהווה כלי בעל ערך עבור חוקרים הבוחנים את התפקוד של תאי T.
- לממצאים עשויות להיות השלכות על הבנת התגובות החיסוניות במצב בריאותי ובמצב מחלה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הערכה ישירה של ממשקים סינפטיים בתאי T אנושיים ראשוניים, הן מדם פריפריאלי והן מרקמה לימפואידית, נותנת מענה לפער קריטי באימונולוגיה תרגומית ובמו"פ של טיפולים תאיים. טכניקה זו מאפשרת הפחתת סיכונים מכניסטית וביטחון חיזוי על ידי היתרה של בירור פונקציונלי של אוכלוסיות נדירות של תאי T המופקים מרקמות, תוך שימוש בכמות מינימלית של דגימה. גישה זו תומכת בקבלת החלטות לגבי תיקי פיתוח על ידי אספקת נתונים כמותיים וניתנים לשחזור על אקטיבציה של תאי T וקינטיקה של שחרור גרנולות הרלוונטיים לאסטרטגיות של מודולציה חיסונית.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר השוואה תפקודית ישירה של תאי T המופקים מרקמות ומדם לצורך תיקוף מטרה.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי חשיפת הבדלים ביצירת סינפסות ובקינטיקה של שחרור גרנולות.
- מסייע בבחינת היפותזות על מסלולי הפעלת תאי מערכת החיסון באמצעות דגימות אנושיות ראשוניות.
- מספק פלטים כמותיים לצורך תעדוף פורטפוליו וקבלת החלטות בשלבים מוקדמים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מקימה פלטפורמת בדיקה הניתנת לשחזור עם כמות קלט נמוכה להערכת הפעלת תאי T ותפקוד אפקטורי.
- תומכת בסטנדרטיזציה של הבדיקה ובסקאלביליות על ידי מזעור הדרישות לתאים ולריאגנטים.
- מאפשרת סריקה של תגובות פונקציונליות באוכלוסיות תאים ראשוניים נדירות או מוגבלות.
- מספקת תוצאות כמותיות עם רזולוציית זמן המתאימות להערכת תרכובות או חומרים ביולוגיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מקשר בין ממצאים במערכות in vitro לבין פנוטיפים של תאי T ברקמות הרלוונטיות למחלה, לצורך רצף תרגומי.
- מאפשר קידום מותאם סיכון באמצעות השוואת תפוקים תפקודיים בין הקשרי בריאות ומחלה.
- תומך בגילוי סמנים ביולוגיים על ידי מתאם בין הדינמיקה של הממשק הסינפטי לבין שחרור גרנולות תפקודי.
- מספק תובנות מכניסטיות להנחיית הבחירה והתיקוף של מודלים פרה-קליניים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
שיטה זו מגשרת בין שלבי הגילוי המוקדמים למחקר תרגומי על ידי מתן אפשרות לניתוח כמותי וישיר של תפקוד תאי T ראשוניים ממקורות של דם ורקמה כאחד.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקה מבוססת היפותזה של מנגנוני הפעלת תאי T ויצירת סינפסות.
- סריקה: מספקת בדיקה סטנדרטית וניתנת להרחבה לסריקה תפקודית של תגובות תאי T.
- אנליטיקה: מספקת מדידות כמותיות בעלות רזולוציה של זמן של שחרור גרנולות ויצירת ממשק סינפטי.
- מחקר תרגומי: מקל על התאמת ממצאים in vitro לפנוטיפים של רקמות הרלוונטיים למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה לשימוש חוזר למחקרים תפקודיים של תאי חיסון מגוונים במגוון תוכניות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרי תפקוד של תאי T.
- ערך תפעולי: ממזער את הדרישות לדגימות ולריאגנטים, ובכך מאפשר מחקרים עם תאים ראשוניים נדירים או מוגבלים.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) ויעילות הון על ידי אספקת נתונים כמותיים חסונים בשלב מוקדם של תהליך הפיתוח.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים ובקידום של תוכניות למודולציה חיסונית.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בבידוד תאים ראשוניים ובמיקרוסקופיה פלואורסצנטית מתקדמת.
- נדרשת גישה למיקרוסקופיית TIRF ולמכשור מדויק לטיפול בנוזלים.
- סטנדרטיזציה של תנאי הבדיקה היא קריטית לשחזור התוצאות בין צוותים שונים.
- ייתכן שיידרש ביצוע התאמות עבור מקורות רקמה שונים או תת-אוכלוסיות של T cells.
- טיפול זהיר בריאגנטים מסוכנים והקפדה מחמירה על פרוטוקולי בטיחות הם חיוניים.
