Name: שיטה תרבות Proximal ללמוד Paracrine איתות בין תאים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: חקור אינטראקציות פרקריניות בין תאי סרטן שחלות לתאי מזנכימה בפריטונאום באמצעות שיטת תרבות פרוקסימלית פשוטה ושחזורית. שיטה זו מבודדת איתות פרקריני תוך מניעת מגע ישיר בין תאים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

. אנחנו חבים החולים בשל השתתפותם באוסף רקמות לניסויים אלה. משרד ההגנה OCRP השחלות סרטן האקדמיה פרס (W81XWH-15-0253) פרס פיילוט מקרן קולין החלום כדי מיטרה ק' חן תמיכה במחקר זה.

הפרוטוקול עוקב אחר הקווים המנחים של לוח רגולטוריים מוסדי של אינדיאנה האוניברסיטה.
1. תא הכנה
<ol><li>
בידוד של התרבות התאים mesothelial האנושית ראשי
	<ol>
<li>ולבודד ראשי התאים mesothelial האנושית (HPMCs) מ omentum האנושי כפי שתואר לעיל17,18 . ותגדל אותם להשלים את מדיום הגידול [בינוני (DMEM ששינה הנשר של Dulbecco) המכילה סרום שור עוברית 10%, 1% פניצילין-סטרפטומיצין, 1% שאינם חיוניים חומצות אמינו וויטמינים 1%]-CO 37 ° C ו-5%2. הערה: HPMCs גדלים בדרך כלל 100% הנהרות (איור 1 א').</li>
	</ol>
</li>
	<li>
תנאי הגידול של תאים סרטניים בשחלות
	<ol>
<li>לגדול HeyA8 תאים סרטניים בשחלות במדיום גידול מלאה-CO 37 ° C ו- 5%2. הערה: שימוש HeyA8 תאים בוגרים עד כ 80% הנהרות (איור 1B).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. תרבית תאים
<ol><li>
הגדרת התרבות צינתור
	<ol>
<li>שימוש Transwell מוסיף עבור 6-ובכן לוחות עם קרום μm בעובי רקמת תרבות-שטופלו פוליקרבונט 10 עם μm 0.4 נקבוביות (108 נקבוביות/cm2) ואזור הגדילה 4.67 ס מ2 . אם יש צורך, למטב לגדלים שונים הוספה בעזרת שינוי מספר התאים נזרע על פי הצמיחה את פני השטח. מדיום הגידול מלאה חמה טריפסין, באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) עד 37 ° C לפני השימוש.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הכנת את המכסים
	<ol>
<li>כדי להפיץ את התאים HeyA8 על המשטח התחתון של הקרום של הקדמי, הסר את תותב מאריזתו באמצעות מלקחיים סטרילי ולמקם אותו הפוך לצלחת תרבות סטרילי 15 ס מ.</li>
		<li>השתמש צלחת 15 ס מ, שכן יש את עומק כדי להכיל את תותב הפוכה, או תחליף את זה עם שום מיכל סטרילי המתאים. בהתאם הניסוי, הכנס את המספר הנדרש של מוסיף המנה 15 ס מ.</li>
		<li>תווית הפקדים, שלושה תנאים ניסיוני בהתאם עם סמן על קצה השרוול.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הכנת התאים הסרטניים
	<ol>
<li>כדי trypsinize את התאים HeyA8 גדל ב- 80% הנהרות בבקבוקון2 25 ס מ (~ 2 x 106 תאים), להוסיף 1 מ"ל של טריפסין (0.25%) עבור s 40-60 ולנטרל את טריפסין עם 6 מ של מדיום הגידול מלאה.</li>
		<li>Centrifuge התאים ב x 500 g בטמפרטורת החדר (RT) במשך 3 דקות, למחוק את תגובת שיקוע ולאחר resuspend בגדר תא ב 5 מ של מדיום הגידול מלאה. לספור את התאים הפועלים בשיטת אי-הכללה של צבע כחול של trypan.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
זריעה של תאים סרטניים
	<ol>
<li>להשעות 100,000 תאים למ"ל של תאים חיים HeyA8 במדיום גידול מלאה. בזהירות זרע 80,000 HeyA8 תאים הושעו ב 800 μL של מדיום הגידול המלא בתחתית תותב (אשר כעת מול, מאז זה היא הפוכה).</li>
		<li>זרע התאים כדי ליצור צורת הכיפה, כמו אז התאים נשארים על תותב (איור 1C). מהמרכז של הקרום ומתחילים לנוע כלפי חוץ במעגלים תוך לאט pipetting. הימנע הולך יותר מ 3 מ מ מהקצה כדי למנוע כל שפיכת המדיום. הערה: מספר התאים נזרע תלויות הצמיחה של התאים ושל משך הניסוי. מספר התאים HeyA8 נזרע לתרבות הזאת צינתור אופטימציה, התאים יהיה 80-90% confluent בסוף היום השלישי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
סרטן התא מצורף
	<ol>
<li>מכסים את הכלי 15 ס מ ולהעביר בזהירות את המנה המכיל את המכסים את החממה2 CO. זה חיוני לא לשבש את טיפת בינוני ותאים על תותב בשלב זה. להשאיר את התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות לאפשר את התאים הסרטניים לצרף הכנס.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הכנת התאים mesothelial
	<ol>
<li>לאחר כ 4 שעות, trypsinize את HPMCs גדלו ב 100% הנהרות בבקבוקון2 75 ס מ (~ 4 x 106 תאים) עם 2 מ של טריפסין (0.25%) 1-2 דקות, לנטרל את טריפסין עם 12 מ של מדיום הגידול מלאה.</li>
		<li>Centrifuge התאים ב 500 x g ב- RT למשך 3 דקות, resuspend בגדר תא ב- 10 מ"ל של מדיום הגידול מלאה, ולספור את התאים הפועלים בשיטת אי-הכללה של צבע כחול של trypan.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
זריעה התאים mesothelial
	<ol>
<li>להשעות 300,000 תאים למ"ל של HPMCs בשידור חי במדיום הגידול מלאה. להוסיף 2.5 מ של מדיה טריים צמיחה מלאה כל טוב של צלחת 6-. טוב. בקפידה להביא את המנה 15 ס מ המכיל את המכסים את מכסה המנוע אבטחה. באמצעות מלקחיים סטרילי, להפוך את תותב ומניחים אותו בתוך הבאר של צלחת 6-ובכן כך הוא זקוף, עם תאי HeyA8 המחובר למשטח התחתון שקוע בתוך מדיום הגידול מלאה (איור 1C).</li>
		<li>HPMCs זרע 450,000 הושעו ב- 1.5 מ של מדיום הגידול בתוך החלק הפנימי של התוספות עם תאי HeyA8 אל פני השטח פונה לחלק התחתון של הבאר (איור 1C) או מוסיף ללא תאים HeyA8 עבור הפקדים HPMC. להוסיף 1.5 מ של מדיום הגידול ללא תאים לפקדים HeyA8.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
גדל את התרבות צינתור
	<ol>
<li>תן את התרבות proximal לגדל בחממה CO2 -37 ° C ו- 5% CO2 עבור 72 h. אם נדרש, המדיום ניתן לחידוש כדלקמן.<ol>
<li>הפנימי של תותב, להסיר 750 µL ולהוסיף µL 750 של מדיום הגידול שלם טרי.</li>
			<li>על החלק החיצוני של תותב (לוח 6-טוב), להסיר 1 מ"ל ולהוסיף 1 מ"ל של מדיום הגידול שלם טרי. 1 mL נבחרה עבור הנוחות של שינוי המדיום בצעד אחד. אם רצונך בכך, 1.25 mL יכול להיות הוסר, החליף במקום.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
איסוף התאים
	<ol>
<li>לאסוף את התאים לאחר 72 h של תרבות הפרוקסימלית. לקחת טיפול מיוחד בשלב זה כדי למנוע זיהום צולב בין התאים HeyA8 HPMCs. Trypsinize את התאים, centrifuge אותם, ואת lyse בגדר במקום התאים על קרום למניעת זיהום צולב של lysing.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Trypsinizing תאים
	<ol>
<li>לשטוף את שני צידי תותב עם 1 x PBS.</li>
		<li>להעביר את הכיסויים באר חדשה והוסף טריפסין. להוסיף 0.5 מ של טריפסין הפנימי של תותב ולהוסיף 2 מ של טריפסין לצלחת 6-טוב כדי trypsinize את התאים הסרטניים המצורפת המשטח התחתון של הקדמי. דגירה את הצלחת למשך 2 דקות ב 37 º C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
נטרול של טריפסין
	<ol>
<li>להוסיף 1 מ"ל של מדיום הגידול מלאה בתוך התותב, כדי לנטרל את טריפסין, פיפטה למעלה ולמטה, לקחת את התאים ואז להעביר אותם ל צינור אוסף תוויות. הוסף אוטם 2 נוספים של מדיום הגידול מלאה על נטרול מוחלט. צריך לקחת לא לחדור את הקרום בעת pipetting כדי למנוע של זיהום צולב של התאים.</li>
		<li>כדי לאסוף את התאים על החלק התחתון של הקדמי, pipette של טריפסין 2 מ"ל שנוסף בשלב 12.2 על גבי המשטח התחתון 2 – 3 x כך התאים ליפול לתוך החלק התחתון של הלוח 6-. טוב. לנטרל את טריפסין בתחתית הצלחת עם 6 מ של מדיום הגידול ולהעביר את התוכן של הצלחת צינור אוסף תוויות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
איסוף של lysing את התאים
	<ol>
<li>Centrifuge התאים ב x 500 g למשך 3 דקות, וארוקן את המדיה. Resuspend ואת lyse כדורי תא 0.7 מ של ריאגנט פירוק פנול guanidine thiocyanate-מבוססות על החילוץ RNA. לבודד את הרנ א באמצעות כל ערכת מתאימים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. תגובת שרשרת של פולימראז כמותיים בזמן אמת
הערה: השלבים הבאים מתארים את תגובת שרשרת כמותיים פולימראז בזמן אמת (qPCR) ללמוד את השינויים ביטויים ג'ין בעקבות התרבות הפרוקסימלית.
<ol><li>היכונו cDNA מדגימות RNA qPCR. השתמש רוורס טרנסקריפטאז מתאימים לכל עם מאגר המתאימים, תחל אקראי כדי להבטיח שעתוק לאחור של כל ה-mRNA (ראה טבלה של חומרים).</li>
	<li>להעריך את השינויים ברמות ביטוי mRNA של fibronectin (FN1) ו- E-קדהרין (CDH1), גורם הגדילה בטא 1 (TGFβ1) על ידי qPCR עם גליצראלדהיד 3-פוספט דהידרוגנאז (GAPDH) כפקד פנימי של שינוי צורה. זה אפשרי להשתמש מתוקננת מבחני ביטוי גנים זמינים מסחרית (ראו טבלה של חומרים) או לעצב תחל.</li>
	<li>להשוות את התאים HeyA8 גדלו בתרבות צינתור עם HPMCs עם הפקדים HeyA8, את HPMCs גדלו בתרבות צינתור עם הפקדים HPMC.</li>
</ol>

<ol><li>Hanahan, D., Coussens, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accessories+to+the+crime%3A+functions+of+cells+recruited+to+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment.</a> Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).</li>
<li>Cupedo, T., Mebius, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+interactions+in+lymph+node+development%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cellular interactions in lymph node development.</a> The Journal of Immunology. 174 (1), 21-25 (2005).</li>
<li>Suvas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Substance+P+Neuropeptide+in+Inflammation%2C+Wound+Healing%2C+and+Tissue+Homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Role of Substance P Neuropeptide in Inflammation, Wound Healing, and Tissue Homeostasis.</a> The Journal of Immunology. 199 (5), 1543-1552 (2017).</li>
<li>Gnecchi, M., Danieli, P., Malpasso, G., Ciuffreda, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+Mechanisms+of+Mesenchymal+Stem+Cells+in+Tissue+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Paracrine Mechanisms of Mesenchymal Stem Cells in Tissue Repair.</a> Methods in Molecular Biology. , 123-146 (2016).</li>
<li>Lionetti, V., Bianchi, G., Recchia, F. A., Ventura, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+autocrine+and+paracrine+myocardial+signals%3A+an+emerging+therapeutic+strategy+in+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Failure+Reviews%22%5BJournal%5D)">Control of autocrine and paracrine myocardial signals: an emerging therapeutic strategy in heart failure.</a> Heart Failure Reviews. 15 (6), 531-542 (2010).</li>
<li>Nicosia, R. F., Zorzi, P., Ligresti, G., Morishita, A., Aplin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+regulation+of+angiogenesis+by+different+cell+types+in+the+aorta+ring+model%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Paracrine regulation of angiogenesis by different cell types in the aorta ring model.</a> International Journal of Developmental Biology. 55 (4-5), 447-453 (2011).</li>
<li>Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tackling+the+cancer+stem+cells+-+what+challenges+do+they+pose%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Tackling the cancer stem cells - what challenges do they pose.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 13 (7), 497-512 (2014).</li>
<li>Plaks, V., Kong, N., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cancer+stem+cell+niche%3A+how+essential+is+the+niche+in+regulating+stemness+of+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The cancer stem cell niche: how essential is the niche in regulating stemness of tumor cells.</a> Cell Stem Cell. 16 (3), 225-238 (2015).</li>
<li>Elenbaas, B., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotypic+signaling+between+epithelial+tumor+cells+and+fibroblasts+in+carcinoma+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Heterotypic signaling between epithelial tumor cells and fibroblasts in carcinoma formation.</a> Experimental Cell Research. 264 (1), 169-184 (2001).</li>
<li>Wilson, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGFR+ligands+exhibit+functional+differences+in+models+of+paracrine+and+autocrine+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Growth+Factors%22%5BJournal%5D)">EGFR ligands exhibit functional differences in models of paracrine and autocrine signaling.</a> Growth Factors. 30 (2), 107-116 (2012).</li>
<li>Kopan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Notch signaling.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (10), (2012).</li>
<li>Singh, A. B., Sugimoto, K., Harris, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Juxtacrine+activation+of+epidermal+growth+factor+%28EGF%29+receptor+by+membrane-anchored+heparin-binding+EGF-like+growth+factor+protects+epithelial+cells+from+anoikis+while+maintaining+an+epithelial+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Juxtacrine activation of epidermal growth factor (EGF) receptor by membrane-anchored heparin-binding EGF-like growth factor protects epithelial cells from anoikis while maintaining an epithelial phenotype.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (45), 32890-32901 (2007).</li>
<li>Swartz, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+microenvironment+complexity%3A+emerging+roles+in+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tumor microenvironment complexity: emerging roles in cancer therapy.</a> Cancer Research. 72 (10), 2473-2480 (2012).</li>
<li>Mitra, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+reprogram+normal+fibroblasts+into+cancer-associated+fibroblasts+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs reprogram normal fibroblasts into cancer-associated fibroblasts in ovarian cancer.</a> Cancer Discovery. 2 (12), 1100-1108 (2012).</li>
<li>Nieman, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocytes+promote+ovarian+cancer+metastasis+and+provide+energy+for+rapid+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Adipocytes promote ovarian cancer metastasis and provide energy for rapid tumor growth.</a> Nature Medicine. 17 (11), 1498-1503 (2011).</li>
<li>Salimian Rizi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+mediates+metabolic+coupling+of+omentum-derived+adipose+stroma+to+ovarian+and+endometrial+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide mediates metabolic coupling of omentum-derived adipose stroma to ovarian and endometrial cancer cells.</a> Cancer Research. 75 (2), 456-471 (2015).</li>
<li>Mitra, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironment-induced+downregulation+of+miR-193b+drives+ovarian+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Microenvironment-induced downregulation of miR-193b drives ovarian cancer metastasis.</a> Oncogene. 34 (48), 5923-5932 (2015).</li>
<li>Tomar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ETS1+induction+by+the+microenvironment+promotes+ovarian+cancer+metastasis+through+focal+adhesion+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">ETS1 induction by the microenvironment promotes ovarian cancer metastasis through focal adhesion kinase.</a> Cancer Letters. 414, 190-204 (2018).</li>
<li>Mitra, A. K. Ovarian Cancer Metastasis: A Unique Mechanism of Dissemination. Tumor Metastasis. Xu, K. , InTechOpen. Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.intechopen.com/books/tumor-metastasis/ovarian-cancer-metastasis-a-unique-mechanism-of-dissemination">https://www.intechopen.com/books/tumor-metastasis/ovarian-cancer-metastasis-a-unique-mechanism-of-dissemination</a> 43-58 (2016).</li>
<li>Iwanicki, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+cancer+spheroids+use+myosin-generated+force+to+clear+the+mesothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium.</a> Cancer Discovery. 1 (2), 144-157 (2011).</li>
<li>Kenny, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesothelial+cells+promote+early+ovarian+cancer+metastasis+through+fibronectin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Mesothelial cells promote early ovarian cancer metastasis through fibronectin secretion.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4614-4628 (2014).</li>
<li>Boelens, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+transfer+from+stromal+to+breast+cancer+cells+regulates+therapy+resistance+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Exosome transfer from stromal to breast cancer cells regulates therapy resistance pathways.</a> Cell. 159 (3), 499-513 (2014).</li>
<li>Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+and+function+of+exosomes+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The biology and function of exosomes in cancer.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1208-1215 (2016).</li>
<li>Kohlhapp, F. J., Mitra, A. K., Lengyel, E., Peter, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+as+mediators+and+communicators+between+cancer+cells+and+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs as mediators and communicators between cancer cells and the tumor microenvironment.</a> Oncogene. 34 (48), 5857-5868 (2015).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

הבנת המנגנון של paracrine ו- juxtacrine איתות בין תאים חיוני לפיתוח ידע טוב יותר של הרקמות הומאוסטזיס ומחלות תנאים7,8. רוב paracrine איתות הלימודים מתנהלים על ידי איסוף ממוזגים בינוני בין תא אחד סוג משתמש בו כדי לטפל בסוג התא השני. בשיטה זו יש יתרון הפשטות הטבועה. עם זאת, זה לא מדויק מסכם את הדברים את ריכוזי הגורמים המופרש microenvironment הסלולר מקומי או את קינטיקה של ייצור, דלדול של הגורמים המעורבים. בעוד שהראשון ניתן לטפל במידה מסוימת, אבל לא במדויק, על ידי רי...

התפקיד של פורה אינטראקציות הדדיים בין תאים סרטניים microenvironment את הגידול בהתקדמות הגידול הוכח גם, הפך מוקד מרכזי מחקר הסרטן ביולוגיה1. מקרים דומים של איתות דו-כיווניים מכריעים במהלך ריפוי, תגובות חיסוניות, אנגיוגנזה, גומחות תאי גזע, הפצע ובמהלך ההתפתחות2,3,4,5,6 , 7 , 8. נושא משותף כל התהליכים הביולוגיים האלה הוא התאים מגיבים בדרכים שונות כדי רמזים חוץ-תאית מ שלהם microenvironment הקובעים גורל, פיזיולוגיה של רקמות, התקדמות המחלה. לכן, המוקד הפך יותר ויותר לכיוון פיתוח הבנה טובה יותר של המנגנונים המעורבים בתקשורת תא-תא כזה. רוב האינטראקציות כזה כרוך paracrine או juxtacrine איתות בין תאים. Paracrine איתות כרוך ההפרשה של גורמים איתות ספציפית בתא אחד אשר נתפסים על ידי רצפטורים המתאימים על תא אחר בסביבה, מפעילה תגובה בה9,10, ואילו juxtacrine איתות דורש מגע ישיר בין מרכיבי התא לשני תאים מעורב11,12.
איתות כזה הוא מרכיב קריטי רקמות הומאוסטזיס, כמו גם את microenvironment הגידול. התאים הסרטניים תועלת paracrine גורמים juxtacrine של תאי הגידול stroma, לרבות סרטן הקשורים fibroblasts (CAFs), תאים חיסוניים adipocytes13,14,15,16. Paracrine איתות להיות מתווכת על-ידי גורמי גדילה, ציטוקינים, נוגדנים, וכדומה, ואילו האיתות juxtacrine כרוך ליגנדים juxtaposed קולטנים חריץ איתות, או אינטראקציות בין אינטגרינים שלהם בהתאמה מטריצה חוץ-תאית חלבונים. הראו את החשיבות של אינטראקציות הדדיים בין תאים סרטניים בשחלות CAFs התקדמות, גרורות הגידול14. באופן דומה, לווסת האינטראקציות של תאים סרטניים בשחלות metastasizing עם התאים mesothelial כיסוי האתר של גרורות מיקרו Rna מפתח ואת גורמי שעתוק של תאים סרטניים אשר לקדם קולוניזציה גרורתי17, 18.
רוב המחקרים על paracrine איתות לערב את השימוש שנאספו מכל סוג תא אחד להתייחס את סוג התא השני עם מדיום ממוזגים. בעת גישה זו כבר בשימוש נרחב, זה ביעילות לא לשכפל את רמות ריכוז גבוהה המותאמות לשפות אחרות של הגורם המופרש microenvironment של התא המקבל. זה גם לא יצליח לשחזר את קינטיקה של הזרם רציפה של הגורם המופרש שיופקו בתא אחד, שהתקבלו על-ידי התא הסמוך. Paracrine איתות יעילה במרחקים קצרים כמו הגורמים המופרש נמצאים בריכוזים נדרש רק בקרבת מקור התא, נוטים לפזר ו לדלל את המרחק גודלת. זה הריכוז הגבוה המותאמות לשפות אחרות של הגורם המופרש חיונית כדי לעורר תגובה התא קולטן. יתר על כן, התגובה בתאים הנמען הוא גם תלוי האיזון של דלדול רציפה שלהם דרך השפלה, איגוד, הפנמה תאים הנמען, דיפוזיה מן התא מקור וגורמי לאחרונה המופרש. ממוזגים בינוני יכול להיות מרוכז לחשבון עבור ריכוז מקומי גבוה נוכח microenvironment, אבל זה לא במדויק לשכפל את הריכוזים המדויק. יתר על כן, זה לא יכול לחקות את קינטיקה הטבעית של ייצור, דלדול של הגורם מעורב. באופן מדויק יותר לשכפל paracrine איתות ולהפריד אותו מן juxtacrine איתות מנגנונים, אנחנו המציאו שיטה תרבות proximal חדשניים, אשר כולל גוברת על סוגי תאים שני במשטח או של קרום נקבובי. הנקבוביות הם קטנים מספיק כדי למנוע juxtacrine אינטראקציות, עדיין לאפשר החליפין של גורמים המופרש בריכוזים גבוהים לשפות אחרות. בדרך הזאת, המערכת שומרת את קינטיקה של ייצור, דלדול של הגורמים paracrine.

<table><tbody><tr><td>תמיכה חדירה של Transwell 24 מ"מ עם 0.4 ומיקרו; m נקבוביות פוליקרבונט קרום הכנסת קרום</td><td>(Costar)</td> <td>3412</td><td>&bull; 10 ומיקרו; קרום פוליקרבונט שקוף עבה מ ושור; מטופל לחיבור תאים אופטימלי ושור; ארוז 6 תוספות בצלחת 6 בארות, 4 צלחות למארז ושור; יש לצבוע את הממברנה לצורך נראות התא ושור; מעוקר על ידי קרינת גמא</td></tr><tr><td>צלחת 6 בארות</td><td>קורנינג (פלקון)</td><td>353046</td><td>תחתית שטוחה, מטופלת TC, סטרילית, עם מכסה</td></tr><tr><td>15 ס"מ צלחת תרבית</td><td>קורנינג (פלקון)</td><td>353025</td><td>צלחת תרבית תאים סטרילית, מטופלת</td></tr><tr><td>TC DMEM</td><td>קורנינג (Cellgro)</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין סטרפטומיצין</td><td>קורנינג</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>MEM אמינו לא חיוני חומצות</td><td>קורנינג (Cellgro)</td><td>25-025-CI</td><td></td></tr><tr><td>MEM ויטמינים</td><td>קורנינג (Cellgro)</td><td>25-020-CI</td><td></td></tr><tr><td>0.25% טריפסין, 2.21 מ"מ EDTA</td><td>קורנינג</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>אטלנטה ביולוגית</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Pipets</td><td></td><td></td><td>כל ייצור הוא</td></tr><tr><td>בסדר חממת</td><td></td><td></td> CO2 <td>כל ייצור הוא בסדר</td></tr><tr>ארון <td></td><td></td><td>רמת בטיחות ביולוגית II</td><td>כל ייצור הוא בסדר</td></tr><tr><td>FN1 TaqMan Gene Expression Assay</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Hs01549976_m1</td><td></td></tr><tr><td>TGFB1 TaqMan Gene Expression Assay</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Hs00998133_m1</td><td></td></tr><tr><td>CDH1 TaqMan Gene Expression Assay</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Hs01023895_m1</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH TaqMan Gene Expression מבחן</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Hs99999905_m1</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy מיני RNA ערכת בידוד</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>ערכת שעתוק הפוך cDNA בקיבולת גבוהה</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>43-688-13</td><td></td></tr><tr><td>HeyA8 תאי סרטן שחלות</td><td>שהושגו ממעבדת ארנסט לנגיל, אוניברסיטת שיקגו</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TGF&beta; נוגדנים מנטרלים</td><td>R& די סיסטמס</td><td>MAB1835-100</td><td></td></tr></tbody></table>

שיטה תרבות proximal ללמוד paracrine איתות בין תאים

A Proximal Culture Method to Study Paracrine Signaling Between Cells

אינטראקציות המערכת תפקיד חשוב בתהליכים ביולוגיים רבים, כולל התקדמות הגידול, תגובות חיסוניות, אנגיוגנזה ופיתוח. Paracrine או juxtacrine איתות שמתווכת אינטראקציות כאלה. השימוש במדיום ממוזגים ולימודי coculture הן השיטות הנפוצות להפלות בין שני סוגים אלה של אינטראקציות. אולם, השפעת ריכוזים גבוהים המותאמות לשפות אחרות של גורמים המופרש microenvironment במהלך אינטראקציות paracrine לא recapitulated במדויק על-ידי מדיום ממוזגים, לפיכך, עשוי להוביל למסקנות מדויק. כדי להתגבר על בעיה זו, אנו המציאו שיטה תרבות proximal ללמוד paracrine איתות. סוגי תאים בשני גדלים גם פני קרום בעובי מיקרומטר פוליקרבונט 10 עם נקבוביות מיקרומטר 0.4. הנקבוביות לאפשר החליפין של גורמים המופרש ומעכבות, באותו זמן, juxtacrine איתות. התאים ניתן לאסוף ולהשתמש lysed-נקודת הקצה כדי לקבוע את ההשפעות של האיתות paracrine. בנוסף מאפשר למעברי ריכוז המותאמות לשפות אחרות של גורמים המופרש, שיטה זו היא לבצע ניסויים הקשורים תקופות ממושכות של תרבות, כמו גם השימוש של מעכבי. בעוד אנחנו להשתמש בשיטה זו כדי ללמוד את האינטראקציות בין תאים סרטניים בשחלות התאים mesothelial שהם נתקלים באתר של גרורות, אותה ניתן להתאים לכל סוגי תאים חסיד שני לחוקרים ללמוד paracrine איתות בתחומים שונים, כולל גידול microenvironment, אימונולוגיה ופיתוח.

Metastasizing תאים סרטניים בשחלות נתקלים התאים mesothelial באתר של גרורות בתוך חלל הצפק19. אינטראקציות paracrine ו- juxtacrine פרודוקטיבי בעזרת התאים mesothelial ב גרימת תגובות מסתגלת בתאי סרטן השחלות, אשר מאפשרים גרורות מוצלחת17,18,20,21 . כדי לבדוק את האפקטיביות של שיטת תרבות צינתור, בדקנו את האינטראקציות paracrine בין תאים סרטניים בשחל...

אינטראקציות סלולרי Paracrine ו- juxtacrine תפקיד חשוב בתהליכים ביולוגיים רבים, כולל התקדמות הגידול, תגובות חיסוניות, אנגיוגנזה ופיתוח. כאן, שיטה תרבות proximal משמש כדי ללמוד paracrine איתות שבו ריכוז המותאמות לשפות אחרות של הגורמים המופרש נשמרים תוך מניעת מגע ישיר הסלולר.

שיטה תרבות Proximal ללמוד Paracrine איתות בין תאים

Intercellular interactions play an important role in many biological processes, including tumor progression, immune responses, angiogenesis, and ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום התקשורת הבין-תאית לגבי אינטראקציות הדדיות של פרקרין לעומת ג'וקסטקרין בין שני סוגי תאים. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שמדובר בטכניקה פשוטה מאוד וניתנת לשחזור הלוכדת במדויק איתות פרקריני בתנאי תרבית אופייניים ובמקביל מונעת איתות צמוד יעיל. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על הבנה טובה יותר של מנגנון הדיבור בין תאי הסרטן למיקרו-סביבת הגידול.למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי האינטראקציות בין תאי הסרטן לסטרומה של הגידול, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות כגון ריפוי פצעים ואנגיוגנזה. התחל בניתוק תאי סרטן השחלות מתערובת משולבת של 80% עם מיליליטר אחד של 0.25% טריפסין למשך 40 עד 60 שניות, ולאחר מכן נטרול התגובה עם שישה מיליליטר של מצע גידול מלא. אסוף את התאים על ידי צנטריפוגה והשהה מחדש את הגלולה בחמישה מיליליטר של מדיום גידול שלם טרי.לאחר הספירה, יש לדלל את התאים ל-100,000 תאי סרטן שחלות למיליליטר של ריכוז מדיום גידול מלא ולהניח שלוש תוספות תרבית תאי ממברנה פוליקרבונט הפוכות של 0.4 מיקרומטר שטופלו בתרבית נקבוביות לכל מצב ניסוי בצלחת תרבית רקמה סטרילית בגודל מתאים. סמנו את התוספות בהתאם לתנאי הניסוי והעבירו בזהירות את התאים הסרטניים לתחתית כל תוספת במעגלים קונצנטריים, החל מאמצע הממברנה ונעו החוצה ליצירת כיפה של 800 מיקרוליטר. היזהר מאוד בעת זריעת התאים על המשטח התחתון של התוסף כך שכיפתו של התאים המכילים את המדיום לא תברח משולי התוסף במהלך הדגירה.לאחר שכל התוספות נזרעו, מכסים את הכלי ומניחים בזהירות את התוספות לתוך חממת תרבית התאים. לאחר כארבע שעות, נתק את ה- HPMC עם שני מיליליטר של 0.25% טריפסין למשך דקה עד שתיים, ולאחר מכן נטרול התגובה עם 12 מיליליטר של מצע גידול שלם. אסוף את ה-HPMC על ידי צנטריפוגה והשהה מחדש את הגלולה ב-10 מיליליטר של מצע גידול שלם לספירה.לדלל את התאים ל-300,000 HPMC למיליליטר של מצע גידול מלא ולהוסיף 2.5 מיליליטר של מצע גידול שלם טרי לכל באר של צלחת תרבית בת שש בארות. בעזרת מלקחיים סטריליים, הנח כל תוספת בצד ימין כלפי מעלה לכל באר של צלחת שש הבארות כך שהמשטחים המחוברים לתאי סרטן השחלות התחתונים יהיו שקועים במדיה. ואז זרע 1.5 מיליליטר של HPMC לבאר של כל תוספת.לאחר מכן הניחו את הצלחת בחממת תרבית התאים למשך 72 שעות. בתום הדגירה יש להסיר בזהירות את התוספות מכל באר ולשטוף את שני צידי התוספות בעזרת PBS. מניחים כל תוספת לצלחת חדשה של שש בארות ומוסיפים 0.5 מיליליטר טריפסין לבארות ההכנסה ושני מיליליטר טריפסין לבארות התחתונות.לאחר שתי דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס, הוסף מיליליטר אחד של מצע גידול שלם לכל תוספת ופיפט בזהירות את התמיסה כמה פעמים מבלי לקרוע את הממברנה או לשפוך את תרחיף התאים לבאר שמתחת. בזמן הפיפטינג יש להקפיד על מניעת זיהום צולב של התאים מחדר אחד עם האחרים. העבירו את התאים המרחפים לצינור איסוף מסומן ונטרלו עוד יותר את הטריפסין עם שני מיליליטר נוספים של מצע גידול שלם.כדי לאסוף את התאים בתחתית התוספות, יש לשטוף את תחתית הממברנות פעמיים-שלוש עם שני מיליליטר טריפסין מהבאר המתאימה של צלחת שש הבארות כך שהתאים המנותקים ייתפסו בתחתית הבאר המתאימה. כאשר כל התאים נותקו, נטרלו את הטריפסין בכל באר עם שישה מיליליטר של מצע גידול טרי והעבירו את תרחיפי התאים לצינורות איסוף מסומנים. לאחר מכן אסוף את כל התאים על ידי צנטריפוגה והשהה מחדש את הכדורים ב-0.7 מיליליטר של פנול ומגיב ליזה מבוסס גואנידין תיוציאנט לכל צינור למיצוי ובידוד RNA על פי פרוטוקולים סטנדרטיים.תרבית פרוקסימלית של HPMC עם תאי סרטן השחלות מביאה לביטוי מוגבר של פיברונקטין וגורם גדילה טרנספורמטיבי או TGF beta one בהשוואה ל-HPMC ביקורת שנזרע על תוספות בהיעדר תאים סרטניים. הביטוי של פיברונקטין ו-TGF beta one גם עולה באופן משמעותי בתאי סרטן השחלות בתרבית פרוקסימלית עם HPMCs בהשוואה לתאי שחלה ביקורת שגודלו בהיעדר HPMC. לעומת זאת, תאי סרטן השחלות שטופלו במדיום מותנה HPMC מפגינים ביטוי פיברונקטין מופחת משמעותית ללא שינוי בביטוי TGF beta one.עם זאת, חסימה של TGF beta one עם נוגדן מנטרל מביאה לירידה משמעותית בביטוי TGF beta one בתאי סרטן השחלות בתרבית פרוקסימלית עם HPMCs. מעניין לציין כי עלייה קלה בביטוי TGF beta one נצפתה בתאי סרטן שחלות בקרה שאינם מתורבתים קרוב ככל הנראה כתגובה מפצה. תרבית פרוקסימלית עם תאי סרטן השחלות מגדילה מעט את ביטוי ה-E-cadherin ב-HPMCs בעוד ירידה ניכרת ב-E-cadherin נצפתה בתאי סרטן השחלות הגדלים בסמיכות ל-HPMCs בהשוואה לבקרות, מה שמדגים עוד יותר את היעילות של מערכת התרבית הפרוקסימלית לחקר איתות פרקריני בין תאי סרטן השחלות לתאים נורמליים באתר הגרורות.בזמן הניסיון בהליך זה, חשוב למטב את מספר התאים שנזרעו ואת משך התרבית הפרוקסימלית. לאחר הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו אימונובלוטינג כדי לענות על שאלות נוספות לגבי השינויים בביטוי החלבון והפעלת מסלולי איתות עיבוד במורד הזרם במהלך התרבות המשותפת של תאי המזותל של תאי הגידול. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום המיקרו-סביבה של הגידול, אימונולוגיה, ביולוגיה התפתחותית לחקור אינטראקציות פרקריניות הדדיות בין תאים באמצעות גורמים מופרשים.

a-proximal-culture-method-to-study-paracrine-signaling-between-cells

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בסרטון זה אנו מפתחים מודל תרבית משותפת פרוקסימלי של תאי סרטן השחלות ותאי מזותל אנושיים ראשוניים. מודל פיזיולוגי רלוונטי זה מאפשר לחקור איתות פרקריני, שבו נשמרים הריכוזים המקומיים של הגורמים המופרשים תוך מניעת מגע תאי ישיר.

מערכת תרבית פרוקסימלית: טכניקת תרבית חוץ גופית לחקר איתות פרקריני בין תאים

התאמנו תוספת ממברנה מיקרו-נקבובית חדירה כדי לחקות את המיקרו-סביבה של הגידול (TME). המודל מורכב מתרבית תאים מעורבת, מאפשר יצירה פשוטה של אוכלוסיות תאים בודדות מועשרות מאוד ללא שימוש בתיוג פלואורסצנטי או מיון תאים, ומאפשר לחקור תקשורת בין-תאית בתוך ה-TME בתנאים רגילים או בתנאי עקה.

חקיין של microenvironment הגידול: שיטה פשוטה ליצירת אוכלוסיות תאים מועשרות חוקרים אינטר תקשורת

מודל התרבות התא של התנגדות העורקים מתואר, המאפשר ניתוח איתות המסלולים אנדותל, שריר חלק, או בין אנדותל שריר חלק (צומת myoendothelial). יישום סלקטיבי של אגוניסטים או בידוד חלבון, מיקרוסקופ אלקטרונים או immunofluorescence יכול להיות מנוצל בעזרת המודל התרבות תאים.

מודל התרבות התא של התנגדות העורקים

אנו מציגים פרוטוקול לחקור crosstalk בין X-ray-מוקרן קאקו-2 תאי תאי דם היקפיים (PBMC). הפרוטוקול מתחיל עם קאקו-2 הקרנה ולהגדרה של תרבות משותפת עם PBMC; לאחר מכן, ההתנגדות החשמלית הטרנס-אפיתל נמדד באופן קבוע מעל 48 חשופה h ומערביות הופיעה קאקו-2 ו- PBMC.

שיטה תרבות משותפת לחקור Crosstalk בין רנטגן מוקרן קאקו-2 תאים, PBMC

אנו מספקים פרוטוקולים להערכה של גזע mesenchymal מבודד מן עיסת שיניים ואינטראקציות התא סרטן הערמונית המבוסס על שיטות תרבות שיתוף ישיר ועקיף. מצב בינוני וממברנות הטרנס-ובכן מתאימים לניתוח פעילות paracrine עקיף. זריעה באופן שונה מוכתמת. בתאים ביחד הוא מודל המתאים לאינטראקציה תא ישירה-cell.

בידוד תאי גזע mesenchymal זולה רקמות, תרבות משותפת עם תאים סרטניים ללמוד אינטראקציות שלהם

כאן, אנו מציגים שיטה באמצעות ממברנה חדיר תומך כדי להקל על המחקר של אי-מגע הפרדרין איתות בשימוש על ידי תאים סרטניים כדי לדכא את התגובה החיסונית. המערכת היא קלה ללמוד את התפקיד של גורמים מופרש הגידול בהפעלת לחות מקרופאג.

לומד את ההשפעות של הקרנף המופרש ליגרין המקרופאג הפעלה באמצעות תרבות שיתוף עם ממברנה חדיר תומך

אנו מתארים את הבידוד, פיזור וציפוי של התאים הראשוניים של שיניים (DP) בתאי הראשי עם מסננים (TG) נוירונים תרבותי על גבי מסנני transwell יטב. התגובות הסלולר של תאים DP ניתן לנתח עם immunofluorescence או בניתוח RNA/חלבון. אימונואופלונציה של סמנים עצביים עם מיקרוסקופ קונפוקלית מאפשר ניתוח של תגובות neurite מוצלח.

שיטת שיתוף התרבות כדי ללמוד Neurite Outgrowth בתגובה שיניים זולה הקרנף סימנים

המחקר הנוכחי מתווה שיטה הניתנת לשחזור ומתיחה גבוהה לחקר אירועי איתות Wnt פרקריניים לא-קנוניים במבחנה.  פרוטוקול זה יושם כדי להעריך את ההשפעה של איתות Wnt5a של פרקרין בתאי הצמרת העצבית של מורין ובמיובלסטים.

מידול אותות Wnt פאראקרינים לא-קנוניים במבחנה

במאמר זה, עלון מודפס תלת-ממדי שעוצב לאחרונה מוצג כמודל של תרבית משותפת ומאומת באמצעות המחקר של התקשורת הבין-תאית הפרקרינית בין תאי אנדותל וקרטינוציטים.

עלון חדשני המודפס בתלת-ממד ונועד לאפשר תרביות תאים דו-ממדיות ותלת-ממדיות פשוטות

בדיקת רגישות חזותית לטאות באמצעות פרדיגמה התניה אופרנטית המעסיקה וידאו השמעה אקראית של נקודה kinematograms ו ממוחשבת חסרי חוליות.

בדיקת רגישות חזותית על מהירות ועל כיוון התנועה של לטאות

חקור אינטראקציות פרקריניות בין תאי סרטן שחלות לתאי מזנכימה בפריטונאום באמצעות שיטת תרבות פרוקסימלית פשוטה ושחזורית. שיטה זו מבודדת איתות פרקריני תוך מניעת מגע ישיר בין תאים.

שיטה תרבות Proximal ללמוד Paracrine איתות בין תאים

גלה סרטונים נוספים