שיטה תרבות Proximal ללמוד Paracrine איתות בין תאים

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום התקשורת הבין-תאית לגבי אינטראקציות הדדיות של פרקרין לעומת ג'וקסטקרין בין שני סוגי תאים. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שמדובר בטכניקה פשוטה מאוד וניתנת לשחזור הלוכדת במדויק איתות פרקריני בתנאי תרבית אופייניים ובמקביל מונעת איתות צמוד יעיל. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על הבנה טובה יותר של מנגנון הדיבור בין תאי הסרטן למיקרו-סביבת הגידול.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי האינטראקציות בין תאי הסרטן לסטרומה של הגידול, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות כגון ריפוי פצעים ואנגיוגנזה. התחל בניתוק תאי סרטן השחלות מתערובת משולבת של 80% עם מיליליטר אחד של 0.25% טריפסין למשך 40 עד 60 שניות, ולאחר מכן נטרול התגובה עם שישה מיליליטר של מצע גידול מלא. אסוף את התאים על ידי צנטריפוגה והשהה מחדש את הגלולה בחמישה מיליליטר של מדיום גידול שלם טרי.

לאחר הספירה, יש לדלל את התאים ל-100,000 תאי סרטן שחלות למיליליטר של ריכוז מדיום גידול מלא ולהניח שלוש תוספות תרבית תאי ממברנה פוליקרבונט הפוכות של 0.4 מיקרומטר שטופלו בתרבית נקבוביות לכל מצב ניסוי בצלחת תרבית רקמה סטרילית בגודל מתאים. סמנו את התוספות בהתאם לתנאי הניסוי והעבירו בזהירות את התאים הסרטניים לתחתית כל תוספת במעגלים קונצנטריים, החל מאמצע הממברנה ונעו החוצה ליצירת כיפה של 800 מיקרוליטר. היזהר מאוד בעת זריעת התאים על המשטח התחתון של התוסף כך שכיפתו של התאים המכילים את המדיום לא תברח משולי התוסף במהלך הדגירה.

לאחר שכל התוספות נזרעו, מכסים את הכלי ומניחים בזהירות את התוספות לתוך חממת תרבית התאים. לאחר כארבע שעות, נתק את ה- HPMC עם שני מיליליטר של 0.25% טריפסין למשך דקה עד שתיים, ולאחר מכן נטרול התגובה עם 12 מיליליטר של מצע גידול שלם. אסוף את ה-HPMC על ידי צנטריפוגה והשהה מחדש את הגלולה ב-10 מיליליטר של מצע גידול שלם לספירה.

לדלל את התאים ל-300,000 HPMC למיליליטר של מצע גידול מלא ולהוסיף 2.5 מיליליטר של מצע גידול שלם טרי לכל באר של צלחת תרבית בת שש בארות. בעזרת מלקחיים סטריליים, הנח כל תוספת בצד ימין כלפי מעלה לכל באר של צלחת שש הבארות כך שהמשטחים המחוברים לתאי סרטן השחלות התחתונים יהיו שקועים במדיה. ואז זרע 1.5 מיליליטר של HPMC לבאר של כל תוספת.

לאחר מכן הניחו את הצלחת בחממת תרבית התאים למשך 72 שעות. בתום הדגירה יש להסיר בזהירות את התוספות מכל באר ולשטוף את שני צידי התוספות בעזרת PBS. מניחים כל תוספת לצלחת חדשה של שש בארות ומוסיפים 0.5 מיליליטר טריפסין לבארות ההכנסה ושני מיליליטר טריפסין לבארות התחתונות.

לאחר שתי דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס, הוסף מיליליטר אחד של מצע גידול שלם לכל תוספת ופיפט בזהירות את התמיסה כמה פעמים מבלי לקרוע את הממברנה או לשפוך את תרחיף התאים לבאר שמתחת. בזמן הפיפטינג יש להקפיד על מניעת זיהום צולב של התאים מחדר אחד עם האחרים. העבירו את התאים המרחפים לצינור איסוף מסומן ונטרלו עוד יותר את הטריפסין עם שני מיליליטר נוספים של מצע גידול שלם.

כדי לאסוף את התאים בתחתית התוספות, יש לשטוף את תחתית הממברנות פעמיים-שלוש עם שני מיליליטר טריפסין מהבאר המתאימה של צלחת שש הבארות כך שהתאים המנותקים ייתפסו בתחתית הבאר המתאימה. כאשר כל התאים נותקו, נטרלו את הטריפסין בכל באר עם שישה מיליליטר של מצע גידול טרי והעבירו את תרחיפי התאים לצינורות איסוף מסומנים. לאחר מכן אסוף את כל התאים על ידי צנטריפוגה והשהה מחדש את הכדורים ב-0.7 מיליליטר של פנול ומגיב ליזה מבוסס גואנידין תיוציאנט לכל צינור למיצוי ובידוד RNA על פי פרוטוקולים סטנדרטיים.

תרבית פרוקסימלית של HPMC עם תאי סרטן השחלות מביאה לביטוי מוגבר של פיברונקטין וגורם גדילה טרנספורמטיבי או TGF beta one בהשוואה ל-HPMC ביקורת שנזרע על תוספות בהיעדר תאים סרטניים. הביטוי של פיברונקטין ו-TGF beta one גם עולה באופן משמעותי בתאי סרטן השחלות בתרבית פרוקסימלית עם HPMCs בהשוואה לתאי שחלה ביקורת שגודלו בהיעדר HPMC. לעומת זאת, תאי סרטן השחלות שטופלו במדיום מותנה HPMC מפגינים ביטוי פיברונקטין מופחת משמעותית ללא שינוי בביטוי TGF beta one.

עם זאת, חסימה של TGF beta one עם נוגדן מנטרל מביאה לירידה משמעותית בביטוי TGF beta one בתאי סרטן השחלות בתרבית פרוקסימלית עם HPMCs. מעניין לציין כי עלייה קלה בביטוי TGF beta one נצפתה בתאי סרטן שחלות בקרה שאינם מתורבתים קרוב ככל הנראה כתגובה מפצה. תרבית פרוקסימלית עם תאי סרטן השחלות מגדילה מעט את ביטוי ה-E-cadherin ב-HPMCs בעוד ירידה ניכרת ב-E-cadherin נצפתה בתאי סרטן השחלות הגדלים בסמיכות ל-HPMCs בהשוואה לבקרות, מה שמדגים עוד יותר את היעילות של מערכת התרבית הפרוקסימלית לחקר איתות פרקריני בין תאי סרטן השחלות לתאים נורמליים באתר הגרורות.

בזמן הניסיון בהליך זה, חשוב למטב את מספר התאים שנזרעו ואת משך התרבית הפרוקסימלית. לאחר הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו אימונובלוטינג כדי לענות על שאלות נוספות לגבי השינויים בביטוי החלבון והפעלת מסלולי איתות עיבוד במורד הזרם במהלך התרבות המשותפת של תאי המזותל של תאי הגידול. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום המיקרו-סביבה של הגידול, אימונולוגיה, ביולוגיה התפתחותית לחקור אינטראקציות פרקריניות הדדיות בין תאים באמצעות גורמים מופרשים.