מבחני הדמיה לחיות תאים מחקר המוח גליובלסטומה גידול תאי גזע ההעברה, הפלישה

כאן, אנו מתארים טכניקות הדמיה לחיות תאים למדוד באופן כמותי את ההעברה ואת הפלישה בתאי גזע המוח גידול גליובלסטומה לאורך זמן, תחת תנאים מרובים של הטיפול.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום גליובלסטומה, גידול מוח, תאי גזע או ביולוגיה של BTSC על ידי הקלה על זיהוי גישות חדשות לעיכוב הגירה ופלישה. היתרון העיקרי של טכניקות אלו הוא שהן מאפשרות לכמת את הנדידה והפלישה של BTSC לאורך זמן בתנאים מרובים. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול בגליובלסטומה שכן הנדידה והפלישה של תאים סרטניים לרקמת מוח רגילה תורמת להישנות המחלה.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי האופן שבו BTSCs נודדים ופולשים, ניתן ליישם אותה גם על תאי גזע סרטניים שמקורם בסוגי גידולים אחרים. התחילו בהפשרת בקבוקון של BTSCs שהשתמרו בהקפאה בכוס של 70% אתנול המונחת בתוך אמבט מים של 37 מעלות צלזיוס רק עד שאחרון הקרח יפשיר. לדלל את התאים המופשרים ו-10 מיליליטר מדיה בצינור חרוטי של 15 מיליליטר לצנטריפוגה שלהם ולהשעות מחדש את גלולת ה-BTSC בשמונה מיליליטר של מדיה שלמה.

העבירו את התאים לבקבוק תרבית T25 למשך 10 עד 14 ימים של תרבית בתנאים שאינם דבקים, עקבו אחר הבקבוק מדי יום, והשלימו את התאים עם מיליליטר אחד עד שניים של מדיה שלמה טרייה לפי הצורך. כאשר הנוירוספרות מגיעות לקוטר של כ-250 מיקרומטר, השתמשו בפיפטה כדי לשטוף את המדיה על פני תחתית הבקבוק כדי לנתק את כל התאים הדבקים ולהעביר את הסופרנטנט לצינור חרוטי של 15 מיליליטר לצנטריפוגה. כדי לנתק את הנוירוספרות של BTSC לתאים בודדים, השעו מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של תמיסת ניתוק תאים שחוממה מראש ודגרו למשך שבע דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן 40 טריטורציות עם מיקרופיפטה P1000 המוגדרת ל-800 מיקרוליטר.

כאשר התאים מנותקים לחלוטין, הוסף חמישה מיליליטר PBS בתוספת אנטיביוטיקה לצינור לצנטריפוגה נוספת והשהה מחדש את הגלולה באחד עד ארבעה מיליליטר של מדיה שלמה בהתאם לגודל הגלולה. לאחר מכן זרעו פעמיים עד שלוש פעמים 10 עד חמישית תאים בשמונה מיליליטר של מדיה שלמה לכל בקבוק T25 והעבירו את הצלוחיות לחממת תרבית התאים למשך שבוע עד שבועיים של תרבית. כדי להעריך את ההשפעות של טיפול תרופתי מעניין על הנדידה, יש לטפל תחילה בתאים בריכוז המתאים של התרופה לתקופת ניסוי מתאימה.

להכנת צלחת הכימוטקסיס, יש לצפות שלוש בארות הכנסת ממברנה ושלוש בארות מאגר תחתונות לפי מצב של צלחת כימוטקסיס של 96 בארות עם 75 ו-225 מיקרוליטר של 0.2 מיליגרם למיליליטר קולגן מסוג I בהתאמה למשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס. בתום הדגירה יש לשאוב את תמיסת הקולגן מכל באר מבלי לשרוט את ציפוי הקולגן ולשטוף את הבארות פעמיים עם PBS סטרילי. לאחר הכביסה האחרונה, הסר את התוספת מהצלחת והוסף 225 מיקרוליטר של מדיה נטולת גורמי גדילה בתוספת 10% FBS לכל באר מאגר תחתונה של צלחת הכימוטקסיס.

לאחר מכן החזר בעדינות את התוספת העליונה למאגר התחתון בזווית כדי למנוע יצירת בועות והוסף 2.5 פעמים 10 ל-BTSCs המנותקים השלישי ב-50 מיקרוליטר של מדיה נטולת גורם גדילה לכל באר. חשוב להפריד לחלוטין את ה-BTSCs לתאים בודדים ולספור אותם בזהירות לפני הציפוי כדי למנוע גושי תאים או יותר מדי תאים בתוספת העליונה. כדי לצלם נדידת BTSC לאורך שיפוע FBS, הנח את הצלחת במערכת הדמיה של תאים חיים והגדר את תוכנת ההדמיה האוטומטית לרכוש תמונות מיקרוסקופיות של הלוח כל שעה עד שעתיים למשך עד 72 שעות.

לאחר השלמת רכישת התמונה, בחר הגדרת עיבוד חדשה כדי להבדיל את ה-BTSCs מנקבוביות ההכנסה שלהם בצד התחתון של הממברנה, ושנה את הניתוח אם הוא לא מבחין במדויק בין התאים לקרום הרקע לפי הצורך. כדי לכמת את התאים שנדדו דרך הנקבוביות, אסוף את הנתונים כשטח הפנים של התא בצד התחתון של הממברנה עבור כל אחת משלוש בארות השכפול לכל מצב, ולאחר מכן גרף את נדידת התאים כשטח התאים שנודד במיקרומטרים בריבוע לאורך זמן. כדי להעריך את פלישת הנוירוספירה של BTSC, הוסף תחילה את תרכובת העניין לבקבוק בריכוז הרצוי עבור מהלך הזמן שנקבע מראש לפני ציפוי פלישת הנוירוספרה.

כאשר גודל הנוירוספירה הממוצע מגיע לכ-150 עד 200 מיקרומטר, הטה וערבב בעדינות את הבקבוק עם פיפטה והעביר 500 מיקרוליטר של הנוירוספירות BTSC התלויות לצינור אחד של 1.5 מיליליטר לכל מצב ניסוי על קרח. שאפו כמה שיותר מהמדיה מתחתית כל צינור של 1.5 מיליליטר מבלי לאבד את גלולת הנוירוספירה והשעו בעדינות את הנוירוספרות ב-500 מיקרוליטר של תמיסת קולגן טרייה של 0.4 מיליגרם למיליליטר מסוג I. העבירו 100 מיקרוליטר של הנוירוספרות התלויות בקולגן לשלוש בארות בכל מצב לצלחת חדשה של 96 בארות על קרח ואפשרו לנוירוספרות להתיישב למשך חמש דקות.

זה קריטי לאפשר לנוירוספרות להתיישב במשך חמש דקות על הקרח. אחרת הכדורים לא יהיו באותו מישור מיקוד להדמיה. לאחר חמש דקות של פילמור קולגן באינקובטור תרבית התאים, העבירו את הצלחת למגש של מערכת הדמיית התאים החיים כדי לקבל תמונת ייחוס של גודל הנוירוספירה בזמן הציפוי לפני תחילת הפלישה.

לאחר מכן הגדר את התוכנה לקלוט תמונות כל שעה עד שעתיים עד שקצב הפלישה יתייצב, בדרך כלל ב-24 שעות. כדי לדמות את שטח הפנים ההולך וגדל של ה-BTSCs כשהם פולשים למטריצה לאורך זמן, השתמש במטרה פי 10 כדי לרכוש ארבע תמונות לכל באר עבור כל קבוצה של שלוש בארות משוכפלות. כדי לקבוע את שטח הפנים היחסי של התא המיוצג כאחוז המפגש של הבאר, הגדר הגדרת עיבוד המדגישה באופן ספציפי את התאים על רקע הבאר, ולאחר מכן אסוף את הנתונים כשטח הפנים הכולל של התא עבור כל באר בכל נקודת זמן, קבע את הממוצע של שלוש הבארות המשוכפלות, ולשרטט גרף של פלישת ה-BTSCs על ידי שרטוט שטח התא הגדל לאורך זמן.

ניתן לגדל BTSCs המצופים כתאים בודדים כנוירוספרות צפות חופשיות. לאחר מכן ניתן לטפל בנוירוספרות בתרופה מעניינת ולצפות לניתוח כימוטקסיס של ההשפעות של התערבויות טיפוליות על נדידת BTSC. אם ה-BTSCs אינם מנותקים לחלוטין, התאים אינם נודדים דרך הנקבוביות ונשארים כנוירוספרות קטנות.

אם יותר מ-2.5 פעמים 10 עד ה-BTSCs השלישי מצופים לבאר, התאים מתגבשים במקום לנדוד לצדדים התחתונים של הממברנות. יתר על כן, חיוני להימנע מיצירת בועות בבארות הכנסת הממברנה בזמן ציפוי תאים או בעת הנחת תוספת הממברנה למאגר התחתון, שכן בועות מונעות הדמיה וכימות מדויקים של תאים. ניתן לדמות ולמדוד פלישת BTSC מנוירוספרות למטריצה שמסביב לאורך זמן בפורמט צלחת של 96 בארות.

ניתן להעריך את ההשפעה של התערבויות טיפוליות על פלישת BTSC על ידי כימות שטח הפנים של התאים כשהם פולשים למטריצה לאורך זמן. הטמעת נוירוספרות BTSC בקוטר של יותר מ-200 מיקרומטר מובילה למישור מיקוד גדול מכדי לכמת במדויק את כל הכדורים בשדה הראייה. באופן דומה, כישלון לשמור על המטריצה בארבע מעלות צלזיוס תוך הטמעת הנוירוספרות בקולגן לבדיקת הפלישה יכול גם להוביל לכדורים שאינם נמצאים באותו מישור מיקוד עם מטריצה חוץ-תאית שאינה מתמצקת באופן שווה, ומונעת רכישת נתונים מדויקת.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לייעל את תנאי הטיפול התרופתי וזמני רכישת התמונה עבור כל תרבית BTSC הנחקרת. ניתן לשנות הליך זה גם כדי לענות על שאלות נוספות לגבי האופן שבו תאי גזע סרטניים מסוגי גידול אחרים נודדים ופולשים במבחנה. טכניקה זו יכולה לעזור לסלול את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של הסרטן לחקור נדידה ופלישה במבחנה ב-BTSCs של גליובלסטומה.