גישה במבחנה טיפול פוטודינמי

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי טיפול פוטודינמי, הידוע גם בשם PDT. השאלות שניתן לענות עליהן בשיטה זו כוללות את משך הדגירה של חומר רגיש לאור, או שימוש בפרמטרים שונים בניסוי כמו שינוי הטמפרטורה על ידי חימום או קירור התאים. טכניקה זו יכולה לסייע בפיתוח במבחנה של רגישים לאור, פרוטוקולים ואינדיקציות חדשים ל-PDT.

התחל בציפוי פעמיים 10 עד התאים הרביעיים בשני מיליליטר של מדיום תרבית לכל באר של צלחת שש בארות בטכניקה סטרילית לדגירה של 24 שעות ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. למחרת יש לשטוף את התאים עם לפחות שני מיליליטר PBS ולטפל בתרבויות עם אפס, אפס נקודה חמש, אחד או שני דילולים של 5-ALA טרי שהוכן. לאחר מכן הניחו את הצלחת על גוש חימום של 36-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות מוגן מפני אור.

במהלך ההליך, אנו ממליצים במהלך שלב הדגירה שהחוקרים ישתמשו בבלוק חימום כדי להשיג טמפרטורה עקבית לאורך כל תקופת הדגירה. בנוסף, אנו ממליצים לכסות את התאים בתקופת הדגירה בנייר אלומיניום כדי למנוע הפעלת ארל של הרגישות לאור. בתום הדגירה יש לשטוף את התאים בכל באר עם שני מיליליטר PBS.

ולרענן את התרבויות עם שני מיליליטר של מדיום תרבית טרי לקרינת אור כחול. לפני הקרנת התאים, יש לחמם את מכשיר האור הכחול באורך גל פלט של 417 ננומטר למשך מחזור אחד של 1,000 שניות ולהשתמש בפוטומטר כדי למדוד את הקרינה על פני התא, תוך התאמת מרחק האור להשגת הקרינה המתאימה בהתאם לעוצמת מקור האור. לאחר מכן הנח את התאים שטופלו ב-5-ALA על משטח שחור מתחת לאור הכחול למשך 1,000 שניות לשטף כולל של 10 ג'אול לסנטימטר מרובע.

במהלך הפעלת הצילום, אנו ממליצים להניח את התאים על משטח שחור כדי למנוע השתקפות אור ומינון לא עקבי. בתום הטיפול בפוטותרפיה יש לשטוף את התאים בכל באר בשני מיליליטר PBS ולנתק את התאים במיליליטר אחד של 0.25% טריפסין-EDTA לבאר. לאחר שלוש עד חמש דקות, אשר את הניתוק והשבת את הטריפסין עם 10% FBS ו-PBS.

העבירו את התאים מכל באר לצינורות זרימה בודדים של חמישה מיליליטר ואספו את התאים על ידי צנטריפוגה. הוסף 200 מיקרוליטר של מאגר זרימה עם נוגדן נספח-V מצומד לכל דגימה. השעו מחדש את התאים והניחו את הצינורות לתוך החממה למשך 20 דקות כדי לאפשר קשירת נספח-V.

בתום הדגירה יש להוסיף שלושה מיקרוליטרים של 7-AAD לכל דגימה ולדגור שוב בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות ולאחר מכן ניתוח דגימה שנעשה על פי פרוטוקולי ניתוח ציטומטרי זרימה סטנדרטיים. לאחר חמישה טיפולי ALA ופוטותרפיה באור כחול, נצפתה עלייה תלוית מינון באפופטוזיס של התאים. כדי לחשב את אחוז התאים שעוברים אפופטוזיס, מתווספים אחוז התאים ברבעים הגבוהים של נספח-V, 7-AAD נמוך ו-Annexin-V גבוה, 7-AAD גבוה.

חוסר עקביות באורך תקופת הדגירה של חמש ALA, טמפרטורת הדגירה או מינון הקרנת הפעלת האור עלולים לשנות את יעילות הפוטותרפיה, וכתוצאה מכך עלייה תלוית טמפרטורה באפופטוזיס, למשל. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע טכניקות אחרות כולל RTQPCR וכתם מערבי כדי לקבוע כיצד PDT משנה את ביטוי הגנים ואת פעילות החלבון. שיטה זו מאפשרת לחוקרים המעוניינים בטיפול פוטודינמי לגלות את ההשפעות על תאי סרטן העור ומחלות עור אחרות במבחנה.