שמר האפייה קינטיקה גידול אקספוננציאלי בתרבות אצווה כדי לנתח את חילוף החומרים הנשימה ואת Fermentative

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומים ביוטכנולוגיים וביו-רפואיים כגון מה הם הבסיס המולקולרי מאחורי השפעות ורבורג ו Crabtree. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת מחקר תפוקה גבוהה של ההשפעות של חומרים מסוימים בחילוף החומרים הנשימה והתסיסה. התחל על ידי חיסון צינור חרוט 15 מיליליטר המכיל שלושה מיליליטר של קריר, סטרילי 2%שמרים לחלץ דקסטרוז פפטונה, או מרק YPD, עם 250 microliters של תאי שמרים S.cerevisiae השתמרו גליצרול ב 20 מעלות צלזיוס שלילי.

הדגירה את השמרים לילה בשייקר מסלולית ב 30 מעלות צלזיוס ו 200 סל"ד. לפסים על צלחת פטרי 60 מיליליטר, 2%YPD מלא אגר למחרת בבוקר. תרבות המנה ב 30 מעלות צלזיוס עד מושבות מבודדות נצפו.

ואז לחסן מושבה מבודדת אחת בצינור חרוט חדש המכיל 10 מיליליטר של מרק קריר, סטרילי 2% YPD לתרבות הלילה ב 30 מעלות צלזיוס עם רעידות. להגדרת עקומת צמיחת מיקרופלאט, הוסיפו 145 מיקרוליטרים של מדיום תרבותי ניסיוני מתאים לכל באר של מיקרופלאט סטרילי של 10 על 10 היטב עם מכסה וחסן כל באר עם חמישה מיקרוליטרים של תרבות הלילה. ואז להדק את הצלחת רב היטב בקורא מיקרופלסטיק ב 30 מעלות צלזיוס עם תסיסה מתמדת ב 200 סל"ד במשך 48 שעות, מדידת הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר כל 30 או 60 דקות.

עבור הגדרת עקומת צמיחה של בקבוק חרוט מזועזע, לחסן 20 בקבוקונים חרוט מיליליטר המכיל 4.8 מיליליטר של מדיה תרבותית סטרילית מתאימה עם 200 microliters של תרבות טרום אינקולום ב 600 ננומטר צפיפות אופטית של שניים עבור דגירה ב 30 מעלות צלזיוס ו 250 סל"ד. תסיסה ב 250 מהפכות לדקה היא קריטית כדי להשיג צמיחה מתאימה ריכוזים נמוכים של מקורות פחמן המפעילים צמיחה נשימתית כפי שראינו צמיחה מופחתת שמרים במצבי נשימה במהירויות תסיסה נמוכות יותר. כדי לאפשר מדידה של הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר כל שעתיים במשך 24 שעות, לדלל 100 microliters של תרבות הבקבוק חרוט מזועזע ב 900 microliters של מים מזוקקים בקובט ספקטרופוטומטר אחד מיליליטר בעדינות לערבב על ידי פיפטה.

לעיבוד נתונים, בתוכנת חבילה סטטיסטית מתאימה, צרו קובץ פרוייקט חדש, פתחו את תפריט הטבלה והגרף החדש ובחרו XY. תחת תפריט הנתונים לדוגמה, בחר התחל בטבלת נתונים ריקה ובגרף נקודות וחיבור קו. השאר את מקטע X לא נבחר בקוטומי משנה עבור שכפולים או ערכי שגיאה. במקטע Y, בחר הזן 10 ערכי שכפול בכלובי משנה זה לצד זה וב- SD של ממוצע התוויית נתונים וטעייה. לאחר מכן לחץ על צור.

הזן את השעה שבה מדידות OD הושגו בעמודה X ואת ערכי OD שהתקבלו מהתרבויות בעמודה Y. כדי לזהות את שלב הצמיחה המעריכית הממר את נתוני העמודה Y ללוגאריתמים, לחץ על נתח ובחר את ניתוח ההמרה. השתמש ב- Y שווה יומן רישום Y כדי לבחור את ערכי Y ולפתוח את גלריית התוצאות.

בחר את טבלת נתוני ההמרה, לחץ על נתח ובחר את ניתוח הרגרסיה הליניארית, למעט ערכי הצפיפות האופטית שאינם תואמים למגמה ליניארית על-ידי בחירת הערכים בטבלה ופקד מדכא ו- E.In גלריית טבלאות הנתונים, בחר את הנתונים בטבלה אחת ולחץ על נתח. בחרו בניתוח התאמה של עקומת רגרסיה לא ליניארית ובערכות הנתונים לניתוח ולחצו על הלחצן 'אשר'. לאחר מכן החל פחות ריבועים על הנתונים, משאיר את מקטע האינטרפולציה לא נבחר, ולחץ על אישור. לאחר מכן, פתח קובץ פרוייקט חדש, ובתפריט הטבלה והגרף החדש, בחר את בחירת העמודה, התחל בטבלת נתונים ריקה ובגרף הרצוי. הגדר את התרשים להתווית הממוצע עם סטיית התקן ולחץ על צור.

העתק את ערכי הזמן הממוצע או הדלתא מטבלת תוצאות התאמה לא ליניארית בגלריה של תוצאות והדבק את הנתונים בעמודה. לבסוף, לחץ לנתח ולבחור את הניתוח של עניין בתפריט ניתוח עמודות כדי להשוות את הפרמטרים הקינטיים של התנאים nutrimental שונים. ערכי הסף הקינטיים של הצמיחה משתנים בין נקודות החוזק ויש להעריך אותם בהתאם לתנאים בהם אנו משתמשים בניתוח.

תרבויות המדגימים פנוטיפ תסיסה יש שלב השהיה קטן שלב מעריכי עם קצב צמיחה גבוה. תרבויות המשיגות אנרגיה בעיקר על ידי זרחון חמצוני מפגינות שלב השהיה ארוך יותר עם קצב צמיחה איטי במהלך השלב המעריכי. חישוב קצב הגדילה הספציפי והכפלת זמן עקומות הצמיחה באמצעות משוואת הצמיחה המעריכית מאפשרים קביעת סף לערכי הצמיחה הנשימתיים והתסיסתיים.

לדוגמה, בניסויים ייצוגיים אלה, ההשפעות של ריכוזי רזברטרול שונים על תאי S.cerevisiae BY4742 חושפות את השינוי במצב האנרגטי של התא בתגובה לריכוזי גלוקוז משתנים. כאן, תוספי עם 10%גלוקוז מדגים כי ריכוזים נמוכים יותר של אמוניום לטובת חילוף החומרים תסיסה כפי שמוכיח שלב צמיחה מעריכי מורחב בתרבויות אלה, בעוד ריכוז גבוה יותר גורם לחילוף חומרים מותסס הפוגה כפי שמוכיח שלב השהיה מורחבת וקצב צמיחה איטי יותר במהלך השלב המעריכי. לבסוף, ניתן לראות הבדלים חזקים בערכי זמן הכפלה מותססים בין שני זני שמרים שונים אלה הגדלים באותם תנאים, המדגישים את הצורך לאמת את סף זמן ההכפלה עבור כל זן שנותח.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי פרוטוקול זה משמש רק כדי לסנן את הפנוטיפ. ההשפעות הספציפיות על הנשימה והתסיסה חייבות להיות מאושרות על ידי מתנאים לצריכת חמצן או על ידי הצטברות של תוצרי לוואי של תסיסה בהתאמה.