Name: שיטות להערכת את התפקיד של c-פוס, Dusp1 התלות אונקוגן (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: חקור שיטות לאימות c-Fos ו-Dusp1 כמטרות תרופתיות בלוקמיה באמצעות מודלים גנטיים וכימיים. השיטה מתאימה לסוגי גידולים שונים ומספקת תובנות לתלות אונקוגנית בקרסינומה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים ל ג ש דיילי למתן התאים BaF3 ועל ה-וואי ובונה רייה ט עבור MSCV-BCR-ABL-Ires-YFP. המחברים מודים ל מ קרול למתן דגימות החולה מן המשבר הפיצוץ לוקמיה מיאלואידית כרונית. מחקר זה נתמך על ידי מענקים כדי M.A. מ- NCI (1RO1CA155091), לוקמיה Research Foundation, קרן V ומ NHLBI (R21HL114074-01).

<ol><li>Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+chronic+myelogenous+leukemia+in+mice+by+the+P210bcr%2Fabl+gene+of+the+Philadelphia+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome.</a> Science. 247, 824-830 (1990).</li>
<li>Druker, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+selective+inhibitor+of+the+Abl+tyrosine+kinase+on+the+growth+of+Bcr-Abl+positive+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells.</a> Nature Medicine. 2, 561-566 (1996).</li>
<li>Mahon, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discontinuation+of+imatinib+in+patients+with+chronic+myeloid+leukaemia+who+have+maintained+complete+molecular+remission+for+at+least+2+years%3A+the+prospective%2C+multicentre+Stop+Imatinib+%28STIM%29+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Oncology%22%5BJournal%5D)">Discontinuation of imatinib in patients with chronic myeloid leukaemia who have maintained complete molecular remission for at least 2 years: the prospective, multicentre Stop Imatinib (STIM) trial.</a> Lancet Oncology. 11, 1029-1035 (2010).</li>
<li>O'Hare, T., Zabriskie, M. S., Eiring, A. M., Deininger, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pushing+the+limits+of+targeted+therapy+in+chronic+myeloid+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Pushing the limits of targeted therapy in chronic myeloid leukaemia.</a> Nature Reviews Cancer. 12, 513-526 (2012).</li>
<li>Rousselot, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imatinib+mesylate+discontinuation+in+patients+with+chronic+myelogenous+leukemia+in+complete+molecular+remission+for+more+than+2+years%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Imatinib mesylate discontinuation in patients with chronic myelogenous leukemia in complete molecular remission for more than 2 years.</a> Blood. 109, 58-60 (2007).</li>
<li>Krause, D. S., Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+kinases+as+targets+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tyrosine kinases as targets for cancer therapy.</a> The New England Journal of Medicine. 353, 172-187 (2005).</li>
<li>Sharma, S. V., Settleman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+the+balance+between+life+and+death%3A+targeted+cancer+therapy+and+%22oncogenic+shock%22%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Exploiting the balance between life and death: targeted cancer therapy and "oncogenic shock".</a> Biochemical Pharmacology. 80, 666-673 (2010).</li>
<li>Sharma, S. V., Settleman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogene+addiction%3A+setting+the+stage+for+molecularly+targeted+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Oncogene addiction: setting the stage for molecularly targeted cancer therapy.</a> Genes & Development. 21, 3214-3231 (2007).</li>
<li>Weinstein, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer.+Addiction+to+oncogenes--the+Achilles+heal+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cancer. Addiction to oncogenes--the Achilles heal of cancer.</a> Science. 297, 63-64 (2002).</li>
<li>Corbin, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+chronic+myeloid+leukemia+stem+cells+are+insensitive+to+imatinib+despite+inhibition+of+BCR-ABL+activity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Human chronic myeloid leukemia stem cells are insensitive to imatinib despite inhibition of BCR-ABL activity.</a> The Journal of Clinical Investigation. 121, 396-409 (2011).</li>
<li>Straussman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+micro-environment+elicits+innate+resistance+to+RAF+inhibitors+through+HGF+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour micro-environment elicits innate resistance to RAF inhibitors through HGF secretion.</a> Nature. 487, 500-504 (2012).</li>
<li>Wilson, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+potential+for+growth-factor-driven+resistance+to+anticancer+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Widespread potential for growth-factor-driven resistance to anticancer kinase inhibitors.</a> Nature. 487, 505-509 (2012).</li>
<li>Kesarwani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+c-FOS+and+DUSP1+abrogates+intrinsic+resistance+to+tyrosine-kinase+inhibitor+therapy+in+BCR-ABL-induced+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Targeting c-FOS and DUSP1 abrogates intrinsic resistance to tyrosine-kinase inhibitor therapy in BCR-ABL-induced leukemia.</a> Nature Medicine. 23, 472-482 (2017).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((c-fos+regulates+neuronal+excitability+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">c-fos regulates neuronal excitability and survival.</a> Nature Genetics. 30, 416-420 (2002).</li>
<li>Dorfman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+erp%2Fmkp-1+gene+does+not+affect+mouse+development%3A+normal+MAP+kinase+activity+in+ERP%2FMKP-1-deficient+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Disruption of the erp/mkp-1 gene does not affect mouse development: normal MAP kinase activity in ERP/MKP-1-deficient fibroblasts.</a> Oncogene. 13, 925-931 (1996).</li>
<li>Padhye, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorocurcumins+as+cyclooxygenase-2+inhibitor%3A+molecular+docking%2C+pharmacokinetics+and+tissue+distribution+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Fluorocurcumins as cyclooxygenase-2 inhibitor: molecular docking, pharmacokinetics and tissue distribution in mice.</a> Pharmaceutical Research. 26, 2438-2445 (2009).</li>
<li>Molina, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+chemical+screening+reveals+an+inhibitor+of+Dusp6+that+expands+cardiac+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages.</a> Nature Chemical Biology. 5, 680-687 (2009).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+targeting+of+quiescent+chronic+myelogenous+leukemia+stem+cells+by+histone+deacetylase+inhibitors+in+combination+with+imatinib+mesylate%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Effective targeting of quiescent chronic myelogenous leukemia stem cells by histone deacetylase inhibitors in combination with imatinib mesylate.</a> Cancer Cell. 17, 427-442 (2010).</li>
<li>Koschmieder, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+chronic+phase+of+myeloid+leukemia+with+expansion+of+hematopoietic+stem+cells+in+a+transgenic+model+of+BCR-ABL+leukemogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Inducible chronic phase of myeloid leukemia with expansion of hematopoietic stem cells in a transgenic model of BCR-ABL leukemogenesis.</a> Blood. 105, 324-334 (2005).</li>
<li>Abraham, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+targeting+of+p53+and+c-MYC+selectively+eliminates+leukaemic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dual targeting of p53 and c-MYC selectively eliminates leukaemic stem cells.</a> Nature. 534, 341-346 (2016).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+p53+by+SIRT1+inhibition+enhances+elimination+of+CML+leukemia+stem+cells+in+combination+with+imatinib%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Activation of p53 by SIRT1 inhibition enhances elimination of CML leukemia stem cells in combination with imatinib.</a> Cancer Cell. 21, 266-281 (2012).</li>
<li>Qiagen-miRNAeasy kit. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/rna/mirna/mirneasy-mini-kit/#resources">https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/rna/mirna/mirneasy-mini-kit/#resources</a> (2018).</li>
<li>DNA-free DNA removal kit. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM1906?gclid=EAIaIQobChMIg4D-_ZvC2wIVx5-zCh00Cg8fEAAYASAAEgIv6vD_BwE&s_kwcid=AL!3652!3!264318446624!b!!g!!&ef_id=V7SO5AAAAck3ba89:20180607185004:s">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM1906?gclid=EAIaIQobChMIg4D-_ZvC2wIVx5-zCh00Cg8fEAAYASAAEgIv6vD_BwE&s_kwcid=AL!3652!3!264318446624!b!!g!!&ef_id=V7SO5AAAAck3ba89:20180607185004:s</a> (2018).</li>
<li>SuperScript™ III First-Strand Synthesis System. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18080051">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18080051</a> (2018).</li>
<li>Human Long Term Culture Initiating Cell Itc-ic Assay. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.stemcell.com/human-long-term-culture-initiating-cell-ltc-ic-assay.html">https://www.stemcell.com/human-long-term-culture-initiating-cell-ltc-ic-assay.html</a> (2018).</li>
<li>Abarrategi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+human+bone+marrow+niche+in+mice%3A+From+host+bone+marrow+engraftment+to+bioengineering+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Modeling the human bone marrow niche in mice: From host bone marrow engraftment to bioengineering approaches.</a> Journal of Experimental Medicine. 215, 729-743 (2018).</li>
<li>Kesarwani, M., Huber, E., Kincaid, Z., Azam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+screening+and+validation+of+resistant+mutations+against+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A method for screening and validation of resistant mutations against kinase inhibitors.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2014).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

עבור חלק הארי של תאים סרטניים, התגובה הטיפולית TKI מתווך על ידי מצור של אותות טירוזין-קינאז-oncoprotein אשר הגידול הוא מכור. עם זאת, יחסית מעט מאוד ידוע על איך מיעוט של תאים סרטניים לתרום MRD לברוח אונקוגן התלות וטיפול4. מחקרים שנעשו לאחרונה חשף כי גורם הגדילה איתות שמתווכת תרופתיים לוקמיה והן גידולים מוצק איברים. הדבר מצביע על מנגנונים מולקולריים שונים עשויה ביסוד מהותי להתנגדות10,11,12. כדי להבין את המנ...

פעילות קינאז טירוזין המכונן של BCR-ABL1 פיוז'ן אונקוגן גורמת CML, אשר מהווה הרציונל למקד את פעילות קינאז על ידי מעכבי מולקולה קטנה. ההצלחה של TKIs בטיפול בחולי CML מהפכה הקונספט של טיפול ממוקד1,2. לאחר מכן, טיפול אנטי-קינאז כתרופה דיוק פותחה עבור מספר ממאירויות אחרות, כולל גידולים מוצקים. עד כה, מעכבי קינאז יותר משלושים אושרו על ידי ה יונייטד המדינה-FDA לטיפול גידולים ממאירים שונים. בעוד TKI טיפול יעיל מאוד בדיכוי המחלה, זה לא מרפא. חוץ מזה, אוכלוסיה קטנה של תאים סרטניים נמשכת במהלך הטיפול:4,3,MRD5. אפילו חולים אשר הראו הפוגה מלאה נשארים עם MRD, אשר בסופו של דבר התוצאות ב- relapse אם לא באופן רציף מודחקים. לכן, מיגור של MRD תאים נדרש כדי להשיג היענות עמיד או ריפוי. לוקמיה מיאלואידית כרונית מייצג פרדיגמה ערך להגדרת המושג דיוק רפואה, מנגנונים של oncogenesis, הרפוי רציונלי מכוון מטרה, התקדמות המחלה תרופתיים. עם זאת, גם היום, מנגנון נהיגה מוות תאי TKI-induced בתאי סרטן אינה מובנת במלואה, ולא למה תאים MRD (המורכב של תאי גזע לוקמיה [LSCs]) עמידים ממהותם4,TKIs6. למרות זאת, התופעה של "תלות אונקוגן" כדי oncoprotein קינאז מוטציה הוא בהפרות יעילות TKI איפה עיכוב חריפה של יישוב אונקוגן מאת TKIs גורם מכת oncogenic שמוביל מסיבי proapoptotic תגובה או תרדמה בתא באופן תלוי-ההקשר6,7,8,9. עם זאת, בהתפשטות אונקוגן התלות מכניסטית לוקה בחסר. מחקרים שנעשו לאחרונה לסבך כי גורם הגדילה איתות abrogates אונקוגן התלות, כתוצאה מכך מקנה עמידות TKI טיפול10,11,12. לכן, כדי לזכות בתובנה המנגנון של אונקוגן התלות, ביצענו הגנום כולו ביטוי פרופיל של BCR-ABL1 מכורים ותאים nonaddicted (גדל עם גורמי גדילה), אשר גילה ש- c-פוס ו Dusp1 הם מתווכים קריטי של אונקוגן התמכרות13. המחיקה גנטי של c-פוס, Dusp1 תאים קטלניים BCR-ABL1-ולהבעת סינתטי, העכברים המשמשים את הניסוי לא לפתח לוקמיה. יתר על כן, עיכוב של c-פוס, DUSP1 על ידי מעכבי מולקולה קטנה נרפא BCR-ABL1-induced CML בעכברים. התוצאות מציגות רמות הביטוי של c-פוס, Dusp1 להגדיר את סף מוות של תאים סרטניים, כזה כי רמות נמוכות יותר להתייעץ סמים רגישות בעוד רמות גבוהות יותר לגרום התנגדות טיפול13.
כדי לזהות את הגנים נהיגה התלות אונקוגן, ביצענו כמה הביטוי הגנום כולו פרופיל ניסויים בנוכחות גורם הגדילה של TKI (imatinib) באמצעות העכבר - והן תאים נגזר חולה CML (K562). נתונים אלה נותחו במקביל עם ערכות נתונים חולה CML המתקבל CD34+ hematopoietic תאי גזע לפני ואחרי הטיפול בעזרת imatinib. ניתוח זה חשף בשלושה גנים (גורם שעתוק [c-פוס], ירידה לפרטים כפול פוספטאז 1 [Dusp1], ולא של RNA-מחייב חלבון [Zfp36]) אשר הם בדרך כלל upregulated תאים עמידים TKI. כדי לאמת את המשמעות של גנים אלו משוחח עמידות לתרופות, אנחנו ביצעו ניתוח במבחנה , ויוו צעד אחר צעד. רמות ביטוי של גנים אלה שאושרו על-ידי qPCR בזמן אמת (RT-qPCR), סופג המערבי תאים עמידים לתרופות. יתר על כן, ביטוי cDNA של נוקאאוט מאת shRNA סיכות של c-פוס, Dusp1, Zfp36 גילה כי c מוגברות-פוס וביטויים Dusp1 הם מספיק והכרחי להיוועץ TKI ההתנגדות. לכן, אנו לבצע אימות ויוו באמצעות העכבר מודלים עם c-פוס Dusp1 בלבד. לשם אימות גנטי של c-פוס, Dusp1, אנו נוצר c-פוסחליל/חליל ROSACreERT-inducible עכברים (מותנה נוקאאוט)14 , חצה אותם עם Dusp1- / - (ישר נוקאאוט)15 כדי להפוך ROSACreERT2-c-פוסחליל/חליל Dusp1- / - העכברים הטרנסגניים-כפול. תאי מח עצם-derived c-Kit+ (מ- c-פוסחליל/חליל-, Dusp1- / --, ו- c-פוסחליל/חלילDusp1- / -) המבטאת BCR-ABL1 היו שנותחה במבחנה המושבה יוצרי assay יחידה (CFU), ו . ב ויוו על ידי השתלת מח עצם בעכברים אולם לקרינה, כדי לבדוק את הדרישה של c-פוס, Dusp1 לבד או יחד בפיתוח לוקמיה. באופן דומה, העכבות כימי של c-פוס DFC (difluorinated כורכומין)16 , Dusp1 על ידי BCI (benzylidene-3-(cyclohexylamino)-2,3-dihydro-1H-inden-1-one)17 נבדקו במבחנה, ויוו באמצעות BCR-ABL1-המבטאת עצם תאי מח-derived c-Kit+ מן העכבר (WT) פראי-סוג. כדי לאשר את הדרישה של c-פוס, Dusp1 בתאי גזע לוקמיה, אנחנו מנוצל דגם העכבר CML איפה BCR-ABL1 היה במיוחד שנגזרות בתאי גזע שלו דוקסיציקלין (ט-transactivator מבטא תחת מאתר תאי לוקמיה (SCL) הגן 3' משפר... תקנה)18,19. השתמשנו מח עצם לין–סרוק+c-Kit+ (LSK) תאים מחלון אלו עכברים ב וזמינותו השתלת ויוו. יתר על כן, הקמנו phopsho-p38 רמות, הביטוי של IL-6 כמו דינמי-טוהר הפרמה קופ סמנים ביולוגיים עבור Dusp1 וניגוד c-פוס, בהתאמה, ויוו. לבסוף, כדי להרחיב את המחקר עבור רלוונטיות האדם, נגזר החולה CD34+ תאים (המקביל בתאי c-Kit+ של עכברים) היו כלפיהן לטווח ארוך במבחנה. מתחילה תרבות תא מבחני (LTCIC) ומודל העכבר humanized ויוו של לוקמיה מיאלואידית כרונית20,21. העכברים immunodeficient הושתלו עם לוקמיה מיאלואידית כרונית CD34 + תאי, ולאחריו הטיפול בתרופה וניתוח של הישרדות cell לוקמיה אנושי.
בפרויקט זה, אנו מפתחים שיטות זיהוי המטרה והאימותים באמצעות כלים גנטיים והן כימית, שימוש במודלים פרה שונה. שיטות אלה ניתן להחיל בהצלחה כדי לאמת את מטרות נוספות לפתח שיטות כימיות לפיתוח טיפולית.

<table><tbody><tr><td><חזק>חומרים ביולוגיים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Cellgro (קורנינג)</td><td>15-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro (קורנינג)</td><td>15-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Cellgro (קורנינג)</td><td>15-016-CVR</td><td></td></tr><tr><td>RetroNectin רקומביננטי שבר פיברונקטין אנושי</td><td>Takara</td><td>T100B</td><td></td></tr><tr><td>MethoCult GF M3434 (מתיל צלולוז לעכבר)</td> <td>תאי גזע</td><td>3434</td><td></td></tr><tr><td>MethoCult H4434 קלאסי (מתיל צלולוז ל-CFU אנושי)</td><td>תאי גזע</td><td>4434</td><td></td></tr><tr><td>4-הידרוקסיטאמוקסיפן</td><td>סיגמא</td><td>H6278</td><td></td></tr><tr><td>עכברים רקומביננטיים SCF</td><td>Prospec</td><td>CYT-275</td><td></td></tr><tr><td>עכברים רקומביננטיים Flt3-Ligand</td><td>Prospec</td><td>CYT-340</td><td></td></tr><tr><td>רקומביננטי עכברים IL-6</td><td>Prospec</td><td>CYT-350</td><td></td></tr><tr><td>עכברים רקומביננטיים IL-7</td><td>Peprotech</td><td>217-17</td><td></td></tr><tr><td>DFC</td><td>LKT Laboratories Inc.</td><td>D3420</td><td></td></tr><tr><td>BCI</td><td>Chemzon Scientific</td><td>NZ-06-195</td><td></td></tr><tr><td>מעבדת</td><td>LC</td><td>I-5508</td><td></td></tr><tr><td>כורכומין</td><td>סיגמא</td><td>458-37-7</td><td></td></tr><tr><td>NDGA</td><td>Sigma</td><td>500-38-9</td><td></td></tr><tr><td>Penn/Strep</td><td>Cellgro (corning)</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>אטלנטה ביולוגי</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין EDTA 1x</td><td>Cellgro (קורנינג)</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Cellgro (קורנינג)</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>Cellgro (קורנינג)</td><td>25-005-CL</td><td>5 מ"ג/מ"ל מלאי במים</td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Gibco (טכנולוגיות חיים)</td><td>A11138-03</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H7006</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4.7H2O</td><td>Sigma</td><td>S9390</td><td></td></tr><tr><td>פרוטאמין סולפט</td><td>Sigma</td><td>P3369</td><td>5 מ"ג/מ"ל מלאי במים</td></tr><tr><td>תמיסת טריפאן כחול (0.4%)</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Cellgro (קורנינג)</td><td>25-950-CQC</td><td></td></tr><tr><td>WST-1</td><td>Roche</td><td>11644807001</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &mu; מסנן דיסק אקרו M</td><td>PALL</td><td>2016-10</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m תאי ניילון Stariner</td><td>Becton Dickinson</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>FICOL (Histopaque 1083) (פוליסוכרוז)</td><td>Simga</td><td>1083</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21040CV</td><td></td></tr><tr><td>LS Columns</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>קוקטייל מעכב פרוטאז</td><td>Roche</td><td>קו-RO</td><td></td></tr><tr><td>קוקטייל מעכב פוספטאז 2</td><td>סיגמא</td><td>P5762</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocullulose Membrane</td><td>Bio-Rad</td><td>1620115</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate ( chemiluminiscence substrate)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>34075</td><td></td></tr><tr><td>CD5</td><td>eBioscience</td><td>13-0051-82</td><td></td></tr><tr><td>CD11b</td><td>eBioscience</td><td>13-0112-75</td><td></td></tr><tr><td>CD45R (B220)</td> <td>BD biosciences</td><td>553092</td><td></td></tr><tr><td>CD45.1-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0453-85</td><td></td></tr><tr><td>CD45.2-PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0454-83</td><td></td></tr><tr><td>hCD45-FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>555482</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Biotin-FITC</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-857&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-7-4</td><td>eBioscience</td><td>MA5-16539</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Gr-1 (Ly-6G/c)</td> <td>eBioscience</td><td>13-5931-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ter-119</td><td>eBioscience</td><td>13-5921-75</td><td></td></tr><tr><td>Ly-6 A/E (Sca1) PE Cy7</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>558612 נגמ"ש CD117&nbsp;</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>553356</tr><tr><td>BD Pharm Lyse</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>555899</tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm (תמיסת קיבוע וחדירה)</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>554714</tr><tr><td>BD סלסול/וושינגטון&nbsp; (תמיסת חדירה ושטיפה לזרימת פוספו)</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>554723</tr><tr><td>פוספו p38</td><td>טכנולוגיות איתות תאים</td><td>4511S</td><td></td></tr><tr><td>סה"כ p38</td><td>טכנולוגיות איתות תאים</td><td>9212</td><td></td></tr><tr><td>בקרת IgG עכבר</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>554121</tr><tr><td>קמח אלכסה 488 מצומד&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-11034</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלוריד</td><td>Invitrogen</td><td>K278001</td><td></td></tr><tr><td>2x HBS</td><td>Invitrogen</td><td>K278002</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Ambion</td><td>AM9261</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>צינורות נימי דם</td><td>Fisher</td><td>22-260-950</td><td></td></tr><tr><td>צינור איסוף דם</td><td>Giene Bio-One</td><td>450480</td><td></td></tr><tr><td>יילוד עגל סרום</td><td>אטלנטה ביולוגי</td><td>S11295</td><td></td></tr><tr><td>Erythropoiein</td><td>Amgen</td><td>5513-267-10</td><td></td></tr><tr><td>SCF אנושי</td><td>Prospec</td><td>CYT-255</td><td></td></tr><tr><td>אנושי IL-3</td><td>Prospec</td><td>CYT-210</td><td></td></tr><tr><td>G-SCF</td><td>Prospec</td><td>CYT-220</td><td></td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>Prospec</td><td>CYT-221</td><td></td></tr><tr><td>MyeloCult (מדיה לבדיקת LTCIC)</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5100</td><td></td></tr><tr><td>הידרוקורטיזון נתרן המיסוקסינט</td><td>טכנולוגיות תאי גזע</td><td>7904</td><td></td></tr><tr><td>MEM אלפא</td><td>Gibco</td><td>12561-056</td><td></td></tr><tr><td>1/2 סמ"ק Lo-Dose u-100 מזרק אינסולין 28 G1/2</td><td>Becton Dickinson</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>Mortor pestle</td><td>Coor tek&nbsp;</td><td>60316 ו- 60317</td><td></td></tr><tr><td>איזופלורן (איזותזיה TM)</td> <td>באטלר שיין</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>SOC</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>B90920s</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma</td><td>A0166</td><td>100 מ"ג/מ"ל מלאי במים</td></tr><tr><td>בקטו אגר (אגר)</td> <td>Difco</td><td>214050</td><td></td></tr><tr><td>מרק נהדר</td><td>בקטון דיקינסון</td><td>243820</td><td></td></tr><tr><td>אגרוז</td><td>Genemate</td><td>E-3119-500</td><td></td></tr><tr><td>דוקסיציקלין צ'או</td><td>TestDiet.com</td><td>52662</td><td>RMH1500 שונה, ניתן לחיטוי 5LK8&nbsp; עם 0.0625% דוקסיציקלין&nbsp;</td></tr><tr><td>טמוקסיפן</td><td>סיגמא</td><td>T5648</td><td></td></tr><tr><td>יודוניטרוטרזוליום כלוריד&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>I10406</td><td></td></tr><tr><td><ערכות חזקות>ערכות</חזקות></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dneasy ערכת דם ורקמות</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Green (טאק פולימראז עם צבע מטען ירוק)</td><td>Promega</td><td>M1722</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit&nbsp; (ערכת בידוד RNA)</td>ערכת Dnase ללא <td>DNA של Qiagen</td><td>217084</td><td></td></tr><tr><td>(טיפול ב-DNA עבור RT PCR)</td><td>אמביון, Life Technologies</td><td>AM1906</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III סינתזת גדיל ראשון (טרנסקריפטאז הפוך לסינתזת cDNA)</td><td>Invitrogen</td><td>18080051-SYBR</td><td></td></tr><tr><td>Green (תערובת פולימראז טאק עם צבע אינטרצ'לציה ירוק ל-qPCR)</td><td>ערכת MicroBead</td><td>1725270-CD117</td><td></td>Bio-Rad</tr><tr><td></td><td>Miltenyi</td><td>130-091-224</td><td></td></tr><tr><td>תרבית אנושית לטווח ארוך יוזמת בדיקת תאים</td><td>Stemp Cell Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator</td><td>Thermo scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Swing Bucket rotor cetrifuge 5810R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TC-10 מונה תאים אוטומטי</td><td>Bio-RAD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C-1000 Thermal Cycler</td><td>Bio-RAD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler Real Plex 2</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc Imaging System (מערכת הדמיה לג'לים וכתמים מערביים)</td><td>Bio-RAD</td><td>17001401</td><td></td></tr><tr><td>Hemavet (מונה בולד)</td><td>Drew-Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSR II (FACS analyzer)</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פורטסה I (מנתח FACS)</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSAriaII (סדרן FACS)</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מעמד מגנט</td><td>Miltenyi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Irradiator</td><td>&nbsp;J.L. Shepherd and Associates, San Fernando CA</td><td>Mark I דגם 68A</td><td>מקור Cs 137</td></tr><tr><td><חזק>עכברים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ROSACreERT2</td><td>מעבדת</td><td></td><td></td>ג'קסון</tr><tr><td>Scl-tTA&nbsp;</td><td>ד"ר קלאודיה הוטנר' s lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BoyJ&nbsp;</td><td>מתקן ליבת עכבר ב-CCHMC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57Bl/6&nbsp;</td>מתקן ליבת העכבר NSGS <td>של מעבדת</td><td></td><td></td>ג'קסון</tr><tr><td></td><td>ב-CCHMC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ROSACreERT2/c-Fosfl/fl Dusp1-/-&nbsp;</td><td>תוצרת הבית</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ROSACreERT2/c-Fosfl/fl</td><td>תוצרת הבית</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Cells</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BaF3</td><td>מתנה מג'ורג' דיילי, בית הספר לרפואה של הרווארד, בוסטון</td><td></td><td></td></tr><tr><td>WEHI</td><td>מתנה מג'ורג' דיילי, בית הספר לרפואה של הרווארד, בוסטון</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CML-CD34+ ותאי CD34+ רגילים</td><td>בית החולים האוניברסיטאי, אוניברסיטת סינסינטי</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

שיטות להערכת את התפקיד של c-פוס, dusp1 התלות אונקוגן

Methods for Evaluating the Role of c-Fos and Dusp1 in Oncogene Dependence

ההדגמה של מעכבי טירוזין קינאז (TKIs) בטיפול לוקמיה מיאלואידית כרונית (CML) יש בישרה עידן חדש ותרופות לסרטן. עם זאת, אוכלוסיה קטנה של תאים אינו מגיב לטיפול TKI, והתוצאה היא מחלה שיורית מינימלית (MRD); אפילו הכי חזק TKIs להיכשל כדי למגר תאים אלה. תאים אלה MRD לשמש מאגר לפתח עמידות לטיפול. למה TKI הטיפול אינו יעיל נגד MRD תאים לא ידוע. גורם הגדילה איתות הייתה שם בתמיכה ההישרדות של MRD תאים במהלך הטיפול TKI, אך הבנה מכניסטית לוקה בחסר. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו c מוגברות-פוס ואת הביטוי Dusp1 כתוצאה מתכנסת oncogenic פקטורי גדילה איתות בתאים MRD לתווך TKI ההתנגדות. עיכוב גנטי וכימי של c-פוס, Dusp1 מעבד לוקמיה מיאלואידית כרונית רגישים להפליא TKIs ומרפא CML בשני המודלים העכבר humanized גנטי. זוהו הגנים האלה היעד באמצעות מיקרו-מערכים מרובים TKI רגיש ותאים עמידים. כאן, אנו מספקים שיטות אימות היעד באמצעות העכבר במבחנה ויוו מודלים. שיטות אלה ניתן בקלות ליישם כל מטרה עבור אימות הגנטי ופיתוח טיפולית.

התמכרות אונקוגן היה מעורב יעילות טיפולית של TKIs. עם זאת, מנגנוני נהיגה התלות אונקוגן אינם מובנים. אנו לבצע ניתוחים ביטוי ג'ין לא משוחד מרובים כדי לזהות את הרכיב הגנטי מעורב מנצח ההתמכרות. ניתוחים אלה חשף קולטנים את upregulation של שלושה גנים ג-פוס, Dusp1, Zfp36, בתאי סרטן אשר אינם תלויים איתות oncogenic להישרדות ומהוות, לפיכך, רגישות לטיפול TKI. Downregulation של c-פוס, Dusp1 על ידי נוקאאוט בתיווך shRNA מספיקה לשחזר את הסמים רגישות בשן אחרת TKI עמידים תאים.
<p class="jove_content" fo...

כאן, אנו מתארים את פרוטוקולי האימות גנטי וכימי של c-פוס, Dusp1 כמטרה סמים בלוקמיה באמצעות העכבר גנטי, humanized במבחנה ויוו מודלים. בשיטה זו ניתן ליישם כל מטרה עבור אימות הגנטי ופיתוח טיפולית.

שיטות להערכת את התפקיד של c-פוס, Dusp1 התלות אונקוגן

The demonstration of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in treating chronic myeloid leukemia (CML) has heralded a new era in cancer therapeutics. However, ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומים טיפוליים בסרטן, כגון זיהוי של גנים מרכזיים המעורבים בתלות אונקוגנית. היתרון העיקרי של טכניקה זו היא שהיא מנצלת את התלות אונקוגן כי הוא משותף סרטן מונע קינאז רבים ולכן זה ישים על סוגי גידולים מרובים. למרות שיטה זו יכולה לספק תובנה לוקמיה, זה יכול להיות מיושם גם על מערכות אחרות, כמו גידולים מוצקים כגון סרטן ריאות, גידולים במוח, גידולים בלבלב.בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו ייאבקו בשל חוסר ניסיון בביולוגיה מולקולרית ופיזיולוגיה תאית. כדי להתחיל, לקצור את עצמות הרגל מעכבר המתת דם. נקה את הרקמות מהעצמות עם אזמל.ואז למקם את העצמות PBS קר על קרח למחוץ את העצמות עם עלה. לאחר מכן, לסנן את ההשעיה התא דרך מסננת תא 70 מיקרומטר לתוך צינור כובע בורג 50 מיליליטר עם פיפטה 10 מיליליטר. לשטוף את המרגמה ואת העלי מספר פעמים עם PBS קר ולהוסיף את ההשעיה התא לצינור 50 מיליליטר.הבא צנטריפוגה מח העצם ולהסיר את supernatant עם ואקום פיפטה זכוכית. תן מחדש את גלולת התא ב-5 מיליליטר של פי.בי.אס. באמצעות פיפטה, מוסיפים לאט את מח העצם התלוי לראש טמפרטורת החדר פולי-סוכרוז.לאחר מכן, לסובב את פולי סוכרוז ב 400 Gs במשך 20 דקות עם הבלם כבוי. לאחר צנטריפוגה, לאסוף את ממשק תא מונו גרעיני הכולל מעונן עם פיפטה ולהעביר אותו צינור חדש 15 מיליליטר. הביאו את עוצמת הקול ל-10 מיליליטר עם PBS והסירו 20 מיקרוליטר לספירה.לאחר צנטריפוגה, להשליך את supernatant ולה מניחים את גלולה על קרח. לאחר מכן, לחץ מחדש על גלולת התא ב- PBS עם EDTA ו- BSA. הוסף חיידקים CD117 לתליית התא, ומערבולת לערבב.לאחר מכן, הדגירה את ההשעיה במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן להביא את הנפח עד 10 מיליליטר עם PBS יותר עם EDTA ו BSA וצנטריפוגה ב 1200 G של ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות. השתמש בוואקום כדי להסיר את העל-טבעי ולהשעות את גלולת התא ב- PBS עם EDTA ו- BSA.לאחר מכן הוסיפו 3 מיליליטר של PBS עם EDTA ו-BSA לעמוד מגנט עם עמוד מגנטי ואפשרו לו לזרום לתוך צינור איסוף. לאחר סיום המאגר זורם דרך העמודה, להוסיף את המתלה התא ולאפשר לו לזרום דרך העמודה לתוך צינור האיסוף. הבא להוסיף 5 מיליליטר נוספים של PBS עם EDTA ו BSA לעמודה לשטוף אותו מיד עם הבוכנה.הסר את הבוכנה וחזור על הסומק לפני ספירת התאים. לאחר צנטריפוגה של התאים, להסיר את supernatant ולהשעות את גלולת התא IMDM מלא לתרבות. תרבו את התאים בן לילה ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני.ראשית, לשלב את ה-DNA פלסמיד רטרו-ויראלי עם פלסמיד האריזה, סידן כלורי ומים בצינור 1.5 מיליליטר. לאחר מכן הוסיפו 500 מיקרוליטרים של HBS לצינור נוסף של 1.5 מיליליטר. מוסיפים את תערובת ה- transfection drop-wise לצינור המכיל HBS ובו זמנית מערבבים עם המערבולת מוגדרת להגדרה הנמוכה ביותר.דגירה תערובת transfection בטמפרטורת החדר במשך 20 עד 30 דקות. במהלך תקופת הדגירה, מוסיפים כלורוקין לתאי HEK ולשמור אותם באינקובטור. לאחר הוספת תערובת transfection, דגירה התאים במשך 8 שעות ב 37 מעלות צלזיוס 5%CO2 אינקובטור שינוי המדיה התא על ידי הוספת 14 מיליליטר של מדיה DMEM10 טרי לאט מאוד.צינורות לאט על הקיר של המנה מסייעת למנוע כל הפשטה של תאי HEK. ואז לה הדגירה את התאים לילה ב 37 מעלות צלזיוס 5%CO2 אינקובטור. השתמש מזרק 10 מיליליטר כדי לאסוף את supernatant ויראלי.לאחר מכן צרף מסנן מזרק מיקרומטר 0.45 למזרק. לצלול supernatant ויראלי לתוך צינור אוסף חדש. לאסוף את supernatant ויראלי כ 16 שעות מאוחר יותר.לאחר מכן, להוסיף שני מיליליטר של שבר פיברונקין אנושי רקומביננטי ב PBS כדי מטופלים 6 צלחות תרבות היטב. למחרת, להשתמש פיפטה כדי להסיר את fibronectin מן הצלחות. חוסמים את הצלחות עם 2% BSA ב- PBS ו דגירה את הצלחות בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.השתמש בוואקום כדי להסיר BSA ולשטוף את הצלחות עם PBS לפני הסרתו עם ואקום. לאחר מכן, מיד להוסיף את supernatant ויראלי מסונן צנטריפוגה את הצלחת במשך שעתיים. השתמש בוואקום כדי להסיר את העל-טבעי ולסובב את הצלחת שוב.לאחר מכן להסיר את supernatant עם ואקום ולשטוף את בארות מצופה ויראלי עם PBS. הסר את PBS עם ואקום, להוסיף את c-Kip בתרבות בעבר בתוספת תאי עכבר ל בארות מצופה ויראלי. לאחר הצנטריפוגה, הדגירה את התאים ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני.48 שעות לאחר ההעתקה, גלולה את התאים באמצעות צנטריפוגה ולתלות אותם מחדש במאגר FACS 1. ראשית להפשיר את תאית מתיל עם ציטוקינות לעכברים בטמפרטורת החדר. ואז aliquot 3 מיליליטר של תאית מתיל בצינור FACS.הוסף 100 microliters של ההשעיה התא עם המעכבים המתאימים 3 מיליליטר של תאית מתיל. ואז מערבולת ההשעיה על גבוה במשך 10 עד 30 שניות. לאחר שרוב בועות האוויר לברוח, להשתמש מזרק 1 מיליליטר כדי צלחת 1 מיליליטר של התקשורת בשלושה לוחות לשכפל.מניחים את הצלחות בצלחת פטרי גדולה יחד עם מנה פתוחה אחת המכילה מים סטריליים. לאחר מכן מכסים את צלחת פטרי הגדולה ומדרגים את התאים ב-37 מעלות צלזיוס. הכינו את כתם הכלוריד יודוניטרוטרזוליום על ידי המסת 10 מיליגרם של כלוריד היודוניטרוטרזוליום ב-10 מיליליטר מים.המסנן מעקר את תותב הכתמים באמצעות מזרק מנעול לולר המצויד במסנן מיקרומטר 0.2. במכסה המנוע של תרבות הרקמות, הוסיפו 100 מיקרוליטרים של פתרון הכתם מבחינת טיפה סביב צלחת ה-CFU. ואז להידגר הצלחות לילה ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור תרבות התא.לבסוף, לאחר המושבות הפכו צבע חום אדום כהה, להשתמש ברקע לבן במכסה המנוע של תרבות הרקמה סטרילית לצלם את צלחת CFU מוכתם. בפרוטוקול זה, ניתוחים רבים של ביטויי גנים לא משוחדים שימשו לזיהוי המרכיב הגנטי המתזמר התמכרות לאנקוגנית. כדי לאמת את התפקיד של c-Fos ו Dusp1 כיעד טיפולי לוקמיה, לחץ יתר שלהם אושרה עם תאים המבטאים את אונקוגן BCR-ABL1.ניתוח באמצעות RT-qPCR ו כתמים מערביים אישרו כי שניהם נגרמו על ידי BCR-ABL1 ושביטוים מוגבר על ידי גורם גדילה IL-3. YFP בתוספת תאים אקספרס היו ממוינים באמצעות FACS להמשך במבחנה ובדיקות vivo. התוצאות הראו כי מחיקה של c-Fos ו Dusp1 לבד עיכב מספרי CFU.תאים חסרים הן c-Fos ו Dusp1 נפגעו באופן משמעותי ביכולתם ליצור מושבות וטיפול Imatinib מחק את כל CFUs המציין כי אובדן c-Fos ו Dusp1 הוא קטלני באופן סינטטי לביטוי BCR-ABL1. לאחר התפתחות זו, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הסרטן לחקור את הרשתות הגנטיות והגנים המניעים תלות אונקוגנית וכיצד גנים אלה משפיעים על תגובתם המסוימת במודלים של עכברים וחולים אנושיים. אל תשכח כי עבודה עם retroviruses ודגימות המטופל יכול להיות מסוכן מאוד בטוח שיטות מעבדה יש לראות בעת ביצוע הליך זה.

methods-for-evaluating-role-c-fos-dusp1-oncogene

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

סרטון זה מתאר את הפרוטוקול לאימות גנטי על ידי העברת גני מטרה באמצעות רטרו-וירוסים בשורות תאי לוקמיה מיאלואידית כרונית. הרטרו-וירוסים פועלים כמתווך להעברת חומר גנטי לתא הלוקמיה בתהליך הנקרא טרנסדוקציה, המאפשר ביטוי ארוך טווח של גן המטרה. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על כל תאי המטרה לצורך אימות גנטי ופיתוח טיפולי.

התמרה בתיווך רטרו-ויראלי: שיטה להחדרת גן מטרה לתאים סרטניים

Assay גיבוש הפוקוס מספק שיטה פשוטה להעריך את הפוטנציאל להפוך לאונקוגן מועמד.

להתמקד גיבוש: Assay מבוסס תאים כדי לקבוע את הפוטנציאל שבעור של ג&#39;ין

פרוטוקול זה מדגים כיצד ליצור מסומן פלורסנטי, גידולים המשובטים מוגדר גנטית בעין תסיסנית / דיסקים דמותי מחושים (EAD). הוא מתאר כיצד לנתח את EAD והמוח מן הזחלים instar השלישי וכיצד לעבד אותם לחזות ולכמת שינויים בהתבטאות גנים הפולשנות הגידול.

ה<em&gt; תסיסנית</em&gt; דגם גידול דיסק דמותי: ויזואליזציה וכימות של ביטוי גנים סרטניים הפולשנות שימוש פסיפסים גנטי

זיהוי מטרות תרופות חדשות שעוברות מניסויים פרה-קליניים לניסויים בבני אדם הוא בראש סדר העדיפויות המדעי. לשם כך, אנו מתארים כאן גישה גנומית פונקציונלית לבחינת ההשפעה של דלדול גנים על ספרואידים בקו תאים סרטניים, אשר מודלים בצורה מתאימה יותר סרטן אנושי in vivo.

ניצול הקרנת Genomics פונקציונלית כדי לזהות מטרות תרופה חדשנית פוטנציאלי תרבויות אליפטית תא סרטני

כתב יד זה מתאר שיטה CRISPR-Cas9 מבוססי מקובצים באופן קבוע Interspaced קצר Palindromic חוזר (CRISPR) לחקירה פשוט ומהיר של התפקיד של גנים מרובים המועמד בהתפשטות תאים לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML) ב במקביל. טכניקה זו היא מדרגית, יכול להיות מיושם במבנים אחרים סרטן התא גם כן.

החקירה של תלות גנטית באמצעות מבחני תחרות המבוססות על CRISPR-Cas9

ספרייה CRISPR/sgRNA הוחל כדי לחקור חלבונים. עם זאת, הכדאיות של ספרייה sgRNA לחשוף את הפונקציה של גבול CTCF ב הכונה נשאר נחקרו. כאן, אנו מתארים ספרייה ספציפית sgRNA לוקוסים HOX התירי את הפונקציה של גבולות CTCF HOX לוקוסים.

HOX לוקוסים Focused CRISPR/sgRNA ספריית הקרנת זיהוי קריטי CTCF גבולות

תחומים עם הפרעה מהותית חשובים לתפקוד גורם שעתוק היתוך אונקוגני. כדי למקד חלבונים אלה באופן טיפולי, נדרשת הבנה מפורטת יותר של מנגנוני הרגולציה המועסקים על ידי תחומים אלה. כאן, אנו משתמשים בתעתיק כדי למפות תכונות מבניות חשובות של תחום EWS שהופרע באופן מהותי בסרקומה יואינג.

מיפוי קשרי מבנה-פונקציה של גורמי שעתוק אונקוגניים מופרעים באמצעות ניתוח תמלול

כאן, אנו מציגים את ההליכים עבור FAM83A knockdown; הבדיקות לאיתור השפעותיו על התפשטות, הגירה ופלישה של תאי סרטן צוואר הרחם; ואת הרגישות של תאים אלה כדי cisplatin. מחקר זה מספק גן מטרה מבטיח לסרטן צוואר הרחם והפניה למחקר תרופתי נוסף.

הפלת FAM83A כדי לאמת את תפקידו בצמיחת תאי סרטן צוואר הרחם וברגישות לציספלטין

מחקר זה מתאר פרוטוקול לבחינת ההשפעות של שינוי pH על ביטוי אונקוגן באמצעות ניתוח RNA-seq של קו תאי צינור הלבלב.

ניתוח ביטוי אונקוגנים עם שינויים ב-pH בקו תאי צינור הלבלב

הבנת ההתנהגות הממאירה של סרטן דורשת יצירת מודלים מדויקים של האופן שבו תאי הגידול מתקשרים עם מרכיבים של מיקרו-סביבת הגידול, כגון מקרופאגים. כאן אנו מתארים שתי שיטות לחקר אינטראקציה של תאי גליובלסטומה עם מקרופאגים ומיקרוגליה הקשורים לגידול שבהם מוערכת ההשפעה על פלישת גליובלסטומה.

מבחני Coculture ללמוד מקרופאג Microglia גירוי של גליובלסטומה הפלישה

חקור שיטות לאימות c-Fos ו-Dusp1 כמטרות תרופתיות בלוקמיה באמצעות מודלים גנטיים וכימיים. השיטה מתאימה לסוגי גידולים שונים ומספקת תובנות לתלות אונקוגנית בקרסינומה.

שיטות להערכת את התפקיד של c-פוס, Dusp1 התלות אונקוגן

גלה סרטונים נוספים