שיטות להערכת את התפקיד של c-פוס, Dusp1 התלות אונקוגן

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומים טיפוליים בסרטן, כגון זיהוי של גנים מרכזיים המעורבים בתלות אונקוגנית. היתרון העיקרי של טכניקה זו היא שהיא מנצלת את התלות אונקוגן כי הוא משותף סרטן מונע קינאז רבים ולכן זה ישים על סוגי גידולים מרובים. למרות שיטה זו יכולה לספק תובנה לוקמיה, זה יכול להיות מיושם גם על מערכות אחרות, כמו גידולים מוצקים כגון סרטן ריאות, גידולים במוח, גידולים בלבלב.

בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו ייאבקו בשל חוסר ניסיון בביולוגיה מולקולרית ופיזיולוגיה תאית. כדי להתחיל, לקצור את עצמות הרגל מעכבר המתת דם. נקה את הרקמות מהעצמות עם אזמל.

ואז למקם את העצמות PBS קר על קרח למחוץ את העצמות עם עלה. לאחר מכן, לסנן את ההשעיה התא דרך מסננת תא 70 מיקרומטר לתוך צינור כובע בורג 50 מיליליטר עם פיפטה 10 מיליליטר. לשטוף את המרגמה ואת העלי מספר פעמים עם PBS קר ולהוסיף את ההשעיה התא לצינור 50 מיליליטר.

הבא צנטריפוגה מח העצם ולהסיר את supernatant עם ואקום פיפטה זכוכית. תן מחדש את גלולת התא ב-5 מיליליטר של פי.בי.אס. באמצעות פיפטה, מוסיפים לאט את מח העצם התלוי לראש טמפרטורת החדר פולי-סוכרוז.

לאחר מכן, לסובב את פולי סוכרוז ב 400 Gs במשך 20 דקות עם הבלם כבוי. לאחר צנטריפוגה, לאסוף את ממשק תא מונו גרעיני הכולל מעונן עם פיפטה ולהעביר אותו צינור חדש 15 מיליליטר. הביאו את עוצמת הקול ל-10 מיליליטר עם PBS והסירו 20 מיקרוליטר לספירה.

לאחר צנטריפוגה, להשליך את supernatant ולה מניחים את גלולה על קרח. לאחר מכן, לחץ מחדש על גלולת התא ב- PBS עם EDTA ו- BSA. הוסף חיידקים CD117 לתליית התא, ומערבולת לערבב.

לאחר מכן, הדגירה את ההשעיה במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן להביא את הנפח עד 10 מיליליטר עם PBS יותר עם EDTA ו BSA וצנטריפוגה ב 1200 G של ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות. השתמש בוואקום כדי להסיר את העל-טבעי ולהשעות את גלולת התא ב- PBS עם EDTA ו- BSA.

לאחר מכן הוסיפו 3 מיליליטר של PBS עם EDTA ו-BSA לעמוד מגנט עם עמוד מגנטי ואפשרו לו לזרום לתוך צינור איסוף. לאחר סיום המאגר זורם דרך העמודה, להוסיף את המתלה התא ולאפשר לו לזרום דרך העמודה לתוך צינור האיסוף. הבא להוסיף 5 מיליליטר נוספים של PBS עם EDTA ו BSA לעמודה לשטוף אותו מיד עם הבוכנה.

הסר את הבוכנה וחזור על הסומק לפני ספירת התאים. לאחר צנטריפוגה של התאים, להסיר את supernatant ולהשעות את גלולת התא IMDM מלא לתרבות. תרבו את התאים בן לילה ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני.

ראשית, לשלב את ה-DNA פלסמיד רטרו-ויראלי עם פלסמיד האריזה, סידן כלורי ומים בצינור 1.5 מיליליטר. לאחר מכן הוסיפו 500 מיקרוליטרים של HBS לצינור נוסף של 1.5 מיליליטר. מוסיפים את תערובת ה- transfection drop-wise לצינור המכיל HBS ובו זמנית מערבבים עם המערבולת מוגדרת להגדרה הנמוכה ביותר.

דגירה תערובת transfection בטמפרטורת החדר במשך 20 עד 30 דקות. במהלך תקופת הדגירה, מוסיפים כלורוקין לתאי HEK ולשמור אותם באינקובטור. לאחר הוספת תערובת transfection, דגירה התאים במשך 8 שעות ב 37 מעלות צלזיוס 5%CO2 אינקובטור שינוי המדיה התא על ידי הוספת 14 מיליליטר של מדיה DMEM10 טרי לאט מאוד.

צינורות לאט על הקיר של המנה מסייעת למנוע כל הפשטה של תאי HEK. ואז לה הדגירה את התאים לילה ב 37 מעלות צלזיוס 5%CO2 אינקובטור. השתמש מזרק 10 מיליליטר כדי לאסוף את supernatant ויראלי.

לאחר מכן צרף מסנן מזרק מיקרומטר 0.45 למזרק. לצלול supernatant ויראלי לתוך צינור אוסף חדש. לאסוף את supernatant ויראלי כ 16 שעות מאוחר יותר.

לאחר מכן, להוסיף שני מיליליטר של שבר פיברונקין אנושי רקומביננטי ב PBS כדי מטופלים 6 צלחות תרבות היטב. למחרת, להשתמש פיפטה כדי להסיר את fibronectin מן הצלחות. חוסמים את הצלחות עם 2% BSA ב- PBS ו דגירה את הצלחות בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.

השתמש בוואקום כדי להסיר BSA ולשטוף את הצלחות עם PBS לפני הסרתו עם ואקום. לאחר מכן, מיד להוסיף את supernatant ויראלי מסונן צנטריפוגה את הצלחת במשך שעתיים. השתמש בוואקום כדי להסיר את העל-טבעי ולסובב את הצלחת שוב.

לאחר מכן להסיר את supernatant עם ואקום ולשטוף את בארות מצופה ויראלי עם PBS. הסר את PBS עם ואקום, להוסיף את c-Kip בתרבות בעבר בתוספת תאי עכבר ל בארות מצופה ויראלי. לאחר הצנטריפוגה, הדגירה את התאים ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני.

48 שעות לאחר ההעתקה, גלולה את התאים באמצעות צנטריפוגה ולתלות אותם מחדש במאגר FACS 1. ראשית להפשיר את תאית מתיל עם ציטוקינות לעכברים בטמפרטורת החדר. ואז aliquot 3 מיליליטר של תאית מתיל בצינור FACS.

הוסף 100 microliters של ההשעיה התא עם המעכבים המתאימים 3 מיליליטר של תאית מתיל. ואז מערבולת ההשעיה על גבוה במשך 10 עד 30 שניות. לאחר שרוב בועות האוויר לברוח, להשתמש מזרק 1 מיליליטר כדי צלחת 1 מיליליטר של התקשורת בשלושה לוחות לשכפל.

מניחים את הצלחות בצלחת פטרי גדולה יחד עם מנה פתוחה אחת המכילה מים סטריליים. לאחר מכן מכסים את צלחת פטרי הגדולה ומדרגים את התאים ב-37 מעלות צלזיוס. הכינו את כתם הכלוריד יודוניטרוטרזוליום על ידי המסת 10 מיליגרם של כלוריד היודוניטרוטרזוליום ב-10 מיליליטר מים.

המסנן מעקר את תותב הכתמים באמצעות מזרק מנעול לולר המצויד במסנן מיקרומטר 0.2. במכסה המנוע של תרבות הרקמות, הוסיפו 100 מיקרוליטרים של פתרון הכתם מבחינת טיפה סביב צלחת ה-CFU. ואז להידגר הצלחות לילה ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור תרבות התא.

לבסוף, לאחר המושבות הפכו צבע חום אדום כהה, להשתמש ברקע לבן במכסה המנוע של תרבות הרקמה סטרילית לצלם את צלחת CFU מוכתם. בפרוטוקול זה, ניתוחים רבים של ביטויי גנים לא משוחדים שימשו לזיהוי המרכיב הגנטי המתזמר התמכרות לאנקוגנית. כדי לאמת את התפקיד של c-Fos ו Dusp1 כיעד טיפולי לוקמיה, לחץ יתר שלהם אושרה עם תאים המבטאים את אונקוגן BCR-ABL1.

ניתוח באמצעות RT-qPCR ו כתמים מערביים אישרו כי שניהם נגרמו על ידי BCR-ABL1 ושביטוים מוגבר על ידי גורם גדילה IL-3. YFP בתוספת תאים אקספרס היו ממוינים באמצעות FACS להמשך במבחנה ובדיקות vivo. התוצאות הראו כי מחיקה של c-Fos ו Dusp1 לבד עיכב מספרי CFU.

תאים חסרים הן c-Fos ו Dusp1 נפגעו באופן משמעותי ביכולתם ליצור מושבות וטיפול Imatinib מחק את כל CFUs המציין כי אובדן c-Fos ו Dusp1 הוא קטלני באופן סינטטי לביטוי BCR-ABL1. לאחר התפתחות זו, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הסרטן לחקור את הרשתות הגנטיות והגנים המניעים תלות אונקוגנית וכיצד גנים אלה משפיעים על תגובתם המסוימת במודלים של עכברים וחולים אנושיים. אל תשכח כי עבודה עם retroviruses ודגימות המטופל יכול להיות מסוכן מאוד בטוח שיטות מעבדה יש לראות בעת ביצוע הליך זה.