Name: שיטות להערכת את התפקיד של c-פוס, Dusp1 התלות אונקוגן (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: חקור שיטות לאימות c-Fos ו-Dusp1 כמטרות תרופתיות בלוקמיה באמצעות מודלים גנטיים וכימיים. השיטה מתאימה לסוגי גידולים שונים ומספקת תובנות לתלות אונקוגנית בקרסינומה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

המחברים מודים ל ג ש דיילי למתן התאים BaF3 ועל ה-וואי ובונה רייה ט עבור MSCV-BCR-ABL-Ires-YFP. המחברים מודים ל מ קרול למתן דגימות החולה מן המשבר הפיצוץ לוקמיה מיאלואידית כרונית. מחקר זה נתמך על ידי מענקים כדי M.A. מ- NCI (1RO1CA155091), לוקמיה Research Foundation, קרן V ומ NHLBI (R21HL114074-01).

<ol><li>Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+chronic+myelogenous+leukemia+in+mice+by+the+P210bcr%2Fabl+gene+of+the+Philadelphia+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome.</a> Science. 247, 824-830 (1990).</li>
<li>Druker, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+selective+inhibitor+of+the+Abl+tyrosine+kinase+on+the+growth+of+Bcr-Abl+positive+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells.</a> Nature Medicine. 2, 561-566 (1996).</li>
<li>Mahon, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discontinuation+of+imatinib+in+patients+with+chronic+myeloid+leukaemia+who+have+maintained+complete+molecular+remission+for+at+least+2+years%3A+the+prospective%2C+multicentre+Stop+Imatinib+%28STIM%29+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Oncology%22%5BJournal%5D)">Discontinuation of imatinib in patients with chronic myeloid leukaemia who have maintained complete molecular remission for at least 2 years: the prospective, multicentre Stop Imatinib (STIM) trial.</a> Lancet Oncology. 11, 1029-1035 (2010).</li>
<li>O'Hare, T., Zabriskie, M. S., Eiring, A. M., Deininger, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pushing+the+limits+of+targeted+therapy+in+chronic+myeloid+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Pushing the limits of targeted therapy in chronic myeloid leukaemia.</a> Nature Reviews Cancer. 12, 513-526 (2012).</li>
<li>Rousselot, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imatinib+mesylate+discontinuation+in+patients+with+chronic+myelogenous+leukemia+in+complete+molecular+remission+for+more+than+2+years%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Imatinib mesylate discontinuation in patients with chronic myelogenous leukemia in complete molecular remission for more than 2 years.</a> Blood. 109, 58-60 (2007).</li>
<li>Krause, D. S., Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+kinases+as+targets+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tyrosine kinases as targets for cancer therapy.</a> The New England Journal of Medicine. 353, 172-187 (2005).</li>
<li>Sharma, S. V., Settleman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+the+balance+between+life+and+death%3A+targeted+cancer+therapy+and+%22oncogenic+shock%22%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Exploiting the balance between life and death: targeted cancer therapy and "oncogenic shock".</a> Biochemical Pharmacology. 80, 666-673 (2010).</li>
<li>Sharma, S. V., Settleman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogene+addiction%3A+setting+the+stage+for+molecularly+targeted+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Oncogene addiction: setting the stage for molecularly targeted cancer therapy.</a> Genes & Development. 21, 3214-3231 (2007).</li>
<li>Weinstein, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer.+Addiction+to+oncogenes--the+Achilles+heal+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cancer. Addiction to oncogenes--the Achilles heal of cancer.</a> Science. 297, 63-64 (2002).</li>
<li>Corbin, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+chronic+myeloid+leukemia+stem+cells+are+insensitive+to+imatinib+despite+inhibition+of+BCR-ABL+activity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Human chronic myeloid leukemia stem cells are insensitive to imatinib despite inhibition of BCR-ABL activity.</a> The Journal of Clinical Investigation. 121, 396-409 (2011).</li>
<li>Straussman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+micro-environment+elicits+innate+resistance+to+RAF+inhibitors+through+HGF+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour micro-environment elicits innate resistance to RAF inhibitors through HGF secretion.</a> Nature. 487, 500-504 (2012).</li>
<li>Wilson, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+potential+for+growth-factor-driven+resistance+to+anticancer+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Widespread potential for growth-factor-driven resistance to anticancer kinase inhibitors.</a> Nature. 487, 505-509 (2012).</li>
<li>Kesarwani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+c-FOS+and+DUSP1+abrogates+intrinsic+resistance+to+tyrosine-kinase+inhibitor+therapy+in+BCR-ABL-induced+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Targeting c-FOS and DUSP1 abrogates intrinsic resistance to tyrosine-kinase inhibitor therapy in BCR-ABL-induced leukemia.</a> Nature Medicine. 23, 472-482 (2017).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((c-fos+regulates+neuronal+excitability+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">c-fos regulates neuronal excitability and survival.</a> Nature Genetics. 30, 416-420 (2002).</li>
<li>Dorfman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+the+erp%2Fmkp-1+gene+does+not+affect+mouse+development%3A+normal+MAP+kinase+activity+in+ERP%2FMKP-1-deficient+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Disruption of the erp/mkp-1 gene does not affect mouse development: normal MAP kinase activity in ERP/MKP-1-deficient fibroblasts.</a> Oncogene. 13, 925-931 (1996).</li>
<li>Padhye, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorocurcumins+as+cyclooxygenase-2+inhibitor%3A+molecular+docking%2C+pharmacokinetics+and+tissue+distribution+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Fluorocurcumins as cyclooxygenase-2 inhibitor: molecular docking, pharmacokinetics and tissue distribution in mice.</a> Pharmaceutical Research. 26, 2438-2445 (2009).</li>
<li>Molina, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+chemical+screening+reveals+an+inhibitor+of+Dusp6+that+expands+cardiac+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages.</a> Nature Chemical Biology. 5, 680-687 (2009).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+targeting+of+quiescent+chronic+myelogenous+leukemia+stem+cells+by+histone+deacetylase+inhibitors+in+combination+with+imatinib+mesylate%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Effective targeting of quiescent chronic myelogenous leukemia stem cells by histone deacetylase inhibitors in combination with imatinib mesylate.</a> Cancer Cell. 17, 427-442 (2010).</li>
<li>Koschmieder, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+chronic+phase+of+myeloid+leukemia+with+expansion+of+hematopoietic+stem+cells+in+a+transgenic+model+of+BCR-ABL+leukemogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Inducible chronic phase of myeloid leukemia with expansion of hematopoietic stem cells in a transgenic model of BCR-ABL leukemogenesis.</a> Blood. 105, 324-334 (2005).</li>
<li>Abraham, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+targeting+of+p53+and+c-MYC+selectively+eliminates+leukaemic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dual targeting of p53 and c-MYC selectively eliminates leukaemic stem cells.</a> Nature. 534, 341-346 (2016).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+p53+by+SIRT1+inhibition+enhances+elimination+of+CML+leukemia+stem+cells+in+combination+with+imatinib%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Activation of p53 by SIRT1 inhibition enhances elimination of CML leukemia stem cells in combination with imatinib.</a> Cancer Cell. 21, 266-281 (2012).</li>
<li>Qiagen-miRNAeasy kit. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/rna/mirna/mirneasy-mini-kit/#resources">https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/rna/mirna/mirneasy-mini-kit/#resources</a> (2018).</li>
<li>DNA-free DNA removal kit. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM1906?gclid=EAIaIQobChMIg4D-_ZvC2wIVx5-zCh00Cg8fEAAYASAAEgIv6vD_BwE&s_kwcid=AL!3652!3!264318446624!b!!g!!&ef_id=V7SO5AAAAck3ba89:20180607185004:s">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM1906?gclid=EAIaIQobChMIg4D-_ZvC2wIVx5-zCh00Cg8fEAAYASAAEgIv6vD_BwE&s_kwcid=AL!3652!3!264318446624!b!!g!!&ef_id=V7SO5AAAAck3ba89:20180607185004:s</a> (2018).</li>
<li>SuperScript™ III First-Strand Synthesis System. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18080051">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18080051</a> (2018).</li>
<li>Human Long Term Culture Initiating Cell Itc-ic Assay. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.stemcell.com/human-long-term-culture-initiating-cell-ltc-ic-assay.html">https://www.stemcell.com/human-long-term-culture-initiating-cell-ltc-ic-assay.html</a> (2018).</li>
<li>Abarrategi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+human+bone+marrow+niche+in+mice%3A+From+host+bone+marrow+engraftment+to+bioengineering+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Modeling the human bone marrow niche in mice: From host bone marrow engraftment to bioengineering approaches.</a> Journal of Experimental Medicine. 215, 729-743 (2018).</li>
<li>Kesarwani, M., Huber, E., Kincaid, Z., Azam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+screening+and+validation+of+resistant+mutations+against+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A method for screening and validation of resistant mutations against kinase inhibitors.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2014).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

עבור חלק הארי של תאים סרטניים, התגובה הטיפולית TKI מתווך על ידי מצור של אותות טירוזין-קינאז-oncoprotein אשר הגידול הוא מכור. עם זאת, יחסית מעט מאוד ידוע על איך מיעוט של תאים סרטניים לתרום MRD לברוח אונקוגן התלות וטיפול4. מחקרים שנעשו לאחרונה חשף כי גורם הגדילה איתות שמתווכת תרופתיים לוקמיה והן גידולים מוצק איברים. הדבר מצביע על מנגנונים מולקולריים שונים עשויה ביסוד מהותי להתנגדות10,11,12. כדי להבין את המנ...

פעילות קינאז טירוזין המכונן של BCR-ABL1 פיוז'ן אונקוגן גורמת CML, אשר מהווה הרציונל למקד את פעילות קינאז על ידי מעכבי מולקולה קטנה. ההצלחה של TKIs בטיפול בחולי CML מהפכה הקונספט של טיפול ממוקד1,2. לאחר מכן, טיפול אנטי-קינאז כתרופה דיוק פותחה עבור מספר ממאירויות אחרות, כולל גידולים מוצקים. עד כה, מעכבי קינאז יותר משלושים אושרו על ידי ה יונייטד המדינה-FDA לטיפול גידולים ממאירים שונים. בעוד TKI טיפול יעיל מאוד בדיכוי המחלה, זה לא מרפא. חוץ מזה, אוכלוסיה קטנה של תאים סרטניים נמשכת במהלך הטיפול:4,3,MRD5. אפילו חולים אשר הראו הפוגה מלאה נשארים עם MRD, אשר בסופו של דבר התוצאות ב- relapse אם לא באופן רציף מודחקים. לכן, מיגור של MRD תאים נדרש כדי להשיג היענות עמיד או ריפוי. לוקמיה מיאלואידית כרונית מייצג פרדיגמה ערך להגדרת המושג דיוק רפואה, מנגנונים של oncogenesis, הרפוי רציונלי מכוון מטרה, התקדמות המחלה תרופתיים. עם זאת, גם היום, מנגנון נהיגה מוות תאי TKI-induced בתאי סרטן אינה מובנת במלואה, ולא למה תאים MRD (המורכב של תאי גזע לוקמיה [LSCs]) עמידים ממהותם4,TKIs6. למרות זאת, התופעה של "תלות אונקוגן" כדי oncoprotein קינאז מוטציה הוא בהפרות יעילות TKI איפה עיכוב חריפה של יישוב אונקוגן מאת TKIs גורם מכת oncogenic שמוביל מסיבי proapoptotic תגובה או תרדמה בתא באופן תלוי-ההקשר6,7,8,9. עם זאת, בהתפשטות אונקוגן התלות מכניסטית לוקה בחסר. מחקרים שנעשו לאחרונה לסבך כי גורם הגדילה איתות abrogates אונקוגן התלות, כתוצאה מכך מקנה עמידות TKI טיפול10,11,12. לכן, כדי לזכות בתובנה המנגנון של אונקוגן התלות, ביצענו הגנום כולו ביטוי פרופיל של BCR-ABL1 מכורים ותאים nonaddicted (גדל עם גורמי גדילה), אשר גילה ש- c-פוס ו Dusp1 הם מתווכים קריטי של אונקוגן התמכרות13. המחיקה גנטי של c-פוס, Dusp1 תאים קטלניים BCR-ABL1-ולהבעת סינתטי, העכברים המשמשים את הניסוי לא לפתח לוקמיה. יתר על כן, עיכוב של c-פוס, DUSP1 על ידי מעכבי מולקולה קטנה נרפא BCR-ABL1-induced CML בעכברים. התוצאות מציגות רמות הביטוי של c-פוס, Dusp1 להגדיר את סף מוות של תאים סרטניים, כזה כי רמות נמוכות יותר להתייעץ סמים רגישות בעוד רמות גבוהות יותר לגרום התנגדות טיפול13.
כדי לזהות את הגנים נהיגה התלות אונקוגן, ביצענו כמה הביטוי הגנום כולו פרופיל ניסויים בנוכחות גורם הגדילה של TKI (imatinib) באמצעות העכבר - והן תאים נגזר חולה CML (K562). נתונים אלה נותחו במקביל עם ערכות נתונים חולה CML המתקבל CD34+ hematopoietic תאי גזע לפני ואחרי הטיפול בעזרת imatinib. ניתוח זה חשף בשלושה גנים (גורם שעתוק [c-פוס], ירידה לפרטים כפול פוספטאז 1 [Dusp1], ולא של RNA-מחייב חלבון [Zfp36]) אשר הם בדרך כלל upregulated תאים עמידים TKI. כדי לאמת את המשמעות של גנים אלו משוחח עמידות לתרופות, אנחנו ביצעו ניתוח במבחנה , ויוו צעד אחר צעד. רמות ביטוי של גנים אלה שאושרו על-ידי qPCR בזמן אמת (RT-qPCR), סופג המערבי תאים עמידים לתרופות. יתר על כן, ביטוי cDNA של נוקאאוט מאת shRNA סיכות של c-פוס, Dusp1, Zfp36 גילה כי c מוגברות-פוס וביטויים Dusp1 הם מספיק והכרחי להיוועץ TKI ההתנגדות. לכן, אנו לבצע אימות ויוו באמצעות העכבר מודלים עם c-פוס Dusp1 בלבד. לשם אימות גנטי של c-פוס, Dusp1, אנו נוצר c-פוסחליל/חליל ROSACreERT-inducible עכברים (מותנה נוקאאוט)14 , חצה אותם עם Dusp1- / - (ישר נוקאאוט)15 כדי להפוך ROSACreERT2-c-פוסחליל/חליל Dusp1- / - העכברים הטרנסגניים-כפול. תאי מח עצם-derived c-Kit+ (מ- c-פוסחליל/חליל-, Dusp1- / --, ו- c-פוסחליל/חלילDusp1- / -) המבטאת BCR-ABL1 היו שנותחה במבחנה המושבה יוצרי assay יחידה (CFU), ו . ב ויוו על ידי השתלת מח עצם בעכברים אולם לקרינה, כדי לבדוק את הדרישה של c-פוס, Dusp1 לבד או יחד בפיתוח לוקמיה. באופן דומה, העכבות כימי של c-פוס DFC (difluorinated כורכומין)16 , Dusp1 על ידי BCI (benzylidene-3-(cyclohexylamino)-2,3-dihydro-1H-inden-1-one)17 נבדקו במבחנה, ויוו באמצעות BCR-ABL1-המבטאת עצם תאי מח-derived c-Kit+ מן העכבר (WT) פראי-סוג. כדי לאשר את הדרישה של c-פוס, Dusp1 בתאי גזע לוקמיה, אנחנו מנוצל דגם העכבר CML איפה BCR-ABL1 היה במיוחד שנגזרות בתאי גזע שלו דוקסיציקלין (ט-transactivator מבטא תחת מאתר תאי לוקמיה (SCL) הגן 3' משפר... תקנה)18,19. השתמשנו מח עצם לין–סרוק+c-Kit+ (LSK) תאים מחלון אלו עכברים ב וזמינותו השתלת ויוו. יתר על כן, הקמנו phopsho-p38 רמות, הביטוי של IL-6 כמו דינמי-טוהר הפרמה קופ סמנים ביולוגיים עבור Dusp1 וניגוד c-פוס, בהתאמה, ויוו. לבסוף, כדי להרחיב את המחקר עבור רלוונטיות האדם, נגזר החולה CD34+ תאים (המקביל בתאי c-Kit+ של עכברים) היו כלפיהן לטווח ארוך במבחנה. מתחילה תרבות תא מבחני (LTCIC) ומודל העכבר humanized ויוו של לוקמיה מיאלואידית כרונית20,21. העכברים immunodeficient הושתלו עם לוקמיה מיאלואידית כרונית CD34 + תאי, ולאחריו הטיפול בתרופה וניתוח של הישרדות cell לוקמיה אנושי.
בפרויקט זה, אנו מפתחים שיטות זיהוי המטרה והאימותים באמצעות כלים גנטיים והן כימית, שימוש במודלים פרה שונה. שיטות אלה ניתן להחיל בהצלחה כדי לאמת את מטרות נוספות לפתח שיטות כימיות לפיתוח טיפולית.

<table><tbody><tr><td><חזק>חומרים ביולוגיים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Cellgro (קורנינג)</td><td>15-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro (קורנינג)</td><td>15-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Cellgro (קורנינג)</td><td>15-016-CVR</td><td></td></tr><tr><td>RetroNectin רקומביננטי שבר פיברונקטין אנושי</td><td>Takara</td><td>T100B</td><td></td></tr><tr><td>MethoCult GF M3434 (מתיל צלולוז לעכבר)</td> <td>תאי גזע</td><td>3434</td><td></td></tr><tr><td>MethoCult H4434 קלאסי (מתיל צלולוז ל-CFU אנושי)</td><td>תאי גזע</td><td>4434</td><td></td></tr><tr><td>4-הידרוקסיטאמוקסיפן</td><td>סיגמא</td><td>H6278</td><td></td></tr><tr><td>עכברים רקומביננטיים SCF</td><td>Prospec</td><td>CYT-275</td><td></td></tr><tr><td>עכברים רקומביננטיים Flt3-Ligand</td><td>Prospec</td><td>CYT-340</td><td></td></tr><tr><td>רקומביננטי עכברים IL-6</td><td>Prospec</td><td>CYT-350</td><td></td></tr><tr><td>עכברים רקומביננטיים IL-7</td><td>Peprotech</td><td>217-17</td><td></td></tr><tr><td>DFC</td><td>LKT Laboratories Inc.</td><td>D3420</td><td></td></tr><tr><td>BCI</td><td>Chemzon Scientific</td><td>NZ-06-195</td><td></td></tr><tr><td>מעבדת</td><td>LC</td><td>I-5508</td><td></td></tr><tr><td>כורכומין</td><td>סיגמא</td><td>458-37-7</td><td></td></tr><tr><td>NDGA</td><td>Sigma</td><td>500-38-9</td><td></td></tr><tr><td>Penn/Strep</td><td>Cellgro (corning)</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>אטלנטה ביולוגי</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין EDTA 1x</td><td>Cellgro (קורנינג)</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Cellgro (קורנינג)</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>Cellgro (קורנינג)</td><td>25-005-CL</td><td>5 מ"ג/מ"ל מלאי במים</td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Gibco (טכנולוגיות חיים)</td><td>A11138-03</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H7006</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4.7H2O</td><td>Sigma</td><td>S9390</td><td></td></tr><tr><td>פרוטאמין סולפט</td><td>Sigma</td><td>P3369</td><td>5 מ"ג/מ"ל מלאי במים</td></tr><tr><td>תמיסת טריפאן כחול (0.4%)</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Cellgro (קורנינג)</td><td>25-950-CQC</td><td></td></tr><tr><td>WST-1</td><td>Roche</td><td>11644807001</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &mu; מסנן דיסק אקרו M</td><td>PALL</td><td>2016-10</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m תאי ניילון Stariner</td><td>Becton Dickinson</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>FICOL (Histopaque 1083) (פוליסוכרוז)</td><td>Simga</td><td>1083</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21040CV</td><td></td></tr><tr><td>LS Columns</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>קוקטייל מעכב פרוטאז</td><td>Roche</td><td>קו-RO</td><td></td></tr><tr><td>קוקטייל מעכב פוספטאז 2</td><td>סיגמא</td><td>P5762</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocullulose Membrane</td><td>Bio-Rad</td><td>1620115</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate ( chemiluminiscence substrate)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>34075</td><td></td></tr><tr><td>CD5</td><td>eBioscience</td><td>13-0051-82</td><td></td></tr><tr><td>CD11b</td><td>eBioscience</td><td>13-0112-75</td><td></td></tr><tr><td>CD45R (B220)</td> <td>BD biosciences</td><td>553092</td><td></td></tr><tr><td>CD45.1-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0453-85</td><td></td></tr><tr><td>CD45.2-PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0454-83</td><td></td></tr><tr><td>hCD45-FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>555482</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Biotin-FITC</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-857&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-7-4</td><td>eBioscience</td><td>MA5-16539</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Gr-1 (Ly-6G/c)</td> <td>eBioscience</td><td>13-5931-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ter-119</td><td>eBioscience</td><td>13-5921-75</td><td></td></tr><tr><td>Ly-6 A/E (Sca1) PE Cy7</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>558612 נגמ"ש CD117&nbsp;</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>553356</tr><tr><td>BD Pharm Lyse</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>555899</tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm (תמיסת קיבוע וחדירה)</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>554714</tr><tr><td>BD סלסול/וושינגטון&nbsp; (תמיסת חדירה ושטיפה לזרימת פוספו)</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>554723</tr><tr><td>פוספו p38</td><td>טכנולוגיות איתות תאים</td><td>4511S</td><td></td></tr><tr><td>סה"כ p38</td><td>טכנולוגיות איתות תאים</td><td>9212</td><td></td></tr><tr><td>בקרת IgG עכבר</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>554121</tr><tr><td>קמח אלכסה 488 מצומד&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A-11034</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלוריד</td><td>Invitrogen</td><td>K278001</td><td></td></tr><tr><td>2x HBS</td><td>Invitrogen</td><td>K278002</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Ambion</td><td>AM9261</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>צינורות נימי דם</td><td>Fisher</td><td>22-260-950</td><td></td></tr><tr><td>צינור איסוף דם</td><td>Giene Bio-One</td><td>450480</td><td></td></tr><tr><td>יילוד עגל סרום</td><td>אטלנטה ביולוגי</td><td>S11295</td><td></td></tr><tr><td>Erythropoiein</td><td>Amgen</td><td>5513-267-10</td><td></td></tr><tr><td>SCF אנושי</td><td>Prospec</td><td>CYT-255</td><td></td></tr><tr><td>אנושי IL-3</td><td>Prospec</td><td>CYT-210</td><td></td></tr><tr><td>G-SCF</td><td>Prospec</td><td>CYT-220</td><td></td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>Prospec</td><td>CYT-221</td><td></td></tr><tr><td>MyeloCult (מדיה לבדיקת LTCIC)</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5100</td><td></td></tr><tr><td>הידרוקורטיזון נתרן המיסוקסינט</td><td>טכנולוגיות תאי גזע</td><td>7904</td><td></td></tr><tr><td>MEM אלפא</td><td>Gibco</td><td>12561-056</td><td></td></tr><tr><td>1/2 סמ"ק Lo-Dose u-100 מזרק אינסולין 28 G1/2</td><td>Becton Dickinson</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>Mortor pestle</td><td>Coor tek&nbsp;</td><td>60316 ו- 60317</td><td></td></tr><tr><td>איזופלורן (איזותזיה TM)</td> <td>באטלר שיין</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>SOC</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>B90920s</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma</td><td>A0166</td><td>100 מ"ג/מ"ל מלאי במים</td></tr><tr><td>בקטו אגר (אגר)</td> <td>Difco</td><td>214050</td><td></td></tr><tr><td>מרק נהדר</td><td>בקטון דיקינסון</td><td>243820</td><td></td></tr><tr><td>אגרוז</td><td>Genemate</td><td>E-3119-500</td><td></td></tr><tr><td>דוקסיציקלין צ'או</td><td>TestDiet.com</td><td>52662</td><td>RMH1500 שונה, ניתן לחיטוי 5LK8&nbsp; עם 0.0625% דוקסיציקלין&nbsp;</td></tr><tr><td>טמוקסיפן</td><td>סיגמא</td><td>T5648</td><td></td></tr><tr><td>יודוניטרוטרזוליום כלוריד&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>I10406</td><td></td></tr><tr><td><ערכות חזקות>ערכות</חזקות></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dneasy ערכת דם ורקמות</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Green (טאק פולימראז עם צבע מטען ירוק)</td><td>Promega</td><td>M1722</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit&nbsp; (ערכת בידוד RNA)</td>ערכת Dnase ללא <td>DNA של Qiagen</td><td>217084</td><td></td></tr><tr><td>(טיפול ב-DNA עבור RT PCR)</td><td>אמביון, Life Technologies</td><td>AM1906</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III סינתזת גדיל ראשון (טרנסקריפטאז הפוך לסינתזת cDNA)</td><td>Invitrogen</td><td>18080051-SYBR</td><td></td></tr><tr><td>Green (תערובת פולימראז טאק עם צבע אינטרצ'לציה ירוק ל-qPCR)</td><td>ערכת MicroBead</td><td>1725270-CD117</td><td></td>Bio-Rad</tr><tr><td></td><td>Miltenyi</td><td>130-091-224</td><td></td></tr><tr><td>תרבית אנושית לטווח ארוך יוזמת בדיקת תאים</td><td>Stemp Cell Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NAPCO series 8000 WJ CO2 incubator</td><td>Thermo scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Swing Bucket rotor cetrifuge 5810R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TC-10 מונה תאים אוטומטי</td><td>Bio-RAD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C-1000 Thermal Cycler</td><td>Bio-RAD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler Real Plex 2</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc Imaging System (מערכת הדמיה לג'לים וכתמים מערביים)</td><td>Bio-RAD</td><td>17001401</td><td></td></tr><tr><td>Hemavet (מונה בולד)</td><td>Drew-Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSR II (FACS analyzer)</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פורטסה I (מנתח FACS)</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSAriaII (סדרן FACS)</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מעמד מגנט</td><td>Miltenyi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Irradiator</td><td>&nbsp;J.L. Shepherd and Associates, San Fernando CA</td><td>Mark I דגם 68A</td><td>מקור Cs 137</td></tr><tr><td><חזק>עכברים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ROSACreERT2</td><td>מעבדת</td><td></td><td></td>ג'קסון</tr><tr><td>Scl-tTA&nbsp;</td><td>ד"ר קלאודיה הוטנר' s lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BoyJ&nbsp;</td><td>מתקן ליבת עכבר ב-CCHMC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57Bl/6&nbsp;</td>מתקן ליבת העכבר NSGS <td>של מעבדת</td><td></td><td></td>ג'קסון</tr><tr><td></td><td>ב-CCHMC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ROSACreERT2/c-Fosfl/fl Dusp1-/-&nbsp;</td><td>תוצרת הבית</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ROSACreERT2/c-Fosfl/fl</td><td>תוצרת הבית</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Cells</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BaF3</td><td>מתנה מג'ורג' דיילי, בית הספר לרפואה של הרווארד, בוסטון</td><td></td><td></td></tr><tr><td>WEHI</td><td>מתנה מג'ורג' דיילי, בית הספר לרפואה של הרווארד, בוסטון</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CML-CD34+ ותאי CD34+ רגילים</td><td>בית החולים האוניברסיטאי, אוניברסיטת סינסינטי</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

שיטות להערכת את התפקיד של c-פוס, dusp1 התלות אונקוגן

Methods for Evaluating the Role of c-Fos and Dusp1 in Oncogene Dependence

ההדגמה של מעכבי טירוזין קינאז (TKIs) בטיפול לוקמיה מיאלואידית כרונית (CML) יש בישרה עידן חדש ותרופות לסרטן. עם זאת, אוכלוסיה קטנה של תאים אינו מגיב לטיפול TKI, והתוצאה היא מחלה שיורית מינימלית (MRD); אפילו הכי חזק TKIs להיכשל כדי למגר תאים אלה. תאים אלה MRD לשמש מאגר לפתח עמידות לטיפול. למה TKI הטיפול אינו יעיל נגד MRD תאים לא ידוע. גורם הגדילה איתות הייתה שם בתמיכה ההישרדות של MRD תאים במהלך הטיפול TKI, אך הבנה מכניסטית לוקה בחסר. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו c מוגברות-פוס ואת הביטוי Dusp1 כתוצאה מתכנסת oncogenic פקטורי גדילה איתות בתאים MRD לתווך TKI ההתנגדות. עיכוב גנטי וכימי של c-פוס, Dusp1 מעבד לוקמיה מיאלואידית כרונית רגישים להפליא TKIs ומרפא CML בשני המודלים העכבר humanized גנטי. זוהו הגנים האלה היעד באמצעות מיקרו-מערכים מרובים TKI רגיש ותאים עמידים. כאן, אנו מספקים שיטות אימות היעד באמצעות העכבר במבחנה ויוו מודלים. שיטות אלה ניתן בקלות ליישם כל מטרה עבור אימות הגנטי ופיתוח טיפולית.

התמכרות אונקוגן היה מעורב יעילות טיפולית של TKIs. עם זאת, מנגנוני נהיגה התלות אונקוגן אינם מובנים. אנו לבצע ניתוחים ביטוי ג'ין לא משוחד מרובים כדי לזהות את הרכיב הגנטי מעורב מנצח ההתמכרות. ניתוחים אלה חשף קולטנים את upregulation של שלושה גנים ג-פוס, Dusp1, Zfp36, בתאי סרטן אשר אינם תלויים איתות oncogenic להישרדות ומהוות, לפיכך, רגישות לטיפול TKI. Downregulation של c-פוס, Dusp1 על ידי נוקאאוט בתיווך shRNA מספיקה לשחזר את הסמים רגישות בשן אחרת TKI עמידים תאים.
<p class="jove_content" fo...

כאן, אנו מתארים את פרוטוקולי האימות גנטי וכימי של c-פוס, Dusp1 כמטרה סמים בלוקמיה באמצעות העכבר גנטי, humanized במבחנה ויוו מודלים. בשיטה זו ניתן ליישם כל מטרה עבור אימות הגנטי ופיתוח טיפולית.

שיטות להערכת את התפקיד של c-פוס, Dusp1 התלות אונקוגן

The demonstration of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in treating chronic myeloid leukemia (CML) has heralded a new era in cancer therapeutics. However, ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומים טיפוליים בסרטן, כגון זיהוי של גנים מרכזיים המעורבים בתלות אונקוגנית. היתרון העיקרי של טכניקה זו היא שהיא מנצלת את התלות אונקוגן כי הוא משותף סרטן מונע קינאז רבים ולכן זה ישים על סוגי גידולים מרובים. למרות שיטה זו יכולה לספק תובנה לוקמיה, זה יכול להיות מיושם גם על מערכות אחרות, כמו גידולים מוצקים כגון סרטן ריאות, גידולים במוח, גידולים בלבלב.בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו ייאבקו בשל חוסר ניסיון בביולוגיה מולקולרית ופיזיולוגיה תאית. כדי להתחיל, לקצור את עצמות הרגל מעכבר המתת דם. נקה את הרקמות מהעצמות עם אזמל.ואז למקם את העצמות PBS קר על קרח למחוץ את העצמות עם עלה. לאחר מכן, לסנן את ההשעיה התא דרך מסננת תא 70 מיקרומטר לתוך צינור כובע בורג 50 מיליליטר עם פיפטה 10 מיליליטר. לשטוף את המרגמה ואת העלי מספר פעמים עם PBS קר ולהוסיף את ההשעיה התא לצינור 50 מיליליטר.הבא צנטריפוגה מח העצם ולהסיר את supernatant עם ואקום פיפטה זכוכית. תן מחדש את גלולת התא ב-5 מיליליטר של פי.בי.אס. באמצעות פיפטה, מוסיפים לאט את מח העצם התלוי לראש טמפרטורת החדר פולי-סוכרוז.לאחר מכן, לסובב את פולי סוכרוז ב 400 Gs במשך 20 דקות עם הבלם כבוי. לאחר צנטריפוגה, לאסוף את ממשק תא מונו גרעיני הכולל מעונן עם פיפטה ולהעביר אותו צינור חדש 15 מיליליטר. הביאו את עוצמת הקול ל-10 מיליל

methods-for-evaluating-role-c-fos-dusp1-oncogene

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

סרטון זה מתאר את הפרוטוקול לאימות גנטי על ידי העברת גני מטרה באמצעות רטרו-וירוסים בשורות תאי לוקמיה מיאלואידית כרונית. הרטרו-וירוסים פועלים כמתווך להעברת חומר גנטי לתא הלוקמיה בתהליך הנקרא טרנסדוקציה, המאפשר ביטוי ארוך טווח של גן המטרה. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על כל תאי המטרה לצורך אימות גנטי ופיתוח טיפולי.

התמרה בתיווך רטרו-ויראלי: שיטה להחדרת גן מטרה לתאים סרטניים

פרוטוקול זה מדגים כיצד ליצור מסומן פלורסנטי, גידולים המשובטים מוגדר גנטית בעין תסיסנית / דיסקים דמותי מחושים (EAD). הוא מתאר כיצד לנתח את EAD והמוח מן הזחלים instar השלישי וכיצד לעבד אותם לחזות ולכמת שינויים בהתבטאות גנים הפולשנות הגידול.

ה<em&gt; תסיסנית</em&gt; דגם גידול דיסק דמותי: ויזואליזציה וכימות של ביטוי גנים סרטניים הפולשנות שימוש פסיפסים גנטי

זיהוי מטרות תרופות חדשות שעוברות מניסויים פרה-קליניים לניסויים בבני אדם הוא בראש סדר העדיפויות המדעי. לשם כך, אנו מתארים כאן גישה גנומית פונקציונלית לבחינת ההשפעה של דלדול גנים על ספרואידים בקו תאים סרטניים, אשר מודלים בצורה מתאימה יותר סרטן אנושי in vivo.

ניצול הקרנת Genomics פונקציונלית כדי לזהות מטרות תרופה חדשנית פוטנציאלי תרבויות אליפטית תא סרטני

ספרייה CRISPR/sgRNA הוחל כדי לחקור חלבונים. עם זאת, הכדאיות של ספרייה sgRNA לחשוף את הפונקציה של גבול CTCF ב הכונה נשאר נחקרו. כאן, אנו מתארים ספרייה ספציפית sgRNA לוקוסים HOX התירי את הפונקציה של גבולות CTCF HOX לוקוסים.

HOX לוקוסים Focused CRISPR/sgRNA ספריית הקרנת זיהוי קריטי CTCF גבולות

תחומים עם הפרעה מהותית חשובים לתפקוד גורם שעתוק היתוך אונקוגני. כדי למקד חלבונים אלה באופן טיפולי, נדרשת הבנה מפורטת יותר של מנגנוני הרגולציה המועסקים על ידי תחומים אלה. כאן, אנו משתמשים בתעתיק כדי למפות תכונות מבניות חשובות של תחום EWS שהופרע באופן מהותי בסרקומה יואינג.

מיפוי קשרי מבנה-פונקציה של גורמי שעתוק אונקוגניים מופרעים באמצעות ניתוח תמלול

מחקר זה מתאר פרוטוקול לבחינת ההשפעות של שינוי pH על ביטוי אונקוגן באמצעות ניתוח RNA-seq של קו תאי צינור הלבלב.

ניתוח ביטוי אונקוגנים עם שינויים ב-pH בקו תאי צינור הלבלב

שביט וזמינותו היא שיטה יעילה לאיתור נזק לדנ א כולל יחיד, כפול גדילי ה-DNA שובר. אנו מתארים שביט אלקליין ונייטרלי מבחני למדוד נזק לדנ א בתאים סרטניים כדי להעריך את השפעת טיפולי כימותרפיה.

הערכת במבחנה נזק לדנ א שימוש Assay שביט

כאן, אנו מציגים דו-ממדית בג'ל (2DE) בשילוב עם ספקטרומטר מסה (MS) להפריד ולזהות פרוטאום רקמת גידול בבלוטת יותרת המוח האנושי, אשר מציג תבנית לשחזור וטוב 2DE. חלבונים רבים שנצפו במקום כל 2DE בעת ניתוח סרטן מורכב פרוטאום עם השימוש של MS רגישות גבוהה.

אלקטרופורזה דו-ממדית בג'ל בשילוב עם שיטות ספקטרומטר מסה על ניתוח של רקמת גידול בבלוטת יותרת המוח האנושי פרוטאום

המטרה שלנו הייתה לפתח פרוטוקול מעשית להערכת תפקוד מיטוכונדריאלי המשויך עייפות אצל חולי סרטן. פרוטוקול זה חדשני ממוטב רגיל רק שימוש קליני מעורבים עם דם ורידי ונהלים מעבדה בסיסית.

הערכת תפקידה של פונקציית מיטוכונדריאלי עייפות הקשורים לסרטן

התהליכים השולטים הפלישה סרטן שלפוחית השתן מייצגים הזדמנויות סמן ופיתוח טיפולית. כאן אנו מציגים מודל הפלישה סרטן שלפוחית השתן אשר משלבת תרבות תלת-ממדי של גידול spheroids, הדמיה בצילום מואץ, מיקרוסקופיה קונפוקלית. טכניקה זו שימושית עבור הגדרת התכונות של תהליך פולשני, הקרנת סוכני טיפולית.

תא תלת-ממדי מערכת תרבות עבור הלומדים הפלישה והערכת הרפוי בסרטן שלפוחית השתן

חקור שיטות לאימות c-Fos ו-Dusp1 כמטרות תרופתיות בלוקמיה באמצעות מודלים גנטיים וכימיים. השיטה מתאימה לסוגי גידולים שונים ומספקת תובנות לתלות אונקוגנית בקרסינומה.

שיטות להערכת את התפקיד של c-פוס, Dusp1 התלות אונקוגן

גלה סרטונים נוספים