פולימראז דיגיטלי Assay תגובת שרשרת עבור הווריאציה גנטי לחולה סדיר פוליפוזיס באמצעות התבנית שבב-ב--שפופרת

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הבדיקות הגנטיות, כגון זיהוי מוזאיקה, ובדיקות גנטיות מבוססות ביופסיה נוזלית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא זיהוי תפוקה גבוהה של שבר אלל בעל משתנה נמוך. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על אבחון גידולים, מכיוון שזיהוי מוטציות אונקוגניות בעלות רגישות גבוהה יכול לתרום לרפואה מדויקת.

התחל את הניסוי הזה על ידי הוספת 10 ליטר של מאגר דגימת DNA לצינורות של רצועה בעלת 8 צינורות. לאחר מכן הוסף 1 מיקרוליטר של סולם DNA לצינור הראשון של רצועת 8 הצינורות, ומיקרוליטר אחד של DNA גנומי דגימה לכל אחד מהצינורות הנותרים. השתמש בחיבור מיקרופלייט כדי לערבב את תכולת רצועת 8 הצינורות על ידי מערבולת למשך דקה אחת.

הנח את הרצועה, קצות הפיפט ומכשיר ג'ל לתוך מכשיר אלקטרופורזה. לחץ על כפתור ההתחלה כדי להתחיל את הריצה. לאחר הריצה המלאה, בדוק את האלקטרופרוגרמה בתצוגה כדי לאשר שהסמן התחתון הכלול במאגר דגימת ה-DNA מוקצה כהלכה על האלקטרופרוגרמה.

אם לא, הקצה ידנית את הסמן במצב האלקטרופרוגרמה של התוכנה. לאחר מכן, במצב האזור של התוכנה, ציין את אזור הגודל של ה-DNA הגנומי כדי לחשב אוטומטית את ריכוז ה-DNA. הוסף פריימרים, בדיקות ו-DNA גנומי שתוכננו בעבר לרצועה חדשה של 8 צינורות כדי להשיג נפח כולל של 15 L.Pipette למעלה ולמטה לערבוב.

הוסף את פלטפורמת הטעינה על השבבים המובנים ברצועת 8 הצינורות הטרייה, ולאחר מכן הנח את רצועת הצינור במטען האוטומטי. ודא שיש מגע בין השבבים לפלטפורמת הטעינה. לאחר מכן, הנח מחוון טעינה בפלטפורמה, והשתמש בפקק כדי להחזיק את המחוון מחוץ למעמיס.

פיפטה 15 ליטר של תערובת ה-PCR ליד קצה המחוון, ולאחר מכן לחץ על לחצן המעמיס כדי להפעיל את המעמיס למשך דקה אחת. הסר את רצועת הצינור מהמעמיס לאחר הריצה, והנח אותה במשפר איטום. דחוף בזהירות את מכסה ההחלקה ואת קצה המכסה העליון.

הפעל את משפר האיטום למשך כשתי דקות. אם האיטום אינו שלם, המצוין על ידי שלולית נוזלים, חזור על הריצה למשך דקה נוספת. הוסף 230 ליטר נוזל איטום לצינורות.

הנח את רצועת הצינור במחזור התרמי, והפעל את ה-PCR כמתואר בפרוטוקול. אם יש התפלגות לא אחידה של מחיצות חיוביות, התאם את הטמפרטורה או את משך ה- PCR. כדי לזהות ולנתח את עוצמת הקרינה של מוצרי ה-PCR, הנח את רצועת הצינור על ג'יג הזיהוי, והוסף 6 מ"ל מים מזוקקים.

הסר את כל בועות האוויר הגלויות באמצעות קצה פיפטה. טען את הג'יג לתוך הגלאי. בתוכנת האיתור, בחר בכרטיסיות פלואורסצנטיות, ניסוי ולאחר מכן דוגמה NTC ולאחר מכן לחץ על לחצן הפעלה כדי להתחיל את ההפעלה.

לאחר הריצה המלאה, אשר את עלילת המיקום, ההיסטוגרמה ותרשים הפיזור הדו-ממדי. כדי לאסוף את מוצר ה-PCR, הסר את נוזל האיטום מהצינור. הוסיפו 100 ליטר של מאגר TE, ומערבלו במרץ במשך 30 שניות.

צנטריפוגה קצרה של הצינורות בצנטריפוגה שולחנית, והמשך כמתואר בפרוטוקול הטקסט כדי לסיים את איסוף תוצר ה-PCR. תרשימי מיקום שנוצרו על ידי PCR דיגיטלי מראים פלואורסצנטיות HEX צהובה הן בחולים והן בדגימות אב, מה שמעיד על נוכחות של וריאנט אלל APC T, אך לא ללא בקרת תבנית. רק DNA גנומי של חולים מכיל וריאנט C, כפי שמוצג על ידי פלואורסצנטיות ירוקה של FAM.

כפי שאושר עוד על ידי תרשימי פיזור, גם המטופל וגם האב חיוביים ל-HEX, או וריאנט T, בעוד שרק המטופל מראה נוכחות של וריאנט C. שבר אלל וריאנט של חולים, או VAF, שחושב על ידי DPCR, היה 13.2% דומה ל-12.7% שהושג על ידי ריצוף הדור הבא. מצד שני, ה-VAFs של הורי החולים והתורמים הבריאים היו פחות מ-0.1%אלקטרופרזיס של מוצרי DPCR שנאספו ומרוכזים מאשרים שגודל המקטע החזוי הוא 123 זוגות בסיסים ב-DNA של המטופלים וההורים. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור על ניקיון הספסל על ידי, למשלample, שימוש ביחידת מסנן מאוורר.