Micropuncture של השטח של באומן בעכברים בהנחייתם של מיקרוסקופיית פוטון 2

טכניקה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח על פיזיולוגיה של נפרונים יחידים, כולל שיעורי הסינון גלומרולרי של חלבונים מערכתיים ומטבוליטים ותרומתם לפיזיולוגיה צינורית. היתרון העיקרי של טכניקת micropuncture זו היא שהיא מאפשרת גישה לחלל של באומן ולנפרון קליפת המוח בכל העכברים. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו כי זה דורש צעדי הכנה שבוצעו כראוי.

לאחר אישור חוסר תגובה קמצוץ בוהן, להחיל משחה על העיניים ולהשתמש בקלטת כדי לשתק את הגרפיים של עכבר בוגר 20 עד 25 גרם. השתמש קרם depilatory כדי להסיר את כל השיער בצד שמאל של החיה, ולהשתמש בטחל כדי לאתר את הכליה השמאלית דרך העור בצד הגבי caudal של הטחול. לעשות חתך 0.5 ס"מ בעור, ואחריו חתך קטן יותר ב peritoneum רק גדול מספיק עבור הכליה להיות דחף דרך.

להדר את הכליה עם לחץ עדין ולה מניחים טופס מייצב כליות polysiloxane סביב הרקמה. מרים את הכליה עם הרווח כך שהמשטח האודם ביותר של הכליה משתרע מעבר למייצב בכמילימטר, ומתקן את הכליה לצורה עם דבק ציאנואקרילאט. הדבק צלחת ראש לטופס המייצב והרכיב את לוחית הראש לסורגי הרכבה על צלחת הבסיס.

לאחר מכן, למלא את הבאר בתמיכה polysiloxane עם פתרון אגרוז אחוז אחד ולהחזיק 10 מילימטר כיסוי להחליק על גבי הטופס עד אגרוז הוא מוצק. לאטום את המכסה להחליק לצלחת הראש עם דבק וליצור טבעת סביב להחליק את הכיסוי עם מלט שיניים. ואז להזריק 100 כדי 150 microliters של FITC-Dextran רטרו במסלול במהירות להעביר את העכבר ואת לוחית קיבעון לשלב מיקרוסקופ שני פוטון.

לאחר התמקדות ידנית על פני הכליה, לעבור למצב שני פוטון שאינו סורק ולחקור את חלון ההדמיה כדי לאתר גלומרולוס היעד כי הוא יותר מ 30 מיקרומטר מתחת להחליק כיסוי ופחות מ 400 מיקרומטרים מן הכמוסה הכליה הצדדית. רשום את המרחק האונכי והאנכי אל גלומרולוס היעד. לאחר מכן הקלט את קואורדינטות הבמה x, y ו- z עבור הגלומרולוס.

לבסוף, להעלות את המוקד האובייקטיבי על מילימטר אחד לתוך עמוד המים מבלי לשנות את קואורדינטות הבמה x ו- y. כונן את קצה פיפטה לתוך עמודת המים והפעיל את העירור DAPI. הזז את הפיפיט בממדי x ו- y עד לנקודה של פלואורסצנטיות מקסימלית של הקצה.

זה יהיה מרכז המטרה. שנה את הגדרת האות x לחלבון פלואורסצנטי אדום והדמי את הפיפסט עם העין כדי לאפשר מרתור מדויק בתצוגת העין. חזור לשני פוטון כדי למצוא את הפיפיאט מתחת לתצוגה החיה של שני פוטונים ולמקם את הקצה בדיוק במרכז התמונה, זהו מיקום הרישום.

לאחר מכן שמרו תמונה של הפיפסה ורשמו את קואורדינטות הבקר של הבמה והמיקרופיגט. הסר את פיפטה מעמוד המים בציר x מבלי להזיז את ציר y ו- z ולהזיז את פיפטה z אל היעד glomerulus z-קואורדינטות ואת קצה הכליה. שים לב לשלב x וחשב את פיפטה x קצה הכליה באמצעות ההיסט מהשלב הרישום x.

הגדל את שלב x כדי להזיז את הבמה לכיוון פיפטה עד קצה הכליה הוא רחוק משמאל למסך, תוך שמירה על גלוי. לקדם במהירות את פיפטה על 100 מיקרומטרים מן פיפטה קצה הכליה X יש רק מחושב. להגדיל את הרווח האדום ולהתחיל לקדם את קצה פיפטה לאט לקצה הכליה תחת הדמיה חיה שני פוטון תוך ניטור היסטוגרמה פיקסל אדום.

כונן פיפטה בציר x לאט אל פיפטה היעד glomerulus x, לפקוח עין על הבמה x. עם ההגעה לגלומרולוס, תעד את המיקום באמצעות מחסנית z. עם פיפטה בעמדה, להגדיר את micropump להזריק 100 nanoliters של perfluorodecalin על פני שתי דקות.

כדי להבטיח את האבהות של פיפטה, ולצמצם את ההתבלבלות מתקע פיפטה במהלך הכניסה. לאחר ארבע עד שש דקות של סינון, להגדיר את micropump כדי לשאפת עד 300 nanoliters בקצב של עד 50 nanoliters לדקה. זה יפה, ליד פני השטח glomerulus מדגים הדמיה חיובית בשל מיקום פני השטח של glomerulus ב 20 מיקרומטר מתחת לקפסולה הכליית.

glomerulus הוא קרוב מדי לפני השטח עבור microinjection עם זאת, כמו פיפטה יפגע להחליק את הכיסוי. גלומרולי אלה ממוקמים בצורה אופטימלית עם הקצוות בצדדים 250 מיקרומטר ימינה ונראה פחות חד בגלל השבירה הנגרמת על ידי עומק 70 מיקרומטר שלהם מן הקפסולה. שני הגורמים הנגישים את הגלומרולי.

בתדמית טיפוסית זו של הזנת כליות, הקרנה בעוצמה ממוצעת מתוך ערימת z עם תצוגות אורתוגונליות חושפת את קצה הפיפטי בתוך החלל של באומן, שימו לב לחפץ הספקטרלי של קצה פיפטה האדום מהפלואורסצנטיות הבהירה ביותר של הנקודות הקוונטיות המסודרות בחלק הקדום של הקצה. כאן, עיבוד נפח מערימת z שנרכשה לאחר מיקום פיפטה בחלל של באומן, מראה את קצה פיפטה בתוך החלל הסמוך לטופ נימי. אם נעשה שימוש בפיפה עם פתח גדול מדי, קפסולת הכליות יכולה להישבר ולגרום לדימום תת-שרירי ולכניסה של הדם ללומן פיפטה.

בשיטה זו, 17 חלבונים, בעיקר בעלי משקל מולקולרי נמוך, זוהו ממינימום של שני פפטידים ייחודיים לכל חלבון. יחד עם שיטה זו, ניתן להשתמש בשיטות אחרות כגון מסקרוסקופיה, מדידות אלקטרודה רגישות ליונים והזרקת נוגדנים פלואורסצנטיים כדי לענות על שאלות לגבי תפקידם של מסיסים זוהרים בפיזיולוגיה צינורית וגלמולרית.