Name: מודל תרביות רקמה של ייצור אסטרוגן Granulosa שור ראשי תאים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 36 s
Description: חקור מודל תרביות תאי גרנולוזה בקר לייצור אסטרוגן באמצעות טכניקת הקפאה. שיטה זו מאפשרת מחקר ביולוגיה רבייה ללא תלות באספקת רקמות טריות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים ורוניקה Schreiter על סיוע טכני מעולה שלה והשינויים מועיל של הקפאה קריוגנית הוקמה טכניקה ותא תרבות המודל. בנוסף, אנחנו רוצה להודות אנדרס Maren, Swanhild Rodewald לסיוע טכני מעולה שלהם בניתוח עוקבות.

הערה: השחלות שור התקבלו מהמשחטה מסחרי. האוסף של תוצרי לוואי מטבחיים אינו דורש אישור מוסרי לפי החוק הגרמני.
1. עובד ההכנות ותנאים
<ol><li>כדי להבטיח עקרות, לבצע כל המדיה, רקמות הכנה, כמו גם כל תרבות לעבוד במעבדה התרבות תאים מיוחדים באמצעות ספסל זרימה שכבתית.</li>
	<li>להכין 1 x buffered פוספט תמיסת מלח (PBS, pH 7.4) בתוספת 100 IU פניצילין, סטרפטומיצין 0.1 מ"ג/מ"ל ו- 0.5 שהוא גוסס µg/µL עבור הובלה של השחלות. הערה: משך הזמן המקסימלי בין קבלת השחלות אנליטית GC הוא 2 ש ח בחודש זה.</li>
</ol>2. בידוד תאי Granulosa שור
<ol><li>
לשטוף את השחלות מספר פעמים ב- PBS 1 x (עם 100 IU פניצילין, סטרפטומיצין 0.1 מ"ג/מ"ל ו 0.5 שהוא גוסס µg/µL) כדי להסיר דם מפני השטח לפני תחילת ההליך בידוד. השתמש גביע, למקם את השחלות בפנים, למלא אותו PBS 1 x ולאחר למחוק את PBS שוב.
	<ol>
<li>חזור על שלב זה כביסה 3-4 x, עד השחלות מנוקים הדם הנותרים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>נגב שחלה אחת באמצעות מגבון מעבדה ספוג עם אלכוהול 70%, כדי למזער את מציג אפשרי.</li>
	<li>עם מזרק 3 מ"ל, עם מחט 18 גרם, תשאף GC מאת ניקב זקיקים קטן-בינוני (< 6 מ מ, נמדד עם סרגל), ואת מאגר הזקיקים נוזל בצינור צנטריפוגה אחד 50 מ ל. הערה: כדי להרטיב את המזרק, לקחת כמות קטנה של PBS 1 x (עם 100 IU פניצילין, סטרפטומיצין 0.1 מ"ג/מ"ל ו 0.5 שהוא גוסס µg/µL). זה עוזר כדי לאסוף כמויות קטנות של נוזל הזקיקים ומונעת התאים נשארים בתוך המזרק.</li>
	<li>לאחר ניקב מספר זקיקים, לשטוף את המזרק ואת המחט עם 1 x PBS לניקוי ביניים.</li>
</ol>3. הקפאה קריוגנית של תאים
<ol><li>
השתמש trypan blue מכתים, לספור את התאים תחת hemocytometer.
	<ol>
<li>כדי לספור את מספר התאים קיימא, הכן צינור עם 1.5 µL של פתרון trypan blue 0.25%. הערה: התאים החיים יישאר וללא רבב בגלל trypan blue יכול רק גישה המכשול תא של תאים מתים, אשר לאחר מכן יופיעו כחול.</li>
		<li>להוסיף µL 15 של התליה תא granulosa הפתרון trypan blue ומערבבים אותם בעדינות.</li>
		<li>מקם את התערובת שתי לשכות hemocytometer. לספור את מספר החיים (למשל, מוכתם) תאים ריבוע גדול אחד לכל תא. הערה: אמנם ניתן לראות כמה תאי דם, הם ניתן לזיהוי על ידי גודלם קטן מאוד.</li>
		<li>לחשב את מספר התאים החיים עם הממוצע של שני ריבועים קאמרית על פי הנחיות כלליות; היחס של תאים חיים יכול להשתנות בין השחלות אך יעלה 60%13.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
לקחת דגימה מן הבריכה תא מבודד טרי granulosa כנקודת התייחסות לצורך ניתוח נוסף.
	<ol>
<li>בהתאם הרוזן תא מבודד GC, להפריש מספר מתאים של תאים כמו דוגמיות RNA, דנ א או חלבון הכנה. הערה: עבור בידוד RNA והערכת עוקבות בביטוי הגן, עונה 1 פרק 105 תאים מספיקים, ואילו אחרים ניתוחים הבאים עשויים לדרוש מספרים שונים, בדרך כלל גבוה יותר תא.</li>
		<li>במקום אחד או כמה aliquots של התאים התייחסות בצינור טריים, centrifuge זה עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר, המהירות המרבית (12,000 x g) כדי להשיג גלולה התא. למחוק את תגובת שיקוע.</li>
		<li>מיד הלם-הקפאת הדגימות של חנקן נוזלי. חנות הדוגמה ב-80 מעלות צלזיוס.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
לבצע את הקפאה קריוגנית כדלקמן.
	<ol>
<li>להכין את המדיום הקפאה באמצעות נסיוב עגל העובר 80% (FCS) ו- 20% דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד).</li>
		<li>על מנת בעדינות הצניפה GC, centrifuge GC למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר, x 500 g.</li>
		<li>הסר את תגובת שיקוע בזהירות, בעדינות resuspend התאים ב- FCS 100% (למשל, 1 מ"ל) עד פלאפון יותר גושים גלויים.</li>
		<li>להוסיף 1 נפח (למשל, 1 מ"ל) של המדיום קפוא מוכן התליה תא ולהעביר את התערובת ל בקבוקון ההקפאה. הערה: הריכוז הסופי של התקשורת הגנה על הקפאה יהיה דימתיל סולפוקסיד FCS ו-10%-90%.</li>
		<li>הכנס את המבחנה קריוגני מיכל הקפאה (זמינים מסחרית) מיוחדים, שמונעת הקפאה מהירה. קצב הקירור הדגימות לא יעלה-1 ° C/הגבלת העברת המכולה מקפיא בפריזר-80 מעלות צלזיוס במשך לפחות 4 שעות.</li>
		<li>לאחסון ארוך יותר, מקם את הבקבוקונים קריוגני במיכלים טמפרטורה נמוכה במיוחד (למשל, מיכלי חנקן נוזלי שלב). הערה: הפרוטוקול ניתן לעצור כאן, כמו הקפאה קריוגנית מאפשר אחסון ארוך יותר.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. הכנה של תקשורת, תרבות צלחות התרבות התא
<ol><li>
המעיל תא תרבות צלחות עם קולגן 0.02% R. הערה: קולגן R ידוע חיונית בשביל להודעת משופרת של GC בתרבות.<ol>
<li>להכין פתרון 0.02% R קולגן עם מים מורתחים מתאים תרבית תאים.</li>
		<li>להוסיף 150 µL לכל טוב לתוך צלחת 24-טוב (= 2 ס מ2/טוב) ולוודא כי פני התרבות טוב מכוסה עם הפתרון קולגן R.</li>
		<li>תן פתרון יבש עם מכסה פתוח לכמה שעות או למשך הלילה בשכונה זרימה שכבתית.</li>
		<li>כאשר הלוחות תרבות יבש לחלוטין, להאיר אותם באור UV למשך 10-15 דקות למזער את הזיהום.</li>
		<li>במידת הצורך, לאחסן את הצלחות ב 4 ° C עד 2 חודשים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להכין מדיה ותוספי עבור תרבות העבודה במסגרת תא למינארי. להחלמה מוצלחת של GC, יש להם יעובדו מיד לאחר מפשיר.</li>
	<li>
להכין את המדיה הבאים.
	<ol>
<li>תוספת בינוני חיוני α-מינימלי (α-מ) עם 2 מ מגלוטמין 0.084% סודיום ביקרבונט, 0.1% אלבומין שור (BSA), 20 מ מ HEPES, 4 ננוגרם למ"ל סודיום סלניט, 5 transferrin µg/mL, 10 ננוגרם למ"ל אינסולין, חומצות אמינו שאינן הכרחיות 1 מ מ.</li>
		<li>בנוסף, להוסיף סטרפטומיצין פניצילין ו- 0.1 מ"ג/מ"ל 100 IU למדיה. הערה: האנטיביוטיקה, פעם להתחמם, יציבים עבור-48 שעות. לכן, aliquot הכמות הרצויה של המדיה עבור הסידור תרבות ומדיה המתוכנן להחליף. לחמם רק את המדיה aliquots עד 37 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים. ניתן לאחסן את המדיה מוכן ב 4 ° C לא יותר מ- 3 חודשים.</li>
		<li>כדי לגרום לפעילות סטרואידים הם אורגניים GC שור, תוספת של α-מ בנוסף עם 20 ng/mL הורמון מגרה זקיק (FSH), 50 ng/mL R3 IGF-1 ו- 2 מיקרומטר androstenedione. הערה: תמיד תוספת רכיבים אלה זמן קצר לפני תחילתה של החלפת תרבות או מדיה. הימנע חוזרות מחזורים ההקפאה-הפשרה לפתרונות מניות FSH ו- IGF-1, כמו זה מסכן את הפעילות סטרואידים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. תא תרבות עבודה
<ol><li>להפשיר את התאים במהירות בתוך אמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 3-4 דקות, להעביר התליה תא מראש ומחוממת 37 ° C α-מ (ללא תוספת הורמון). צנטריפוגה, מומלץ נפח סופי של 10 מ"ל.</li>
	<li>Centrifuge GC למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר ולא ב 500 x g. למחוק את תגובת שיקוע. להוסיף מראש ומחוממת, שהושלם α-מ, resuspend את התאים בזהירות.</li>
	<li>זרעי GC-צפיפות של עונה 1 פרק 105 או עונה 1 פרק 106 תאים לכל טוב נפח סופי של 500 µL. כוללים משכפל טכני לפחות שלוש בארות תרבות לכל תנאי.</li>
	<li>דגירה התרבות תאים בתוך אינקובטור ב 37 ° C עם 5% CO2 עבור 8 קבוצו.</li>
	<li>לבצע החלפת מדיה בכל יום אחר. להחליף רק שני שלישים של תרבות המדיה כדי להפחית את הלחץ וכדי להקל את העיבוד של התאים למדיה טריים. הערה: GC יוצרים פנוטיפ פיברובלסט דמוי אופייני אחרי כמה ימים בתרבות, נוטים אשכול ביחד. בתרבות תא-צפיפות גבוהה, אשכולות גדולים נמצאים בתדירות גבוהה יותר לעומת התרבות נורמלי צפיפות GC (איור 1, שמאל לעומת לוח נכון).</li>
</ol>6. לא חשפה Granulosa בתרבית תאים
<ol><li>כדי לבצע ניתוח הורמונים סטרואידים, לאסוף את המדיה תקפיא את זה ב-20 ° C. השתמש שיטות המתאימות כדי לנתח את הריכוז אסטרדיול ופרוגסטרון ב בילה מדיה [למשל, רדיו אימונולוגי (RIA)]14.</li>
	<li>לניתוח עוקבות של מולקולות יעד אחר (RNA, DNA, חלבונים, וכו '), lyse התאים ישירות לתוך המנה תרבות עם סוכן lysing המתאים כפי שהומלץ על ידי הספק. הערה: עבור רוב ההליכים בידוד, אפשרי לעצור את הפרוטוקול פה, כמו התאים lysed שניתן לאחסן ב-20 ° C עד 1 לשבוע. לאחסון ארוך יותר, יש לשמור את התאים ב- 80 ° c</li>
	<li>כדי לקבוע את השפע התעתיק, לסנתז cDNA ומדידת תעתיקים ספציפיים על-ידי טכניקות כמותיות פולימראז בזמן אמת תגובת שרשרת (qPCR)15. הערכה סטטיסטית צריך לכלול לפחות שלושה שכפולי של תרביות תאים שונים, שמקורם תאים שונים ההכנות (משכפל ביולוגי).</li>
</ol>

<ol><li>Gutierrez, C. G., Ralph, J. H., Telfer, E. E., Wilmut, I., Webb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+antrum+formation+of+bovine+preantral+follicles+in+long-term+culture+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Growth and antrum formation of bovine preantral follicles in long-term culture in vitro.</a> Biology of Reproduction. 62 (5), 1322-1328 (2000).</li>
<li>Cortvrindt, R., Hu, Y., Smitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+luteinizing+hormone+as+a+survival+and+differentiation+factor+increases+oocyte+maturation+in+recombinant+follicle+stimulating+hormone-supplemented+mouse+preantral+follicle+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Recombinant luteinizing hormone as a survival and differentiation factor increases oocyte maturation in recombinant follicle stimulating hormone-supplemented mouse preantral follicle culture.</a> Human Reproduction. 13 (5), 1292-1302 (1998).</li>
<li>Paes, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+heat+stress+on+the+survival+and+development+of+in+vitro+cultured+bovine+preantral+follicles+and+on+in+vitro+maturation+of+cumulus-oocyte+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Effect of heat stress on the survival and development of in vitro cultured bovine preantral follicles and on in vitro maturation of cumulus-oocyte complex.</a> Theriogenology. 86 (4), 994-1003 (2016).</li>
<li>Christenson, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+resource%3A+preovulatory+LH+surge+effects+on+follicular+theca+and+granulosa+transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Research resource: preovulatory LH surge effects on follicular theca and granulosa transcriptomes.</a> Molecular Endocrinology. 27 (7), 1153-1171 (2013).</li>
<li>Havelock, J. C., Rainey, W. E., Carr, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+granulosa+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Ovarian granulosa cell lines.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 228 (1-2), 67-78 (2004).</li>
<li>Bernath, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+AMP+inhibits+fibronectin+gene+expression+in+a+newly+developed+granulosa+cell+line+by+a+mechanism+that+suppresses+cAMP-responsive+element-dependent+transcriptional+activation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cyclic AMP inhibits fibronectin gene expression in a newly developed granulosa cell line by a mechanism that suppresses cAMP-responsive element-dependent transcriptional activation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 265 (30), 18219-18226 (1990).</li>
<li>Lerner, A. A., Salamone, D. F., Chiappe, M. E., Baranao, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+studies+between+freshly+isolated+and+spontaneously+immortalized+bovine+granulosa+cells%3A+protein+secretion%2C+steroid+metabolism%2C+and+responsiveness+to+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Comparative studies between freshly isolated and spontaneously immortalized bovine granulosa cells: protein secretion, steroid metabolism, and responsiveness to growth factors.</a> Journal of Cellular Physiology. 164 (2), 395-403 (1995).</li>
<li>Gutierrez, C. G., Campbell, B. K., Webb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+long-term+bovine+granulosa+cell+culture+system%3A+induction+and+maintenance+of+estradiol+production%2C+response+to+follicle-+stimulating+hormone%2C+and+morphological+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Development of a long-term bovine granulosa cell culture system: induction and maintenance of estradiol production, response to follicle- stimulating hormone, and morphological characteristics.</a> Biology of Reproduction. 56 (3), 608-616 (1997).</li>
<li>Campbell, B. K., Scaramuzzi, R. J., Webb, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+maintenance+of+oestradiol+and+immunoreactive+inhibin+production+with+FSH+by+ovine+granulosa+cells+cultured+in+serum-free+media%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Reproduction+and+Fertility%22%5BJournal%5D)">Induction and maintenance of oestradiol and immunoreactive inhibin production with FSH by ovine granulosa cells cultured in serum-free media.</a> Journal of Reproduction and Fertility. 106 (1), 7-16 (1996).</li>
<li>Hillier, S. G., Whitelaw, P. F., Smyth, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+Oestrogen+Synthesis+-+The+Two-Cell%2C+Two-+Gonadotrophin+Model+Revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Follicular Oestrogen Synthesis - The Two-Cell, Two- Gonadotrophin Model Revisited.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 100, 51-54 (1994).</li>
<li>Silva, J. M., Price, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+follicle-stimulating+hormone+on+steroid+secretion+and+messenger+ribonucleic+acids+encoding+cytochromes+P450+aromatase+and+cholesterol+side-chain+cleavage+in+bovine+granulosa+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Effect of follicle-stimulating hormone on steroid secretion and messenger ribonucleic acids encoding cytochromes P450 aromatase and cholesterol side-chain cleavage in bovine granulosa cells in vitro.</a> Biology of Reproduction. 62 (1), 186-191 (2000).</li>
<li>Portela, V. M., Zamberlam, G., Price, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+plating+density+alters+the+ratio+of+estrogenic+to+progestagenic+enzyme+gene+expression+in+cultured+granulosa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Cell plating density alters the ratio of estrogenic to progestagenic enzyme gene expression in cultured granulosa cells.</a> Fertility and Sterility. 93 (6), 2050-2055 (2010).</li>
<li>Baufeld, A., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+cell+plating+density+mimics+an+early+post-LH+stage+in+cultured+bovine+granulosa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Increasing cell plating density mimics an early post-LH stage in cultured bovine granulosa cells.</a> Cell and Tissue Research. 354, 869-880 (2013).</li>
<li>Schneider, F., Brüssow, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+preovulatory+administered+depot+gonadotrophin-releasing+hormone+agonist+on+reproductive+hormone+levels+and+pregnancy+outcome+in+gilts%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%2C+Fertility+and+Development%22%5BJournal%5D)">Effects of a preovulatory administered depot gonadotrophin-releasing hormone agonist on reproductive hormone levels and pregnancy outcome in gilts.</a> Reproduction, Fertility and Development. 18 (8), 857-866 (2006).</li>
<li>Baufeld, A., Koczan, D., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+altered+gene+expression+profiles+in+cultured+bovine+granulosa+cells+at+high+cell+density%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Biology+and+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Induction of altered gene expression profiles in cultured bovine granulosa cells at high cell density.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 15 (1), (2017).</li>
<li>Baufeld, A., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactate+promotes+specific+differentiation+in+bovine+granulosa+cells+depending+on+lactate+uptake+thus+mimicking+an+early+post-LH+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Biology+and+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Lactate promotes specific differentiation in bovine granulosa cells depending on lactate uptake thus mimicking an early post-LH stage.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 15(2018).</li>
<li>Yenuganti, V. R., Vanselow, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultured+bovine+granulosa+cells+rapidly+lose+important+features+of+their+identity+and+functionality+but+partially+recover+under+long-term+culture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Cultured bovine granulosa cells rapidly lose important features of their identity and functionality but partially recover under long-term culture conditions.</a> Cell and Tissue Research. 368 (2), 397-403 (2017).</li>
<li>Hamel, M., Vanselow, J., Nicola, E. S., Price, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Androstenedione+Increases+Cytochrome+P450+Aromatase+Messenger+Ribonucleic+Acid+Transcripts+in+Non-Luteinizing+Bovine+Granulosa+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">Androstenedione Increases Cytochrome P450 Aromatase Messenger Ribonucleic Acid Transcripts in Non-Luteinizing Bovine Granulosa Cells.</a> Molecular Reproduction and Development. 70, 175-183 (2005).</li>
<li>Gilbert, I., Robert, C., Dieleman, S., Blondin, P., Sirard, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+effect+of+the+LH+surge+in+bovine+granulosa+cells+during+the+peri-ovulation+period%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Transcriptional effect of the LH surge in bovine granulosa cells during the peri-ovulation period.</a> Reproduction. 141 (2), 193-205 (2011).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

המודל התרבות התא שהוצגו מספקת כלי לניתוח granulosa תא בידול חוץ גופית בתוך. מספר מחקרים הראו כי הטיפוח-תרגול ללא סרום הוא תנאי הכרחי לשמירה על פעילות סטרואידים הם אורגניים GC שור או GC של מינים אחרים,8,9. בנוסף, ציפוי המנה תרבות עם רכיבים של מטריצה חוץ-תאית (למשל, קולגן R)13, שיפור ההחזקה של התאים באופן משמעותי. תכונה חשובה נוספת היא תקופת תרבות ממושך. . לאחרונה, זה הוכח כי תרבות לטווח ארוך יש צורך לקבל ביטוי מאוזן של granulosa תא זהות סמני17ופעילות שחלת בקר מספקת. נראה כי GC דורשים את הזמן כדי להתאושש מן הלחץ הפיזי במהלך ההליך בידוד.
תוספי מדיה FSH, IGF-1 ו androstenedione ידועים לזירוז פעילות ארומטאז תרבותי GC. במיוחד, תוספי עם androstenedione הכרחי לחלוטין, כמו GC הצורך הקדמה אסטרדיול סינתזה. זה כבר פורסם בעבר11,18 ו, לכן, לא עוד יותר נחקר במהלך המחקר הנוכחי. עם זאת, עיבוד של FSH, IGF-1, ובתמצית androstenedione ייתכן שיהיה צורך אחרים set-ups ניסיוני.
הקפאה קריוגנית בטכניקה המתוארת כאן יכול לעזור לשפר את הארגון של תרביות רקמה ניסויים על ידי הפיכתם עצמאית יותר מן ההיצע בדרגות שונות עם השחלות. על פי בדיקות קודמות, הקפאה קריוגנית אינה משפיעה על פנוטיפ GC או ייצור הסטרואידים בתרבות. כמו כן, השפע של סמן תעתיקים בתאים בתרבית לא חשפו הבדלים משמעותיים השוואת דוגמיות מקריסטלים של תאים בודדים טרי עם אלה נתון בעבר הקפאה קריוגנית16.
פרמטר קריטי עבור המודל הנוכחי של תרבות GC הוא התא יופיצ צפיפות. כפי שמוצג על ידי נציג תוצאות, הגדלת הצפיפות ציפוי המושרה שינויים יוצא דופן של מאפיינים פיזיולוגיים ומולקולרית. מספר גנים מוסדרים באופן ספציפי, הדומה השינויים הם המושרה על ידי גירוי LH ויוו4,19. העובדה כי צפיפות גדל והולך התא יכול לנהוג דמוי-התמיינות תהליכים ב- GC שור בתרבית צריך להיחשב בקפידה במודל זה GC במבחנה כדי למנוע תוצאות סותרות בין משכפל. לכן, תוצאות סותרות עם מחקרים אחרים ייתכן ולשייך צפיפויות תאים שונים, יש לבחון מקרוב יותר.
המודל התרבות המתואר כאן מתגלה כי שאינם מגיבים LH, כמו התמלילים של הקולטן LHCGR נמצאים בקרבת הגבול זיהוי. לפיכך, סימולציה של גל LH כאחד המצב ויוו נכשל לזירוז בידול13. בכל זאת, מודל זה מספק כלי שימושי ללמוד GC אסטרדיול-פעיל בתרבות העיקרי, בפרט כמו לא פונקציונלי-שור GC שורות קיימות כיום.
פרוטוקולי טיפול שונה יכול להיבדק במודל תרבות נוכח GC לעזור לפענח את מנגנוני הרגולציה של ייצור סטרואידים או בידול GC. גורמים נוספים, אחד המעורבים בתהליכים התפתחותיים יכול להיות מנותח בנפרד. לכן, מודל זה תרבות מספק בסיס עבור יישומים שונים רבים.

ביוץ מוצלחת ואת luteinization תלוי שינויים מולקולריים דק מכוון, מתוזמר היטב סוגי התאים הזקיקים סומאטית. מאז פרטים של תהליכים התפתחותיים אלה אינם עדיין לגמרי מובנים, עוד יותר להבהרה נדרש. In vivo גישות משוכללות ויקרות, בפרט, להיכשל כתובת המנגנונים המולקולריים ספציפיות המתרחשות במהלך folliculogenesis. לכן, מודלים reductionistic במבחנה נדרשים בנוסף, כדי לספק תובנות פרטים תאית ומולקולרית. מחקרים שונים מתארים את התרבות של כל זקיקי בהקשר של במבחנה הפריה טכניקות1,2,3. כי החוקרים מעוניינים מנגנונים של בידול, מחקרים רבים מתמקדים GC הזקיקים. תאים אלה, הקשורים ישירות oocyte, הם המקורות העיקריים של ייצור אסטרוגן, לכן, תפקיד חיוני בכל רחבי folliculogenesis ו- luteinization4.
מונצחים תא שורות של GC פותחו זנים שונים. עם זאת, רובם, אינם מראים ייצור הורמונים סטרואידים מספיקות5. עד כה, תא אחד בלבד שורה של שור ש-GC כבר הקים6, אך הקו הזה איבד את פעילותה שחלת בקר לאחר קטעים מספר7. לכן, מאז steroidogenesis, ובעיקר, אסטרדיול הפקה היא תכונה חיונית הפונקציונליות GC, מומלץ ללמוד היבטים אלה במודלים התרבות התא הראשי. במחקרים קודמים, הוכח כי הפקה אסטרדיול ניכר יכול רק להיות שנצפו תחת תרבות סרום ללא תנאים8,9. בהמשך, תוספת של הסימן המקדים של אסטרדיול סינתזה היא תנאי הכרחי נוסף, כפי GC להיכשל להביע את האנזים הנחוץ ניתן להמיר androstenedione10פרוגסטרון. בנוסף, אפקט סינרגיסטי של FSH ו- IGF-1 תוספי במבחנה חשף פעילות אופטימיזציה של ארומטאז, האנזים מפתח של אסטרדיול סינתזה11. בפרוטוקול הנוכחי, מתוארים גם גורמים חשובים אחרים, שיש להם השפעה משמעותית על המודל התרבות GC. בפרט, התא יופיצ צפיפות יש השפעות עצומה על התוצאה של ניסוי12. יתר על כן, יכול להקים טכניקה הקפאה קריוגנית של GC שור זה אינם מתערבים באופן משמעותי GC פיזיולוגיה בתרבות. טכניקה זו מסייעת לשפר את הארגון של התא תרבות עבודה כדי למטב את הצפיפות ציפוי המועדפת.

<table><tbody><tr><td>PBS Instamed w/o Ca2+, Mg2+</td><td>Merck-Millipore</td><td>L 182-05</td><td>נרכש במקור ב-Biochrom AG שהיא כיום חלק מחברת Merck-Millipore; ה-Cat.-No של Biochrom עדיין קיים</td></tr><tr><td>פניצילין / סטרפטומיצין (10,000 IU / 10,000 ומיקרו; גרם/מ"ל)</td><td>Merck-Millipore</td><td>A 2213</td><td>שנרכש במקור ב-Biochrom AG וכיום הוא חלק מחברת Merck-Millipore; ה-Cat.-No של Biochrom עדיין קיים</td></tr><tr><td>אמפוטריצין (250 ומיקרו; גרם/מ"ל)</td><td>Merck-Millipore</td><td>A 2612</td><td>נרכש במקור ב-Biochrom AG וכיום הוא חלק מחברת Merck-Millipore; ה-Cat.-No של Biochrom עדיין קיים</td></tr><tr><td>מזרק 3 מ"ל (Omnifix Luer)</td><td>Braun</td><td>4616025V</td><td></td></tr><tr><td>18 G מחט</td><td>Roth</td><td>C724.1</td><td></td></tr><tr><td>סרום עגל עוברי</td><td>Merck-Millipore</td><td>S 0115</td><td>נרכשה במקור ב-Biochrom AG שהיא כיום חלק מחברת Merck-Millipore; ה-Cat.-No של Biochrom עדיין קיים</td></tr><tr><td>בקבוקונים לשימור הקפאה (2 מ"ל)</td><td>TPP Faust</td><td>TPP 89020</td><td></td></tr><tr><td>CoolCell LX מיכל הקפאת תאים</td><td>צלחת תרבית 432004</td><td></td><td></td>קורנינג</tr>, <tr><td>24 בארות, תחתית שטוחה</td><td>TPP Faust</td><td>TPP 92424</td><td></td></tr><tr><td>קולגן R (0.2%)</td><td>Serva</td><td>47254</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-MEM</td><td>Merck-Millipore</td><td>F 0915</td><td>נרכשה במקור ב-Biochrom AG שהיא כיום חלק מחברת Merck-Millipore; ה-Cat.-No של Biochrom עדיין קיים</td></tr><tr><td>L-Glutamin (200 מ"מ)</td><td>Merck-Millipore</td><td>K 0282</td><td>שנרכש במקור ב-Biochrom AG שהיא כיום חלק מחברת Merck-Millipore; ה-Cat.-No של Biochrom עדיין קיים</td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט</td><td>Merck-Millipore</td><td>L 1713</td><td>שנרכש במקור ב-Biochrom AG שהיא כיום חלק מחברת Merck-Millipore; ה-Cat.-No של Biochrom עדיין קיים</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A3311</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Merck-Millipore</td><td>L 1603</td><td>נרכש במקור ב-Biochrom AG שהיא כיום חלק מחברת Merck-Millipore; ה-Cat.-No של Biochrom עדיין קיים</td></tr><tr><td>נתרן סלניט</td><td>Sigma</td><td>S9133</td><td>מומס במעביר מים סטרילי</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>T1283</td><td>מומס באינסולין מים סטרילי</td></tr><tr><td>(10 מ"ג/מ"ל)</td><td>Sigma</td><td>I0516</td><td>מומס ב-1x PBS</td></tr><tr><td>NEA</td><td>Merck-Millipore</td><td>K 0293</td><td>נרכש במקור ב-Biochrom AG שהיא כעת חלק מחברת Merck-Millipore; ה-Cat.-No של Biochrom עדיין קיים</td></tr><tr><td>FSH</td><td>Sigma</td><td>F4021</td><td>אנו מעדיפים להשתמש בתמיסת מלאי של 2 ומיקרו; גרם/מ"ל, מדולל ב-0.9% NaCl</td></tr><tr><td>LR3-IGF-1</td><td>Sigma</td><td>I1146</td><td>אנו משתמשים בתמיסת מלאי של 2 ומיקרו; גרם/מ"ל, מומס ב-10 מ"מ HCl ו-1x PBS עם 1 מ"ג/מ"ל BSA</td></tr><tr><td>אנדרוסטנדיון</td><td>סיגמא</td><td>46033</td><td>אנו משתמשים בתמיסת מלאי של 10 מ"מ, מדוללת ב-100% אתנול</td></tr></tbody></table>

מודל תרביות רקמה של ייצור אסטרוגן granulosa שור ראשי תאים

A Tissue Culture Model of Estrogen-producing Primary Bovine Granulosa Cells

תאים granulosa השחלות (GC) הם המקור העיקרי של אסטרדיול סינתזה. המושרה על ידי גל הורמון מחלמן preovulatory (LH), תאי theca את, בפרט, granulosa תא השכבה עמוקות לשנות מאפיינים מורפולוגיים, הפיזיולוגית המולקולרי שלהם ויוצרים הקורפוס ייצור פרוגסטרון התשובה כי הוא אחראי על שמירת הריון. תא תרבות הן כלי חיוני ללמוד את מנגנוני הרגולציה כבסיס מעורב הטרנספורמציה folliculo-luteal. פרוטוקול הציג מתמקד הליך הבידוד של הקפאה קריוגנית של שור GC של זקיקים קטן-בינוני (< 6 מ מ). בטכניקה זו, ניתן להשיג אוכלוסיה טהור של GC. ההליך הקפאה קריוגנית מאוד מקל זמן ניהול של התרבות תאים לעבודה עצמאית של היצע רקמות (השחלות) ישיר הראשי. פרוטוקול זה מתאר תרבות ללא סרום תא מודל המחקה את מצב פעיל אסטרדיול GC שור. תנאים חשובים כי הם חיוניים עבור תרבות מוצלח תא סטרואידים-פעילה הם דנו לאורך כל הפרוטוקול. הוכח כי הגדלת הצפיפות ציפוי של התאים גורם לתגובה ספציפית כמצוין על-ידי פרופיל ביטוי וייצור הורמונים ג'ין שינו. יתר על כן, מודל זה מספק בסיס ללימודי ב- GC בידול ויישומים אחרים.

GC מצופה-עונה 1 פרק 105 תאים/טוב התצוגה מראה דמוי פיברובלסט אופייני כפי שהם יוצרים סיומת תא להשוות fibroblasts נוטים לבנות אשכולות (איור 1a וג 1). הגדלת צפיפות ציפוי על ידי 10-fold עונה 1 פרק 106 תאים/טוב לא שינתה את המורפולוגיה אבל יכול להיות שנצפו אשכולות תאים נוספים (איור 1b ו- 1 י, חצים). כפי שמוצג כבר בפרסום הקודם, הציפוי קולגן של מאכלים תרבות השתפר במידה רבה ההחזקה של תאים13.
הקפאה קריוגנית הראשונית לא השתנה במידה ניכרת מאפיינים פיזיולוגיים של תאים בתרבות לעומת הילדים ישירות תרבותי מדגימות טרי מבודד. זה מוצג באיור 2 שפע תעתיק (נמדד על-ידי qPCR) של סמן מספר גנים לא שונות בעת השוואה בין תאים בתרבית נגזר בריכות קפוא או טרי מבודד.
איור 3 מראה תוצאות נציג של ניתוח הורמונים סטרואידים (נמדד על ידי ריאה) ב- GC שור תרבותי-נורמלי לעומת צפיפות גבוהה. ריכוז אסטרדיול יופחתו במידה משמעותית בתרבות בצפיפות גבוהה לעומת התרבות רגיל-צפיפות, ואילו ייצור פרוגסטרון נוטה להיות גבוה יותר.
ניתוח השוואתי של מספר גנים (נמדד על-ידי qPCR) בתרבויות גבוהה לעומת רגיל-צפיפות חשף אפקט משמעותי (איור 4). CYP19A1, קידוד האנזים מפתח של אסטרדיול ביוסינטזה ארומטאז, כמו גם את הקולטן גונדוטרופין FSHR, היו באופן משמעותי למטה מוסדר. לעומת זאת, הגנים RGS2 ו- VNN2 הראו משמעותי למעלה-תקנה. תוצאות אלו מראים בבירור כי תהליכים ספציפיים של התמיינות הם המושרה על ידי הגדלת תא יופיצ צפיפות.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig1.jpg"> איור 1: תרבותי תאים granulosa שור על רגיל (לוחות שמאלה) וצפיפות גבוהה התא (נכון פאנלים). ( ג) ותאי תרבותי-צפיפות של תאים 1 x 10 5/באר מוצגת הפנוטיפ פיברובלסט דמוי טיפוסי. (b ו- d) GC תרבותי-צפיפות גבוהה ציפוי (1 x 106 תאים/טוב) נטו כדי ליצור תאים גדולים אשכולות (חיצים) בתדירות גבוהה יותר לעומת התאים תחת צפיפות נורמלי (החלונית הימנית). גודל ברים = 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig2.jpg"> איור 2: השוואה של תאים תרבותי ישירות לאחר בידוד, לאחר הקפאה קריוגנית. התאים היו תרבותי-צפיפות של תאים5 עונה 1 פרק 10 לכל טוב. בביטוי הגן של הפרוטוקולים סמן מספר הוערך וגילה אין הבדל בין תאים בתרבית עם או בלי הקפאה קריוגנית הראשונית. Boxplot מראה את החציון של n = 3. דו-זנבית של סטודנט t-לבדוק, p-ערכים הינם כלולים. איור זה מתרבה מ Baufeld ו- Vanselow16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig3.jpg"> איור 3: ריכוז הורמונים סטרואידים בתאים granulosa תרבותי-ציפוי שונים צפיפויות. ריכוז אסטרדיול (E2) ירדה משמעותית כאשר GC היו תרבותי-צפיפות גבוהה תא, ואילו ריכוז הפרוגסטרון (P4) רק נוטה להיות גבוה יותר. ריכוז ההורמון תוקנה עבור התוכן דנ א לנרמל למספרים תאים שונים. מתכוונת ואת SEM של n = 3 מוצגים. 0.05 &gt; p , דו-זנבית של סטודנט t-מבחן. איור זה מתרבה מ. Baufeld et al. 15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58208/58208fig4.jpg"> איור 4: שפע של הפרוטוקולים מפתח פונקציונלי בתאים granulosa תרבותי-נורמלי לעומת צפיפות גבוהה יופיצ. GC שור תרבותי בתנאים ללא סרום עבור 8 קבוצו חשף תקנה ספציפית של מספר גנים סמן שנבחרו. Boxplot מציגה את החציון של n = 3 משכפל בודדים. p &lt; 0.05, דו-זנבית של סטודנט t-מבחן. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58208/58208fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

מודל התרבות ארוכת טווח של תאים granulosa שור בתנאים ללא סרום מתואר. מודל זה מאפשר לחוקרים לחקור את ההשפעות של גורמים שונים ותנאים כמו ציפוי שונים צפיפויות על המאפיינים של ייצור אסטרוגן בתאי granulosa שור.

מודל תרביות רקמה של ייצור אסטרוגן Granulosa שור ראשי תאים

Ovarian granulosa cells (GC) are the major source of estradiol synthesis. Induced by the preovulatory luteinizing hormone (LH) surge, cells of the theca ...

מודל תרבית תאים זה מאפשר לנו לחקור מאפיינים של תאי גרנולוזה בקר המייצרים אסטרדיול במבחנה כגון גורמים או מצבים של בלוטת התריס. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא טכניקת השימור בהקפאה שגורמת לתרבית תאים לעבוד ללא תלות באספקת רקמות ישירה. ההליך יודגם על ידי ורוניקה שרייטר, טכנאית במעבדה שלי.לפני תחילת הליך בידוד התאים, שטפו את שחלות הבקר בתוספת אנטיביוטיקה 1X PBS בכוס כדי להסיר דם מפני השטח. השליכו את ה-PBS וחזרו על הכביסה שלוש עד ארבע פעמים עד שהשחלות נקיות מכל הדם שנותר. השתמש במגבון מעבדה ספוג באתנול 70% כדי לנגב שחלה אחת.השתמש במזרק של שלושה מיליליטר עם מחט בגודל 18 כדי לנקב זקיקים קטנים עד בינוניים. ואז שואבים את הנוזל הזקיקי המכיל את תאי הגרנולוזה. העבירו את הנוזל הזקיקי לצינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר.לאחר ניקוב מספר זקיקים, השתמש ב-PBS 1X אחד כדי לשטוף את המזרק והמחט לניקוי ביניים כדי למנוע מהמחט לחסום בתאים. חזור על הפעולה עם ניקוב ושאיבת הזקיקים כדי להשיג כמה שיותר תאים עם הנוזל הזקיקי. כדי להקצות מספר מתאים של GCs מבודדים טריים כדגימות ייחוס לניתוחי RNA, DNA וחלבון, הנח מספר ציטוטים של תאי הייחוס בצינורות טריים של 1.5 מיליליטר.צנטריפוגה למשך דקה אחת ב 12, 000 פעמים G בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופרנטנט ושחררו את הכדורים בחנקן נוזלי ואחסנו במינוס 80 מעלות צלזיוס. כדי להתחיל בשימור בהקפאה, גלולה בעדינות את ה-GCs על ידי צנטריפוגה שלהם ב-500 פעמים G בטמפרטורת החדר למשך שלוש דקות.הסר בזהירות את הסופרנטנט, והשהה מחדש בעדינות את כדור התא בסרום עגל עוברי 100%, או FCS, כדי להסיר את כל הגושים הנראים לעין. לאחר מכן מוסיפים נפח אחד של מדיום ההקפאה שהוכן בעבר, מערבבים בעדינות ומעבירים את התערובת לבקבוקון קריוגני. מניחים את הבקבוקון במיכל הקפאה מיוחד המונע הקפאה מהירה, כך שקצב הקירור לא יעלה על מינוס מעלה צלזיוס לדקה.לאחר מכן הקפיאו את המיכל במינוס 80 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות לפחות. הפשירו במהירות את התאים בבקבוקון הקריוגני באמבט מים של 37 מעלות למשך שלוש עד ארבע דקות והעבירו את תרחיף התאים ל-Alpha MEM מחומם מראש של 37 מעלות ללא תוסף הורמונים כדי להשיג נפח סופי של 10 מיליליטר. צנטריפוגה את התאים ב -500 פעמים G בטמפרטורת החדר למשך שלוש דקות.השליכו את הסופרנטנט והוסיפו את תוסף ה-Alpha MEM שחומם מראש לכדור התא והשעו מחדש בזהירות. זרעו את ה-GCs בצלחת של 24 בארות בנפח סופי של 500 מיקרוליטר לבאר, והקפידו לכלול שכפולים של לפחות שלוש בארות לכל מצב. לבסוף, דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ועם 5% CO2 למשך שמונה ימים, ולאחר מכן המשיכו בניתוח התאים.לאחר תרבית GCs בצפיפות נורמלית של אחד כפול 10 לתאים החמישיים לבאר, התאים הראו פנוטיפ דמוי פיברובלסטים האופייני ל-GCs. תאים שגודלו בצפיפות ציפוי גבוהה של 1 כפול 10 עד השישית לא שינו את המורפולוגיה שלהם, אלא יצרו אשכולות תאים גדולים בתדירות גבוהה יותר. לאחר תרבית התאים בצפיפות של 1 כפול 10 עד החמישית, ביטוי גנים של מספר תעתיקי סמנים שהוערכו לא גילה הבדל בין תאים מתורבתים עם או בלי שימור ראשוני בהקפאה.כאשר GCs תורבו בצפיפות תאים גבוהה, ריכוז האסטרדיול ירד משמעותית, בעוד שריכוז הפרוגסטרון עלה בהשוואה לתאים שגדלו בצפיפות רגילה. GCs של בקר שגודלו בתנאים נטולי סרום במשך שמונה ימים חשפו הבדל משמעותי בוויסות של מספר גנים סמנים נבחרים בתרביות בצפיפות גבוהה לעומת נורמלית כפי שנמדד עם QPCR. בעת שימוש במודל תרבית תאים זה של תאי גרנולוזה בקר המייצרים אסטרדיול, חשוב לזכור גורמים שהשפיעו על הפיזיולוגיה של התא כגון צפיפות התאים.לאחר הליך זה, ניתן לבצע פרוטוקולי טיפול אחרים על מנת לענות על שאלות כגון, אילו מולקולות או מסלולי איתות מעורבים בהתמיינות תאי גרנולוזה בקר. טכניקת השימור בהקפאה סללה את הדרך לעבודת תרבית תאים מובנית ומאורגנת יותר ועשויה להיות מועברת בקלות למינים אחרים.

a-tissue-culture-model-estrogen-producing-primary-bovine-granulosa

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Heterotypic תלת ממדי<em&gt; במבחנה</em&gt; מידול של אינטראקציות stromal-אפיתל בייזום והתקדמות סרטן השחלות

אנו מתארים מודל תרבית תלת מימדי של אפיתל השד האנושי המתאים לחקר פעולת ההורמונים.

מודל התרבות 3D-תגובת הורמון של האפיתל בלוטת חלב האדם

בתרביות רקמה השחלות יכול לשמש דגמים של זקיק פיתוח, הביוץ זקיק בהכנת ולציין את מנגנוני הרגולציה של תהליכים דינאמיים השחלות.

תרביות רקמה השחלות כדי לחזות תופעות העכבר השחלה

אנו מתארים את ההליכים לבידוד של גידול oocytes מזקיקי השחלות בשלבים מוקדמים של פיתוח, כמו גם את ההתקנה של מערכת תרבות מבחנה אשר יכול לתמוך בצמיחה ובידול עד לשלב הבוגר במלואו.

במבחנה תרבות אסטרטגיה עבור Oocytes מ זקיק אנטרל מוקדם בבקר

תרבות מבינטית של קליפת המוח השחלות שור ואת ההשפעה של דיאטה תזונתית מדרגות צעד על microenvironment השחלות מוצג. חתיכות קליפת המוח השחלתית היו מתורבתים במשך שבעה ימים, סטרואידים, ציטוקינים, ושלבי זקיק הוערכו. טיפול דיאטה מדרגות-צעד היה סטרואידוגנזה מוגברת וכתוצאה מכך התקדמות זקיק בתרבות.

תרבית רקמת קליפת המוח השחלות

קידום המחקר של פוליקולוגנזה פרה-אנטרלית דורש שיטות יעילות לבידוד זקיקים משחלות בודדות. מוצג כאן פרוטוקול מכני יעיל לבידוד זקיקים משחלות בקר באמצעות מסוק רקמות והומוגנייזר. שיטה זו מאפשרת איסוף של מספר רב של זקיקים פרה-אנטרליים בני קיימא משחלה אחת.

בידוד זקיקים פרה-אנטרליים קטנים משחלת הבקר באמצעות שילוב של פיצול, הומוגניזציה וסינון סדרתי

אנטרואידים מתגלים כמודל חדשני לחקר פיזיולוגיה ופתופיזיולוגיה של רקמות, פיתוח תרופות ורפואה רגנרטיבית. כאן, אנו מתארים מערכת תרבית דו-ממדית ממקור אנטרואידים של תאים ראשוניים בקר, המאפשרת תרבית משותפת עם סוגי תאי רקמה רלוונטיים. מודל זה מציע יתרון תרגומי למודלים של מחקר במערכת העיכול.

יצירת מערכת תרבית חד-שכבתית דו-ממדית ראשונית שמקורה באנטרואיד בקר ליישומים במחקר ביו-רפואי תרגומי

מאמר זה מציג מודל תרבית משותפת של תאי תקה וגרנולוזה בקר. לשיטה זו יש פוטנציאל לשמש בסיס אמין לניתוחים המתמקדים בחקר תקשורת פרקרינית והובלת מצע בין התאים הסומטיים בתוך הזקיק.

מערכת קו-תרבית מותאמת להבנת אינטראקציות בין תאי גרנולוזה-תקה בשחלת הבקר

Hepatocytes ראשיים מספקים כלי רב ערך כדי להעריך ביוכימיים, פונקציות מולקולרית, ואת חילוף החומרים במערכת ניסיונית רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. אנו מתארים פרוטוקול אמין עכברוש זלוף הכבד באתרו, אשר באופן עקבי יוצר hepatocytes קיימא עד to1.0 ×...

בידוד תרבות ראשונית של תאים בכבד עכברוש

בפרסום זה, אנו מתארים הליך מהיר ונוח לבידוד ותאי לבלב acinar העיקריים culturing מהלבלב העכברי. שיטה זו מהווה גישה רבת ערך כדי ללמוד את הפיסיולוגיה של תאי לבלב אקסוקרינית רגילים / untransformed העיקריים טריים.

בידוד והתרבות של תאי לבלב הראשיים acinar עכבר

חקור מודל תרביות תאי גרנולוזה בקר לייצור אסטרוגן באמצעות טכניקת הקפאה. שיטה זו מאפשרת מחקר ביולוגיה רבייה ללא תלות באספקת רקמות טריות.

מודל תרביות רקמה של ייצור אסטרוגן Granulosa שור ראשי תאים

גלה סרטונים נוספים