Name: נוירוגנזה באמצעות P19 Embryonal קרצינומה של תאים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: למדו פרוטוקול מופשט להשתלת עצבים בתאי P19 באמצעות חומצה רטינואית. שיטה זו מפשטת את תהליך ההתמיינות העצבית ומאפשרת מחקר יעיל של מנגנוני נוירוגנזה בביולוגיה התפתחותית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחקר היה נתמך כספית על ידי מרכז המדע הלאומי, פולין (מענק לא. מו-2017/25/N/NZ3/01886) ויודע (מרכז המחקר הלאומי המוביל) קונסורציום מדעי "בעלי חיים בריאים-מזון בטוח", החלטה של משרד המדע והשכלה גבוהה מס ' 05-1/KNOW2/2015

1. תחזוקת התרבות
<ol><li>תרבות קו התא P19 בינונית תחזוקה (מדיום הנשר שונה של מאוד עם 4,500 mg/L של גלוקוז שיושלם עם 10% FBS, 100 יחידות/מ"ל פניצילין ו 100 יחידות/mL סטרפטומיצין). מודטה ב 37 ° צ' ו 5% CO2.</li>
</ol>2. תאים תת-משניים
<ol><li>כאשר התאים מגיעים כ 80% המפגש, להסיר את המדיום המושקע מבחנות תרבות התא (שטח המשטח 25 ס מ2).</li>
	<li>לשטוף את התאים עם 2 מ ל של פוספט מלוחים באגירה (PBS) ללא סידן ומגנזיום.</li>
	<li>להוסיף 1 מ ל של 0.25% טריפסין-EDTA (חומצה אטיליאדיאמאאת) אל התא מונאולייר.</li>
	<li>שים את הבקבוקון בחממה CO2 (37 ° צ' ו 5% CO2) עבור 2-3 דקות.</li>
	<li>העריכו את התא המצורף למשטח הבקבוקון. ודא שכל התאים מנותקים וצפים במדיום.</li>
	<li>הוסף 9 מ ל של מדיום תחזוקה כדי להפסיק את הפעילות האנזימטית של טריפסין.</li>
	<li>השהה מחדש את התאים במדיום תחזוקה.</li>
	<li>העבר תאים לצינור 15 מ"ל ו צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 200 x g וטמפרטורת החדר (RT).</li>
	<li>השמט את הסופרנטאנט והוסף 10 מ ל של מדיום תחזוקה רעננה לתוך השפופרת של 15 מ ל.</li>
	<li>השתמש בהשעיה של התא כדי לקבוע את מספר התא באמצעות מונה תאים בהתאם להוראות היצרן.</li>
	<li>תאי הזרע ב 2 x 104 תאים/cm2 בבקבוקון 25 ס מ חדש2 .</li>
	<li>הוסיפו את מדיום התחזוקה עד 10 מ ל.</li>
	<li>לשים את הבקבוקון עם תאים בחממה CO2 (37 ° צ' ו 5% CO2) עבור 2-3 ימים.</li>
</ol>3. טריפסין העיכול
<ol><li>. מתוך הבקבוקון של התא לשטוף את התאים פעם אחת עם 2 מ ל של סידן ומגנזיום חינם PBS.</li>
	<li>הוסף 1 מ ל של 0.25% טריפסין-EDTA.</li>
	<li>לשים את הבקבוקון עם תאים לתוך החממה CO2 ב 37 ° c עבור 2-3 דקות.</li>
	<li>השתמש בפיפטה משנת 1 mL כדי לנתק את התאים על ידי מלטף תאים עשר פעמים.</li>
	<li>לנטרל טריפסין על ידי הוספת 9 מ ל של בידול בינונית (מדיום הנשר שונה של בינוני עם 4500 mg/L של גלוקוז שיושלם עם 5% FBS, 100 יחידות/מחלת הפניצילין ו 100 יחידות/mL סטרפטומיצין) ללא RA לתאים.</li>
	<li>העבר תאים לצינור 15 מ"ל ו צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 200 x g ו RT.</li>
	<li>להיפטר supernatant ולהוסיף 1 מ ל של בידול בינונית ללא חומצה retinoic (RA). . השהה מחדש את הגלולה הסלולרית</li>
	<li>השתמש בהשעיה של התא כדי לקבוע את מספר התא באמצעות מונה תאים בהתאם להוראת היצרן.</li>
</ol>4. הדור המצטבר
<ol><li>הוסף 5 μL של RA (במלאי 1 מ"מ הומס 99.8% אתנול, מאוחסן ב-20 ° c) ל 10 מ ל של הבדלה בינונית ומערבבים היטב (הריכוז הסופי של 0.5 μM RA). הערה: . רה א רגיש באור ריכוז נמוך של אטוה אינו משפיע על בידול תא19,20,21.</li>
	<li>הוסף 10 מ ל של בידול בינוני (עם RA) אל מאכל התרבות 100 מ"מ (מוקדש תרבות ההשעיה).</li>
	<li>הזרע את 1 x 106 תאים במנה 100 מ"מ (שטח המשטח 56.5 ס"מ2).</li>
	<li>לשים את הבקבוקון עם תאים לתוך החממה ב 37 ° צ' ו 5% CO2 עבור 2 ימים כדי לקדם את היווצרות אגרגטים.</li>
	<li>לאחר יומיים, החלף את המדיום בידול. משוכי מדיום המכיל אגרגטים באמצעות מנקז 10 מ ל ולהעביר לצינור 15 מ ל ב-RT.</li>
	<li>לאפשר לאגרגטים להתיישב על ידי כוח הכבידה עבור 1.5 דקות ב RT.</li>
	<li>. מחק את הסופרנטאנט</li>
	<li>הוסף חדש 10 מ ל של בידול בינוני עם 0.5 μm RA באמצעות הצינורות 10 mL סרולוגית. זהירות: אין לנקות את מצרפים את התאים למעלה ולמטה.</li>
	<li>הזרע האגרגטים לתוך המנה החדשה 100 mm לא מטופלים התרבות (מוקדש תרבות ההשעיה).</li>
	<li>מניחים את הצלחת בחממה (ב 37 ° צ' ו 5% CO2) במשך יומיים.</li>
</ol>5. אגרגטים דיסוציאציה
<ol><li>מתיף את האגרגטים בתאים. באמצעות פיפטה של 10 מ ל</li>
	<li>העבירו את האגרגטים. לשפופרת של 15 מ ל לאפשר לאגרגטים תאים להתיישב על ידי כוח הכבידה עבור 1.5 דקות.</li>
	<li>. הסר את הסופרנטאנט</li>
	<li>רוחצים את האגרגטים בלבד (סרום-וללא אנטיביוטיקה).</li>
	<li>לאפשר לאגרגטים תאים להתפשר על ידי משקעי כוח הכבידה עבור 1.5 דקות ב RT.</li>
	<li>הוסיפו את הסופרנטנט ומוסיפים 2 מ ל טריפסין-אדטה (0.25%).</li>
	<li>מניחים את אגרגטים התא לתוך אמבט מים (37 ° c) במשך 10 דקות. מתפרעים את האגרגטים בעדינות כל 2 דקות על ידי הקשה עם יד.</li>
	<li>להפסיק את תהליך הטריסינוניזציה על ידי הוספת 4 מ ל של מדיום תחזוקה.</li>
	<li>פיפטה מגיע למעלה ולמטה 20 פעמים. באמצעות פיפטה 1 מ ל</li>
	<li>תאים צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 200 x g ו RT.</li>
	<li>הסר את הסופרנטאנט והשהה מחדש את הגלולה הסלולרית ב-5 מ ל של אמצעי תחזוקה.</li>
	<li>קבע את מספר הטלפון באמצעות מונה תאים.</li>
</ol>6. ציפוי תאים
<ol><li>הוסף 3 מ ל לכל טוב של תחזוקה בינונית לצלחת 6.</li>
	<li>תאי הזרע בצלחת התרבות 6-היטב בצפיפות של 0.5 x 106/well.</li>
	<li>מודטה ב 37 ° c עם 5% CO2 ריכוז.</li>
	<li>זרע את התאים על זכוכית לכסות ב 6 היטב לוחית התרבות ולבצע הכתמים עם נוגדן anti-MAP2 (20% המפגש). השימוש בצלחת 6-הבאר כדי לבודד RNA ולבצע RT-PCR עבור Map2, neun, Oct4, ננוg, ו-הגנד (20% המפגש). </li>
</ol>

<ol><li>Ramkumar, N., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SnapShot%3A+mouse+primitive+streak%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SnapShot: mouse primitive streak.</a> Cell. 146 (3), 488(2011).</li>
<li>Solnica-Krezel, L., Sepich, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrulation%3A+making+and+shaping+germ+layers%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Gastrulation: making and shaping germ layers.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 28, 687-717 (2012).</li>
<li>Tam, P. P. L., Gad, J. M. Chapter 16: Gastrulation in the Mouse Embryo. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTam%2C+PPL+%22Gastrulation%3A+From+Cells+to+Embryo%22">Gastrulation: From Cells to Embryo</a>. Stern, C. D. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. 233-262 (2004).</li>
<li>Sajini, A. A., Greder, L. V., Dutton, J. R., Slack, J. M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Oct4+expression+during+the+development+of+murine+embryoid+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Loss of Oct4 expression during the development of murine embryoid bodies.</a> Developmental Biology. 371 (2), 170-179 (2012).</li>
<li>ten Berge, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+Signaling+Mediates+Self-Organization+and+Axis+Formation+in+Embryoid+Bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Wnt Signaling Mediates Self-Organization and Axis Formation in Embryoid Bodies.</a> Cell Stem Cell. 3 (5), 508-518 (2008).</li>
<li>Bain, G., Ray, W. J., Yao, M., Gottlieb, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+embryonal+carcinoma+cells+to+neurons%3A+the+P19+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">From embryonal carcinoma cells to neurons: the P19 pathway.</a> Bioessays. 16 (5), 343-348 (1994).</li>
<li>Lin, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YAP+regulates+neuronal+differentiation+through+Sonic+hedgehog+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">YAP regulates neuronal differentiation through Sonic hedgehog signaling pathway.</a> Experimental Cell Research. 318 (15), 1877-1888 (2012).</li>
<li>Neo, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+miR-124+controls+the+choice+between+neuronal+and+astrocyte+differentiation+by+fine-tuning+Ezh2+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">MicroRNA miR-124 controls the choice between neuronal and astrocyte differentiation by fine-tuning Ezh2 expression.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (30), 20788-20801 (2014).</li>
<li>Jones-Villeneuve, E., McBurney, M. W., Rogers, K. A., Kalnins, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+induces+embryonal+carcinoma+cells+to+differentiate+into+neurons+and+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid induces embryonal carcinoma cells to differentiate into neurons and glial cells.</a> The Journal of Cell Biology. 94 (2), 253-262 (1982).</li>
<li>McBurney, M. W., Rogers, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+male+embryonal+carcinoma+cells+and+their+chromosome+replication+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of male embryonal carcinoma cells and their chromosome replication patterns.</a> Developmental Biology. 89 (2), 503-508 (1982).</li>
<li>Jones-Villeneuve, E., Rudnicki, M. A., Harris, J. F., McBurney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid-induced+neural+differentiation+of+embryonal+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid-induced neural differentiation of embryonal carcinoma cells.</a> Molecular and Cellular Biology. 3 (12), 2271-2279 (1983).</li>
<li>Jasmin,, Spray, D. C., Campos de Carvalho, A. C., Mendez-Otero, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+induction+of+cardiac+differentiation+in+P19+embryonal+carcinoma+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Chemical induction of cardiac differentiation in P19 embryonal carcinoma stem cells.</a> Stem Cells and Development. 19 (3), 403-412 (2010).</li>
<li>Solari, M., Paquin, J., Ducharme, P., Boily, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P19+neuronal+differentiation+and+retinoic+acid+metabolism+as+criteria+to+investigate+atrazine%2C+nitrite%2C+and+nitrate+developmental+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">P19 neuronal differentiation and retinoic acid metabolism as criteria to investigate atrazine, nitrite, and nitrate developmental toxicity.</a> Toxicological Sciences. 113 (1), 116-126 (2010).</li>
<li>Babuska, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+P19+cells+during+retinoic+acid+induced+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Prague+Medical+Report%22%5BJournal%5D)">Characterization of P19 cells during retinoic acid induced differentiation.</a> Prague Medical Report. 111 (4), 289-299 (2010).</li>
<li>Monzo, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+generating+high-yield+enriched+neuronal+cultures+from+P19+embryonal+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A method for generating high-yield enriched neuronal cultures from P19 embryonal carcinoma cells.</a> Journal of Neuroscience Methods. 204 (1), 87-103 (2012).</li>
<li>Popova, D., Karlsson, J., Jacobsson, S. O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+neurons+derived+from+mouse+P19%2C+rat+PC12+and+human+SH-SY5Y+cells+in+the+assessment+of+chemical-+and+toxin-induced+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Pharmacology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Comparison of neurons derived from mouse P19, rat PC12 and human SH-SY5Y cells in the assessment of chemical- and toxin-induced neurotoxicity.</a> BMC Pharmacology and Toxicology. 18 (1), 42(2017).</li>
<li>Woodgate, A., MacGibbon, G., Walton, M., Dragunow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+toxicity+of+6-hydroxydopamine+on+PC12+and+P19+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">The toxicity of 6-hydroxydopamine on PC12 and P19 cells.</a> Molecular Brain Research. 69 (1), 84-92 (1999).</li>
<li>Tsukane, M., Yamauchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B%2Fcalmodulin-dependent+protein+kinase+II+mediates+apoptosis+of+P19+cells+expressing+human+tau+during+neural+differentiation+with+retinoic+acid+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Enzyme+Inhibition+and+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II mediates apoptosis of P19 cells expressing human tau during neural differentiation with retinoic acid treatment.</a> Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 24 (2), 365-371 (2009).</li>
<li>Adler, S., Pellizzer, C., Paparella, M., Hartung, T., Bremer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+solvents+on+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+in+Vitro%22%5BJournal%5D)">The effects of solvents on embryonic stem cell differentiation.</a> Toxicology in Vitro. 20 (3), 265-271 (2006).</li>
<li>Jones-Villeneuve, E. M., McBurney, M. W., Rogers, K. A., Kalnins, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+induces+embryonal+carcinoma+cells+to+differentiate+into+neurons+and+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid induces embryonal carcinoma cells to differentiate into neurons and glial cells.</a> The Journal of Cell Biology. 94 (2), 253-262 (1982).</li>
<li>Roy, B., Taneja, R., Chambon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+activation+of+retinoic+acid+%28RA%29-responsive+genes+and+induction+of+embryonal+carcinoma+cell+differentiation+by+an+RA+receptor+alpha+%28RAR+alpha%29-%2C+RAR+beta-%2C+or+RAR+gamma-selective+ligand+in+combination+with+a+retinoid+X+receptor-specific+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Synergistic activation of retinoic acid (RA)-responsive genes and induction of embryonal carcinoma cell differentiation by an RA receptor alpha (RAR alpha)-, RAR beta-, or RAR gamma-selective ligand in combination with a retinoid X receptor-specific ligand.</a> Molecular and Cellular Biology. 15 (12), 6481-6487 (1995).</li>
<li>Hamada-Kanazawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox6+overexpression+causes+cellular+aggregation+and+the+neuronal+differentiation+of+P19+embryonic+carcinoma+cells+in+the+absence+of+retinoic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Sox6 overexpression causes cellular aggregation and the neuronal differentiation of P19 embryonic carcinoma cells in the absence of retinoic acid.</a> FEBS Letters. 560 (1-3), 192-198 (2004).</li>
<li>Tangsaengvit, N., Kitphati, W., Tadtong, S., Bunyapraphatsara, N., Nukoolkarn, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurite+Outgrowth+and+Neuroprotective+Effects+of+Quercetin+from+Caesalpinia+mimosoides+Lamk+on+Cultured+P19-Derived+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Evidence-Based+Complementary+and+Alternative%22%5BJournal%5D)">Neurite Outgrowth and Neuroprotective Effects of Quercetin from Caesalpinia mimosoides Lamk on Cultured P19-Derived Neurons.</a> Evidence-Based Complementary and Alternative. , 838051(2013).</li>
<li>Magnuson, D. S., Morassutti, D. J., McBurney, M. W., Marshall, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+derived+from+P19+embryonal+carcinoma+cells+develop+responses+to+excitatory+and+inhibitory+neurotransmitters%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Neurons derived from P19 embryonal carcinoma cells develop responses to excitatory and inhibitory neurotransmitters.</a> Developmental Brain Research. 90 (1-2), 141-150 (1995).</li>
<li>MacPherson, P., Jones, S., Pawson, P., Marshall, K., McBurney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P19+cells+differentiate+into+glutamatergic+and+glutamate-responsive+neurons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">P19 cells differentiate into glutamatergic and glutamate-responsive neurons in vitro.</a> Neuroscience. 80 (2), 487-499 (1997).</li>
<li>Hong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methyltransferase-inhibition+interferes+with+neuronal+differentiation+of+P19+embryonal+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Methyltransferase-inhibition interferes with neuronal differentiation of P19 embryonal carcinoma cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 377 (3), 935-940 (2008).</li>
<li>Wenzel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+classic+nuclear+localization+signal+at+the+N+terminus+that+regulates+the+subcellular+localization+of+Rbfox2+isoforms+during+differentiation+of+NMuMG+and+P19+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Identification of a classic nuclear localization signal at the N terminus that regulates the subcellular localization of Rbfox2 isoforms during differentiation of NMuMG and P19 cells.</a> FEBS Letters. 590 (24), 4453-4460 (2016).</li>
<li>Harada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+Cathepsin+E+Interferes+with+Neuronal+Differentiation+of+P19+Embryonal+Teratocarcinoma+Cells+by+Degradation+of+N-cadherin%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Overexpression of Cathepsin E Interferes with Neuronal Differentiation of P19 Embryonal Teratocarcinoma Cells by Degradation of N-cadherin.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 37 (3), 437-443 (2017).</li>
<li>Morassutti, D. J., Staines, W. A., Magnuson, D. S., Marshall, K. C., McBurney, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+embryonal+carcinoma-derived+neurons+survive+and+mature+following+transplantation+into+adult+rat+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Murine embryonal carcinoma-derived neurons survive and mature following transplantation into adult rat striatum.</a> Neuroscience. 58 (4), 753-763 (1994).</li>
<li>Magnuson, D. S., Morassutti, D. J., Staines, W. A., McBurney, M. W., Marshall, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electrophysiological+maturation+of+neurons+derived+from+a+multipotent+precursor+%28embryonal+carcinoma%29+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">In vivo electrophysiological maturation of neurons derived from a multipotent precursor (embryonal carcinoma) cell line.</a> Developmental Brain Research. 84 (1), 130-141 (1995).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

כאן, אנו מתארים פרוטוקול פשוט עבור נוירוגנזה באמצעות קו התא P19. למרות דיווחים רבים פורסמו בהקשר זה, מתודולוגיה מפורטת עבור אינדוקציה נוירוגנזה באמצעות קו P19 line נשאר ברור. יתר על כן, אנו מנוצלים גלוקוז גבוה פשוט (4,500 mg/L) DMEM בינוני עם 10% FBS עבור הניסוי כולו. הדבר איפשר לנו לבצע את הניסוי הנוירוגניים באופן ידידותי למשתמש ולהרחיב את השימוש בשיטה זו לעתיד.
הנקודות הקריטיות ביותר בפרוטוקול זה הן ריכוז RA, כמו גם הדור של אגרגטים תאים בתרבות ההשעיה. גירוי של נוירוגנזה בתוך קו התא P19 יכול ...

במהלך embryonal פיתוח, שכבת תא אחת הופכת לשלוש שכבות הנבט הנפרדות1,2,3. כדי להגביר את אפשרויות המחקר של תופעות המתרחשות בvivo, התפתחו הדור של אגרגטים תלת-ממדיים (גופים עובריים) כמודל נוח. אגרגטים סלולריים שנוצרו בדרך זו ניתן לחשוף לתנאים שונים גרימת בידול התא, אשר משקפים את ההתפתחות של העובר4,5. קו קרצינומה עובריים P19 murine (קו תא P19) משמש בדרך כלל כמודל הסלולר ללימודי נוירוגנזה ב מבחנה6,7,8. קו התא P19 מציג תכונות מסוימות של תא גזע בעוצמה pluripotent והוא יכול להבדיל לנוירונים בנוכחות של חומצה retinoic (RA) במהלך צבירת תאים ואחריו neurite מוצלח תחת תנאים חסיד. יתר על כן, קו תא P19 מובחן הוא גם מסוגל להרכיב תאים שרירים וקרדיולציט בדומה תחת השפעת diמתיל סולפוקסיד (dmso)9,10,11,12.
שיטות רבות שונות13,14,15,16 דווחו על בידול עצבי, אבל המתודולוגיה היא לפעמים מסובכת ולא קל לתפוס רק על ידי קריאת התיאורים. לדוגמה, פרוטוקולים דורשים לפעמים שילוב של מדיום הנשר המתוקן של Dulbecco (DMEM) בינוני עם תערובת של סרום עגל (CS) וסרום של שור עוברי (FBS)13. יתרה מזאת, מדיה המשמשת להתפתחות עצבית מורכבת לעתים קרובות מנוירוסיס ותוספי B2713,14,15,16. ככאלה, שיטות קיימות מכילות את המורכבות שבהכנות והמטרה שלנו כאן היא לפשט את הפרוטוקולים. במחקר זה, הדגמנו כי DMEM עם FBS יכול להיות מנוצל עבור שמירה על קו התא P19 (Dמאמ + 10% FBS), כמו גם עבור פיתוח עצבי (DMEM גברת + 5% FBS + RA). זו שיטה פשוטה עבור נוירוגנזה באמצעות קו התא P19 מאפשר לנו ללמוד את המנגנון המולקולרי של איך הנוירונים מפותחים. יתר על כן, מחקר על מחלות ניווניות כגון מחלת אלצהיימר מתנהל גם באמצעות P19 cell קו17,18, ואנו מאמינים כי השיטה שפותחה במחקר זה ישחק חלק בהסבר לצאת ה מנגנונים מולקולריים בחריגות נוירו-התפתחותיות ומחלות ניווניות.

<table><tbody><tr><td>6x צבע טעינת DNA</td><td>EURx</td><td>E0260-01</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>cDNA ערכת סינתזה</td><td>EURx</td><td>E0801-02</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4&prime;,6-Diamidine-2&prime;-phenylindole dihydrochloride)</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>10236276001</td><td>ריכוז עבודה: 1 &mu; גרם/מ"ל</td></tr><tr><td>DMEM גלוקוז גבוה (4.5 גרם/ליטר) עם L-גלוטמין</td><td>Lonza</td><td>BE12-604Q</td><td></td></tr><tr><td>אתנול 99.8%</td> <td>Chempur</td><td>CHEM*613964202</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>EURx</td><td>E5050-03</td><td></td></tr><tr><td>MAP2 נוגדן</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>PA517646 דילול 1:100</td></tr><tr><td>PCR ערכת תגובה</td><td>EURx</td><td>E0411-03</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין 10K/10K</td><td>Lonza</td><td>DE17-602E</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח פוספט בופר (PBS), מרוכז 1x ללא Ca2+, Mg2+</td><td>Lonza</td><td>BE17- 517Q</td><td></td></tr><tr><td>חומצה רטינואית</td><td>סיגמא- אולדריץ'</td><td>R2625-50MG</td><td>&nbsp; מומס ב-99.8% אתנול; יש לאחסן ב-20 מעלות; C עד 6 חודשים</td></tr><tr><td>נוגדן משני (Alexa Fluor 488)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11034</td><td>דילול 1:500</td></tr><tr><td>חלב רזה</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>1153630500</td><td></td></tr><tr><td>TBE Buffer</td><td>Thermo Fisher</td><td>Scientific B52</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>T8787-100ML</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין 0.25% - EDTA ב-HBSS, ללא&nbsp; Ca2+, Mg2+, עם פנול אדום</td><td>biosera</td><td>LM-T1720/500</td><td></td></tr><tr><td>תרבית תאים פלסטיק</td> 1 מ"ל פיפטות סרולוגיות <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>פרופילאב</td><td>515.01</td><td></td></tr><tr><td>10 מ"ל פיפטות סרולוגיות</td><td>פרופילאב</td><td>515.10</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 100 מ"מ המוקדשת לתרבית תרחיף</td><td>קורנינג</td><td>C351029</td><td></td></tr><tr><td>צינורות צנטריפוגה 15 מ"ל</td><td>סיגמא- אולדריץ'</td><td>CLS430791-500EA</td><td></td></tr><tr><td>5 מ"ל פיפטות סרולוגיות</td><td>פרופילאב</td><td>515.05</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 6 בארות</td><td>צלחת קורנינג</td><td>CLS3516</td><td></td></tr><tr><td>צלוחיות תרבית תאים, שטח פנים 25 ס"מ2</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>CLS430639-200EA</td><td></td></tr></tbody></table>

נוירוגנזה באמצעות p19 embryonal קרצינומה של תאים

Neurogenesis Using P19 Embryonal Carcinoma Cells

קו התא P19 נגזר העובר העכבר הנגזר teratocarcinoma יש את היכולת להבדיל לתוך שלוש שכבות הנבט. בנוכחות חומצה retinoic (RA), ההשעיה תרבותי P19 קו התא הוא המושרה להבדיל לנוירונים. תופעה זו נחקר בהרחבה כמודל נוירוגנזה בתוך מבחנה. לכן, קו התא P19 הוא מאוד שימושי עבור המחקרים המולקולריים והסלולריים הקשורים נוירוגנזה. עם זאת, פרוטוקולים עבור הבחנה עצבית של קו התא P19 המתואר בספרות הם מורכבים מאוד. השיטה המפותחת במחקר זה פשוטה והיא תשחק תפקיד בהסבר למנגנון המולקולרי בחריגות נוירונטיות ומחלות ניווניות.

הערכה פשוטה של פרוטוקול אינדוקציה נוירוגנזה ב P19 קו התא מוצג באיור 1. על מנת להגדיר את האופי של קו התא P19 במצב מובחן ובמהלך נוירוגנזה, RT-PCR (הפוכה שרשרת של תגובת השרשרת) שימוש. קו התאים P19 מובחן הביע את גנים הפלדה כגון קטיון אורגני/carnitine transporter4 (Oct4) ו nanog הומבוקס (nanog). נוירוגנזה הנגרמת על ידי צבירת תאים בתרבות ההשעיה בנוכחות RA הוביל ירידה מהירה של Oct4 ו nanog ביטוי. בניגוד, הביטוי של תא העצב סמנים: ח...

העכבר P19 מתחלקים קרצינומה של קו התא (קו התא P19) משמש רבות לחקר המנגנון המולקולרי של נוירוגנזה עם פישוט גדול בהשוואה לניתוח vivo. כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור נוירוגנזה הנגרמת חומצה המושרה P19 קו התא.

נוירוגנזה באמצעות P19 Embryonal קרצינומה של תאים

The P19 cell line derived from a mouse embryo-derived teratocarcinoma has the ability to differentiate into the three germ layers. In the presence of ...

קו התא P19 ידוע להבדיל לנוירונים. עם זאת, פרוטוקול עבור התביור נוירון של קו התא P19 הם לפעמים מסובכים. שיטה זו מאפשרת לנו לבצע את הניסוי הנוירוגני באופן ידידותי למשתמש ולהרחיב את האפשרות של שימוש בקו תא P19 לעתיד.כדי להתחיל, לשמור על תאי P19 במדיום תחזוקה, המורכב DMEM, עם 4.5 גרם לליטר של גלוקוז, בתוספת 10% סרום שור עוברי, 100 יחידות למיליליטר פניצילין, ו 100 יחידות לכל סטרפטומיצין מיליליטר. הדגירה את תרבות התאים בסביבה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני עד שהתאים הם בערך 80% נוחים. מוציאים את המדיום המושקע מבקבוק תרבות התאים ושוטפים את התאים בשני מיליליטר של סידן ו-PBS נטול מגנזיום.הוסף מיליליטר אחד של 0.25% טריפסין-EDTA כדי לכסות לחלוטין את monolayer של התאים דגירה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך שתיים עד שלוש דקות. תחת מיקרוסקופ, בדוק אם כל התאים מנותקים. תוריד מחדש את התאים בתשעה מיליליטר של אמצעי תחזוקה כדי לנטרל את הטרפסין.מעבירים את התאים לצינור 15 מיליליטר וצנטריפוגה ב 200 פעמים G וטמפרטורת החדר במשך חמש דקות כדי גלולה התאים. לאחר מכן, שאף את העל-טבעי מבלי להפריע לכדור. השתמש מחדש את גלולה ב 10 מיליליטר של מדיום תחזוקה טרי ולהשתמש מונה תאים כדי לקבוע את מספר התא על פי הוראות היצרן.זרעים 20, 000 תאים לס"מ מרובע בבקבוק T-25 חדש ומוסיפים עד 10 מיליליטר של מדיום תחזוקה. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך יומיים עד שלושה ימים. כדי להתחיל עיכול טריפסין, תחילה לאט לאט שאפו את העל-טבעי ושטפו את התאים בשני מיליליטר של סידן ו-PBS נטול מגנזיום.לאחר מכן, מוסיפים מיליליטר אחד של 0.25% טריפסין EDTA לתאים ו דגירה אותם ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך שתיים עד שלוש דקות. לאחר הדגירה, כדי לנטרל את טריפסין, resuspend התאים בתשעה מיליליטר של מדיום ההידול, מורכב DMEM עם רמת גלוקוז גבוהה בתוספת 5%נסיוב שור עוברי, 100 יחידות למיליליטר פניצילין, ו 100 יחידות לכל סטרפטומיצין מיליליטר. מעבירים את התאים לצינור 15 מיליליטר וצנטריפוגה ב 200 פעמים G וטמפרטורת החדר במשך חמש דקות כדי גלולה התאים.לאחר מכן, שאף באיטיות את העל-טבעי והתן מחדש את גלולת הכדור במיליליטר אחד של מדיום התברואה טרי ללא RA. השתמש ב מונה תאים כדי לקבוע את מספר התא בהתאם להוראות היצרן. עבור הדור המצטבר, התחל על ידי הוספת 10 מיליליטר של מדיום בידול, בתוספת חמישה microliters של RA לצלחת תרבות 100 מיליליטר, לא מטופלים. זרע מיליון תאים בצלחת התרבות ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך יומיים על מנת לקדם היווצרות מצרפית.לאחר הדגירה, עם פיפטה של 10 מיליליטר, שאפו את המדיום המכיל את הצבירה והעבירו אותו לצינור של 15 מיליליטר בטמפרטורת החדר. המתן 1.5 דקות עד שהצטברויות להתיישב בתחתית ולאחר מכן להשליך את supernatant. הוסף 10 מיליליטר של מדיום התברואה טרי בתוספת 0.5 מיקרומולרי RA. זורעים בעדינות את הצבירה בצלחת תרבות חדשה של 100 מילימטר, שאינה מטופלת, והם דוגרים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני במשך יומיים.כדי להתחיל, השתמש פיפסה 10 מיליליטר כדי להעביר את צבירת התא לצינור 15 מיליליטר. המתן 1.5 דקות בטמפרטורת החדר כדי שהצבירות יתיישבו בתחתית ולאחר מכן השליכו את העל-טבעי. לשטוף את אגרגטים עם סרום ו DMEM ללא אנטיביוטיקה.המתן לצבירות תאים כדי להתיישב בתחתית, השלך את העל-טבעי והוסף שני מיליליטר של 0.25% טריפסין EDTA. דגירה הצינור באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות, הקשה כל שתי דקות כדי לשמור על התאים בהשעיה. לאחר מכן, להוסיף ארבעה מיליליטר של אמצעי תחזוקה על מנת לעצור את פעילות טריפסין פיפטה למעלה ולמטה 20 פעמים באמצעות פיפטה מיליליטר אחד.לבסוף, צנטריפוגה התאים ב 200 פעמים G וטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. הסר את supernatant ו resuspend גלולת התא בחמישה מיליליטר של אמצעי תחזוקה. השתמש ב מונה תאים כדי לקבוע את מספר התא והמשך עם ציפוי התאים.כדי לתאים צלחת, תחילה להוסיף שלושה מיליליטר לכל באר של אמצעי תחזוקה לצלחת תרבות שש באר. לאחר מכן, לזרוע את התאים בצפיפות של 500, 000 ל באר. דגירה הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני.זרע את התאים על כוסות כיסוי בצלחת תרבות שש בארות. כאשר הם מגיעים 20%confluence, להמשיך immunostaining עם נוגדן Anti-MAP2. לאחר מכן, לבודד RNA, ולבצע PCR שעתוק הפוך עבור MAP2, NueN, OCT4, NANOG, ו GAPDH.במחקר זה, שיטה פשוטה עבור התמדה עצבית הוא הציג. קו התאים P19 מתורבת בצלחת תרבות שאינה מטופלת עם 5%FBS ו-0.5 מיקרומולרי RA. לאחר ארבעה ימים, צבירות התאים נותק עם טריפסין ונזרע על צלחת תרבות תאים חסידית במשך ארבעת הימים הבאים. היעילות של שיטה זו מוערכת על ידי ההשוואה בין ניתוח RTPCR של קו התא P19 במצב מובחן ובמהלך נוירוגנזה.התוצאות מראות ירידה מהירה בביטוי של גנים פלוריפוטים, כגון Oct4 ו- NANOG, ורגולציה של גנים של סמן עצבי, כגון MAP2 ו- NeuN. אנו מאמינים כי השיטה שפותחה במחקר זה היא פשוטה ותשחק תפקיד בהבהרה של המנגנונים המולקולריים של נוירוגנזה, כמו גם מחלה נוירודגנרטיבית.

neurogenesis-using-p19-embryonal-carcinoma-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

שיטה פשוטה ואמינה על בידוד תרבות בתאי גזע עצביים של רקמה אנושית מושלכים קליפת המוח העוברי מתואר. תרבויות שמקורם ידוע הפרעות נוירולוגיות האדם יכול לשמש אפיון של תהליכים פתולוגיים תאית ומולקולרית, כמו גם לספק פלטפורמה כדי להעריך את יעילות תרופתי.

הדור של בתאי גזע עצביים מן רקמה אנושית זרוקות קליפתיים עוברית

שליטה על ההתפשטות של תאי גזע הסומטיים היא גורם מרכזי פוגעות המחקר והשימוש בטיפול שלהם. כאן אנו מתארים מערכת באופן זמני להרחבת שליטה עצבית גזע תאים במהלך ההתפתחות ובגרות, אשר ניתן להשתמש כדי להגדיל את מספר הנוירונים שנוצרו במוח העכבר.

התרחבות של תאי גזע עצביים עובריים ומבוגרים על ידי<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation או הזרקת Stereotaxic ויראלי

סרטון זה מדגים טכניקה פשוטה לנוירוגנזה הנגרמת על ידי חומצה רטינואית בתאי קרצינומה עוברית של עכבר P19. חומצה רטינואית מפעילה גורמי שעתוק ומפעילה ביטוי גנים להתמיינות עצבית.

נוירוגנזה הנגרמת על ידי חומצה רטינואית באמצעות תאי קרצינומה עוברית של עכבר

שטח pial הוא אזור אב ייחודי במערכת העצבים המרכזית, כי הוא מקבל תשומת לב גוברת. בזאת, אנו פירוט שיטה למניפולציה גנטית מהירה של אזור זה באמצעות אב שיטת electroporation שונה. הליך זה יכול לשמש לחקירות תאיות ומולקולרית של שושלות תאים ומסלולי איתות המעורבים בהתמיינות תאים ועל מנת להבהיר את גורלו ואת המאפיינים של תאי בת.

Electroporation שטח pial ילודים

אסטרוציטים מסוג פרא פנוטיפי ותאי גזע עצביים שנאספו מעכברים שהונדסו עם אללים אונקוגניים מותנים ומותנים ועברו טרנספורמציה ויראלית יכולים לשמש למודל פתוגנזה של אסטרוציטומה במבחנה ובגוף החי על ידי הזרקה אורתוטופית של תאים שעברו טרנספורמציה למוחם של חברים סינגניים בעלי יכולת חיסונית.

דוגמנות אסטרוציטומה פתוגנזה במבחנה ו בVivo שימוש בקליפת מוח האסטרוציטים או בתאי גזע עצביים מעכברים מותנים, מהונדסים גנטי

פרוטוקול זה מתאר כיצד ניתן להבדיל בין תאי אב עצביים לתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם, על מנת להניב אוכלוסיית תאים עצביים חזקה ומשוכפלת, אשר עשויה לשמש לזיהוי מסלולי ההתפתחות התורמים לפתוגנזה של מחלות בהפרעות נוירולוגיות רבות.

מדריך ליצירת וNPCs hiPSC שימוש נגזר לחקר מחלות נוירולוגיות

מעבר אפיתל למזנכימלי (EMT) מאפשר לסרטן להפוך לפולשני. כדי לחקור EMT, מתואר מודל מבחנה מבוסס תאי גזע עצביים (NSC) נטול סרום ואנזימים. מערכת סטנדרטית זו מאפשרת הערכה כמותית ואיכותית של נדידת תאים, ביטוי גנים וחלבונים. המודל מתאים לגילוי תרופות.

Enzyme- ואת הסרום ללא דגם תרבית תאי גזע עצבי לחקירות EMT המתאימים גילוי תרופות

בהתבסס על הנדסת חוץ גופית ויראלי של מראש עצבי, שיתוף ההשתלה שלהם למוח פראי סוג ולזווג הערכה מורמטרית של "מבחן" ו "שליטה" נגזרים, שיטה זו מאפשרת דוגמנות מדויקת של בקרת vivo gene של הנאוקורטילית עצב מורפולוגיה בדרך פשוטה ובמחיר סביר.

השתלת השתלות מהונדסים של הנדסה עצבית בVivo לימודי נוירוארכיטקטורה

הפרוטוקול מציג את התיכנות מראש של תאים היקפיים דם מונפקוף כדי לגרום לתאי גזע עצביים על ידי זיהום וירוס סנדאי, הבידול של iNSCs לתוך הנוירונים הפראים, השתלת ה-DA מקדים לתוך מגירסה חד צדדית מחלת פרקינסון מודלים העכבר, והערכה של הבטיחות והיעילות של הקדם-הלאומית של התובע המחוזי עבור טיפול PD.

דור של תאי גזע עצביים מתוך היקפי תאים מונמונומנט ובידול לכיוון תא העצב הפראמינרגיים ללימודי השתלות

מוצג כאן הוא פרוטוקול עבור הדור הספונטני של נוירוספירות מועשר בתאי מחולל קדמון בצפיפות גבוהה מצופה נוירונים. במהלך אותו ניסוי, כאשר הנוירונים מצופים בצפיפות נמוכה יותר, הפרוטוקול גם גורם לתרבויות ממושכות של עצב החולדות הראשי.

הדור של נוירוספירות מ מעורב היפוקמאל ראשוני ונוירונים בקליפת המוח מבודדים מ E14-E16 ספראג העובר עכברוש

מוצג כאן פרוטוקול לביצוע מניפולציה גנטית במוח החמוס העוברי באמצעות באלקטרואידיות הרחם. שיטה זו מאפשרת מיקוד של תאי האבות העצביים בneocortex ב vivo.

ב Vivo מיקוד של תאי הצבי העצבי Neocortex חמוס על ידי באלקטרופורציה ברחם

למדו פרוטוקול מופשט להשתלת עצבים בתאי P19 באמצעות חומצה רטינואית. שיטה זו מפשטת את תהליך ההתמיינות העצבית ומאפשרת מחקר יעיל של מנגנוני נוירוגנזה בביולוגיה התפתחותית.

נוירוגנזה באמצעות P19 Embryonal קרצינומה של תאים

גלה סרטונים נוספים