נוירוגנזה באמצעות P19 Embryonal קרצינומה של תאים

קו התא P19 ידוע להבדיל לנוירונים. עם זאת, פרוטוקול עבור התביור נוירון של קו התא P19 הם לפעמים מסובכים. שיטה זו מאפשרת לנו לבצע את הניסוי הנוירוגני באופן ידידותי למשתמש ולהרחיב את האפשרות של שימוש בקו תא P19 לעתיד.

כדי להתחיל, לשמור על תאי P19 במדיום תחזוקה, המורכב DMEM, עם 4.5 גרם לליטר של גלוקוז, בתוספת 10% סרום שור עוברי, 100 יחידות למיליליטר פניצילין, ו 100 יחידות לכל סטרפטומיצין מיליליטר. הדגירה את תרבות התאים בסביבה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני עד שהתאים הם בערך 80% נוחים. מוציאים את המדיום המושקע מבקבוק תרבות התאים ושוטפים את התאים בשני מיליליטר של סידן ו-PBS נטול מגנזיום.

הוסף מיליליטר אחד של 0.25% טריפסין-EDTA כדי לכסות לחלוטין את monolayer של התאים דגירה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך שתיים עד שלוש דקות. תחת מיקרוסקופ, בדוק אם כל התאים מנותקים. תוריד מחדש את התאים בתשעה מיליליטר של אמצעי תחזוקה כדי לנטרל את הטרפסין.

מעבירים את התאים לצינור 15 מיליליטר וצנטריפוגה ב 200 פעמים G וטמפרטורת החדר במשך חמש דקות כדי גלולה התאים. לאחר מכן, שאף את העל-טבעי מבלי להפריע לכדור. השתמש מחדש את גלולה ב 10 מיליליטר של מדיום תחזוקה טרי ולהשתמש מונה תאים כדי לקבוע את מספר התא על פי הוראות היצרן.

זרעים 20, 000 תאים לס"מ מרובע בבקבוק T-25 חדש ומוסיפים עד 10 מיליליטר של מדיום תחזוקה. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך יומיים עד שלושה ימים. כדי להתחיל עיכול טריפסין, תחילה לאט לאט שאפו את העל-טבעי ושטפו את התאים בשני מיליליטר של סידן ו-PBS נטול מגנזיום.

לאחר מכן, מוסיפים מיליליטר אחד של 0.25% טריפסין EDTA לתאים ו דגירה אותם ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך שתיים עד שלוש דקות. לאחר הדגירה, כדי לנטרל את טריפסין, resuspend התאים בתשעה מיליליטר של מדיום ההידול, מורכב DMEM עם רמת גלוקוז גבוהה בתוספת 5%נסיוב שור עוברי, 100 יחידות למיליליטר פניצילין, ו 100 יחידות לכל סטרפטומיצין מיליליטר. מעבירים את התאים לצינור 15 מיליליטר וצנטריפוגה ב 200 פעמים G וטמפרטורת החדר במשך חמש דקות כדי גלולה התאים.

לאחר מכן, שאף באיטיות את העל-טבעי והתן מחדש את גלולת הכדור במיליליטר אחד של מדיום התברואה טרי ללא RA. השתמש ב מונה תאים כדי לקבוע את מספר התא בהתאם להוראות היצרן. עבור הדור המצטבר, התחל על ידי הוספת 10 מיליליטר של מדיום בידול, בתוספת חמישה microliters של RA לצלחת תרבות 100 מיליליטר, לא מטופלים. זרע מיליון תאים בצלחת התרבות ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך יומיים על מנת לקדם היווצרות מצרפית.

לאחר הדגירה, עם פיפטה של 10 מיליליטר, שאפו את המדיום המכיל את הצבירה והעבירו אותו לצינור של 15 מיליליטר בטמפרטורת החדר. המתן 1.5 דקות עד שהצטברויות להתיישב בתחתית ולאחר מכן להשליך את supernatant. הוסף 10 מיליליטר של מדיום התברואה טרי בתוספת 0.5 מיקרומולרי RA. זורעים בעדינות את הצבירה בצלחת תרבות חדשה של 100 מילימטר, שאינה מטופלת, והם דוגרים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני במשך יומיים.

כדי להתחיל, השתמש פיפסה 10 מיליליטר כדי להעביר את צבירת התא לצינור 15 מיליליטר. המתן 1.5 דקות בטמפרטורת החדר כדי שהצבירות יתיישבו בתחתית ולאחר מכן השליכו את העל-טבעי. לשטוף את אגרגטים עם סרום ו DMEM ללא אנטיביוטיקה.

המתן לצבירות תאים כדי להתיישב בתחתית, השלך את העל-טבעי והוסף שני מיליליטר של 0.25% טריפסין EDTA. דגירה הצינור באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות, הקשה כל שתי דקות כדי לשמור על התאים בהשעיה. לאחר מכן, להוסיף ארבעה מיליליטר של אמצעי תחזוקה על מנת לעצור את פעילות טריפסין פיפטה למעלה ולמטה 20 פעמים באמצעות פיפטה מיליליטר אחד.

לבסוף, צנטריפוגה התאים ב 200 פעמים G וטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. הסר את supernatant ו resuspend גלולת התא בחמישה מיליליטר של אמצעי תחזוקה. השתמש ב מונה תאים כדי לקבוע את מספר התא והמשך עם ציפוי התאים.

כדי לתאים צלחת, תחילה להוסיף שלושה מיליליטר לכל באר של אמצעי תחזוקה לצלחת תרבות שש באר. לאחר מכן, לזרוע את התאים בצפיפות של 500, 000 ל באר. דגירה הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני.

זרע את התאים על כוסות כיסוי בצלחת תרבות שש בארות. כאשר הם מגיעים 20%confluence, להמשיך immunostaining עם נוגדן Anti-MAP2. לאחר מכן, לבודד RNA, ולבצע PCR שעתוק הפוך עבור MAP2, NueN, OCT4, NANOG, ו GAPDH.

במחקר זה, שיטה פשוטה עבור התמדה עצבית הוא הציג. קו התאים P19 מתורבת בצלחת תרבות שאינה מטופלת עם 5%FBS ו-0.5 מיקרומולרי RA. לאחר ארבעה ימים, צבירות התאים נותק עם טריפסין ונזרע על צלחת תרבות תאים חסידית במשך ארבעת הימים הבאים. היעילות של שיטה זו מוערכת על ידי ההשוואה בין ניתוח RTPCR של קו התא P19 במצב מובחן ובמהלך נוירוגנזה.

התוצאות מראות ירידה מהירה בביטוי של גנים פלוריפוטים, כגון Oct4 ו- NANOG, ורגולציה של גנים של סמן עצבי, כגון MAP2 ו- NeuN. אנו מאמינים כי השיטה שפותחה במחקר זה היא פשוטה ותשחק תפקיד בהבהרה של המנגנונים המולקולריים של נוירוגנזה, כמו גם מחלה נוירודגנרטיבית.