אפיון Microbiome שנתות על-ידי מטוסי אף-16 הדור הבא rRNA אמפליקון רצף

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האקולוגיה של מחלות הנישאות על ידי וקטור כגון, איזה תפקיד ממלא המיקרוביום הווקטורי בדינמיקה של פתוגנים, וכיצד נוצרים ומשתנים מיקרוביום וקטורי? היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם בכך שהיא מאפשרת שכפול גבוה, רזולוציה וזיהוי גבוהים, המאפשרים למשתמש לאפיין במדויק את המיקרוביום הווקטורי בתנאים אקולוגיים וסביבתיים משתנים. הדגמה חזותית של שיטה זו חשובה, מכיוון שקשה ללמוד את שלבי הגדרת ריצוף המיקרוביום, וישנם מוצרים וטכניקות רבים ושונים, אך מעט משאבים זמינים ללימוד שלבים אלה.

התחל הליך זה באיסוף קרציות, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי להסיר מזהמים על פני השטח מהקרציות, הוסיפו 500 מיקרוליטר מי חמצן ומערבולת למשך 15 שניות. חזור על שטיפה זו עם 70% אתנול, ולאחר מכן מים מזוקקים פעמיים.

הכניסו את הקרציות לצינור PCR חדש והניחו להן להתייבש באוויר. בצינור זה, משבשים מכנית את רקמות הקרציות על ידי ריסוק הקרציות עם בן תמותה ועלי. טהר DNA מקרציות בודדות, בהתאם להוראות המופיעות בערכת מיצוי DNA זמינה מסחרית.

לנפח סופי של 100 מיקרוליטר. יצירת בקרה שלילית בשלב המיצוי היא קריטית להבחנה מאוחרת יותר בין מזהמים חשודים לחיידקים וקטוריים אמיתיים. שימוש בטכניקה סטרילית במהלך שלב החילוץ ושלבי PCR מאוחרים יותר נחוץ גם כדי למזער את השפעת הזיהום הנפוץ בריצוף 16S.

הגדר את ה-amplicon PCR בתגובה של 27.5 מיקרוליטר המכילה חמישה מיקרוליטר מכל פריימר במיקרו-מולרית אחת ו-12.5 מיקרוליטר של תערובת PCR זמינה מסחרית. כלול גם חמישה מיקרוליטרים של DNA המופק מקרציות בודדות בריכוז של חמישה ננוגרם למיקרוליטר. העבר את הצינורות לתרמו-סייקלר והפעל את התוכנית הרשומה בפרוטוקול הטקסט.

לאחר סיום ה-PCR, דמיין את מוצר ה-PCR על ידי העמסת ארבעה עד שישה מיקרוליטר לדגימה על ג'ל אגרוז של 1.5%. חפש פס ב-460 זוגות בסיסים כדי לאשר הגברה. באמצעות צינור PCR חדש לכל דגימה, שלב את מוצר ה-PCR עם מים מזוקקים כפולים כדי לקבל בסך הכל 60 מיקרוליטר.

עבור דגימות עם ריכוזי DNA נמוכים, בצע amplicon PCR במשולש כדי להפחית את הטיית ההגברה ולאגד את הדגימות לריכוז. הביאו חרוזים פרמגנטיים לטמפרטורת החדר ומערבלו אותם היטב לפני השימוש. הוסף 48 מיקרוליטר חרוזים פרמגנטיים ל -60 מיקרוליטר מהדגימה ודגר למשך חמש דקות.

הנח את הצינורות על מתלה מגנטי למשך חמש דקות עד שהתמיסה תתבהר. לאחר מכן, הסר את הסופרנטנט. עם צינורות על המדף המגנטי, הוסיפו 500 מיקרוליטר של אתנול 80% טרי שהוכן לאחרונה.

מיד לאחר הוספת אתנול לכל הצינורות, פיפטה החוצה את הנוזל, אל תסיר את החרוזים. חזור על תוספת והסרת האתנול פעם נוספת. יבש את הדגימות באוויר כדי להסיר עודפי אתנול על ידי השארת הצינורות פתוחים על המדף המגנטי למשך חמש דקות או עד שנראים סדקים קטנים בחרוזים.

כעת, הוסיפו 20 מיקרוליטר של מאגר TE ודגרו את הדגימות מהמגנט בטמפרטורת החדר. לאחר חמש עד 10 דקות הנח את הצינורות בחזרה על המגנט. לאחר הפרדת החרוזים והנוזל, העבירו את הסופרנטנטים לצינור טרי כדי להשיג את מוצר ה-PCR הנקי.

הקצה שילובי פריימרים ייחודיים לכל דגימה, על ידי בחירת פריימרים קדימה או אחורה או שניהם מתוך ערכת אינדקס ספרייה זמינה מסחרית. כדי לחבר את הפריימרים או המדדים הכפולים לדגימות, הכינו תגובת PCR המכילה 2.5 מיקרוליטר מכל פריימר, 12.5 מיקרוליטר PCR Master Mix זמין מסחרית, חמישה מיקרוליטר מים מזוקקים כפולים ו-2.5 מיקרוליטר של מוצר אמפליקון מנוקה. העבר את הצינורות לתרמו-ציקלר המתוכנת כמפורט בפרוטוקול הטקסט.

לאחר סיום ה-PCR, דמיין את מוצר ה-PCR על ידי העמסת ארבעה עד שישה מיקרוליטר לדגימה על ג'ל אגרוז של 1.5%. חפש רצועה ב-550 זוגות בסיסים כדי לאשר הגברה לפני ביצוע הליך הניקוי כמו קודם. כדי לבצע כימות מדויק של כל מוצר ברקוד מטוהר, הפעל qPCR על כל דגימה ותקן בשלוש עותקים והפעל כל דגימה בשלוש רמות דילול או יותר.

הכן 10 תגובות qPCR של מיקרוליטר המכילות שישה מיקרוליטר של qPCR Master Mix, שני מיקרוליטר מים מזוקקים כפולים ושני מיקרוליטר של הדגימה או התקן. העבר את לוחית ה-qPCR למכשיר PCR בזמן אמת המתוכנת כמתואר בפרוטוקול הטקסט ובצע את הריצה. לאחר הכימות, צור את הספרייה המשולבת על ידי הוספת נפחים שווים של כל הספריות הבודדות לצינור אחד.

לאחר דילול וניקוי הספרייה המשולבת ובקרת הרצף, טען את התערובת המשולבת על תא זרימת הרצף. נקה היטב את תא הזרימה לפני הטעינה לאופטיקה אופטימלית. לאחר מכן, טען את תא הזרימה על הרצף ובצע ניתוח רצף אמפליקון.

עקומות נדירות לנורמליזציה של ספירת רצפים מוצגות כאן. עקומות אלה מצביעות על כך שנדירות ל-2000 רצפים לדגימה אמורה להספיק כדי ללכוד את המגוון המלא של יחידות טקסונומיות תפעוליות שנצפו. לאחר נדירות וסינון איכות קריאת הרצף, מתבצעת פלט מגוון אלפא ובטא.

מוצגת כאן תרשים ניתוח קואורדינטות עקרונות שנוצר באופן אוטומטי המתאר כיצד הרכב המיקרוביום של הקרציות שונה בהתבסס על הטיפול. יתר על כן, הדמיה של המיקרובים הקיימים בתוך כל דגימה, המוצגת כאן ברמת הפילום שלהם, נוצרת אוטומטית עבור כל הדגימות. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור על טכניקה סטרילית כדי למזער את ההשפעה של זיהום מיקרוביאלי שיכול להשפיע באופן קריטי על פירוש נתוני הרצף.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו צביעה היסטולוגית כדי לענות על שאלות נוספות כגון, היכן נמצאים החיידקים הנצפים בתוך הווקטור? לאחר פיתוחה, שיטה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום האקולוגיה המולקולרית לחקור את תפקידן של אינטראקציות מיקרוביאליות בתוך הווקטור ולחקור כיצד זה עשוי להשפיע על העברת פתוגנים.