Name: אפיון Microbiome שנתות על-ידי מטוסי אף-16 הדור הבא rRNA אמפליקון רצף (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-25T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: למד אפיון microbiome בקרציות באמצעות ריצוף 16S rRNA מהדור הבא. שיטה זו מאפשרת זיהוי ברזולוציה גבוהה של קהילות מיקרוביאליות ותרומה להבנת אקולוגיית מחלות מועברות-נשא.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי קרן המדע הלאומית מעניקה A.S. (דב #1427772, 1745411, 1750037).

1. סמן אוסף ועיקור משטח
<ol><li>לאסוף קרציות על-ידי גרירת מטלית2 לבן 1 מ' על גידול הקשורים שנתות, הסרת קרציות אלו המארח מינים, או לגידול מתקתק ב ה15,מעבדה16. להשתמש מלקחיים בסדר כדי לתפעל קרציות ואחסן אותם ב- 80 ° c</li>
	<li>הכנס קרציות בודדות המבחנות ולהסיר לכלוך משטח מאת vortexing 15 s במרוכז עם 500 μL של מי חמצן (H2O2), 70% אתנול ddH2O.</li>
	<li>למקם את הקרציות צינור PCR, לאפשר להם מילה נהדרת...</li>
	<li>. בצינור הזה, לשבש באופן מכני שנתות רקמות ע י השמדת את צבת ומכתש (השתמשו במחקר זה), באמצעות חרוזים קטנים במכה חרוז, או לחתוך את תקתוק בנפרד עם אזמל.</li>
</ol>2. טיהור DNA
<ol><li>לטהר את הדנ א של קרציות בודדות, ביצוע ההוראות בערכה החילוץ של ה-DNA זמינים מסחרית. Elute עבור אמצעי אחסון הסופי של 100 μL. הערה: עיין באיור 1 לקבלת סקירה כללית של צעדים 2.2 – 2.8. שיטות הוצאה אלטרנטיבית כוללות פנול-כלורופורם החילוץ17,18, אתנול משקעים19או חילוץ עם גשמי20,chelating21.</li>
	<li>לאשר מוצלחת טיהור DNA באמצעות fluorometer או ספקטרופוטומטרים. עבור fluorometry, להשתמש μL 10 של תבנית ה-DNA 190 assay DNA גדילי כפול μL. התשואה הצפויה היא 0.1-1.0 ng/μL22. ספקטרופוטומטר, להשתמש μL 1 של תבנית ה-DNA של כימות חומצות גרעין. היחס A260/280 הצפוי הוא כ 1.823.</li>
	<li>אם לא מיד שימשיך הגברה, לאחסן את הדגימות ב-20 ° C.</li>
</ol>3. 16 rRNA ג'ין הגברה
<ol><li>להגדיר את אמפליקון PCR ב תגובה 27.5 μL המכיל: 5 μL של כל תחל ב- 1 μM; ΜL 12.5 של מיקס PCR זמינים מסחרית; μL 5 של DNA מופק קרציות בודדות-ריכוז 5 ng/μL. הערה: השתמש תחל את הבאים עבור הגברה של האזור V3-V4 hypervariable של מטוסי אף-16 rRNA ג'ין13: 5' - TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG - 3 אינץ ', 5 - GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC - 3' '</li>
	<li>להעביר צינורות thermocycler מתוכנת: דנטורציה הראשונית ב 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות; 25 מחזורי 1) 95 ° C ל 30 s, 2) 57 ° C ל 30 s, 3) 72 ° C ל 30 s; סיומת הסופי ב-72 מעלות למשך 5 דקות; והחזק הסופי ב- 10 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>ברגע נעשה את ה-PCR, דמיינו את המוצר PCR על-ידי טעינת 4-6 μL/לדוגמה ב- 1.5% agarose ג'ל. מחפש להקה. 460 bp כדי לאשר הגברה. הערה: אמפליקון PCR מוצר עשוי לא להיות גלוי על הג'ל אם ריכוז מדגם נמוכה מדי (< 10 ng). פריימר דיימר נוכחות נפוץ בדגימות ריכוז נמוך. אם קיימות להקות אחרות שאינן-יעד, להתאים את טמפרטורת מחזק או להקטין את מספר מחזורי.</li>
	<li>אם לא ממשיכים מיד לתחנת טיהור, לאחסן את הדגימות-4 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>4. 16 אמפליקון טיהור
<ol><li>באמצעות צינור PCR עבור כל דגימה, לשלב את המוצר PCR עם ddH2O להשיג הכולל 60 μL. לקבלת דוגמאות עם ריכוזים נמוכים של ה-DNA, לבצע אמפליקון PCR שהפקידים כדי להפחית הגברה הטיה מאגר דגימות להתרכז.</li>
	<li>להביא חרוזים פאראמגנטיים בטמפרטורת החדר ו מערבולת שאותם היטב לפני השימוש.</li>
	<li>להוסיף μL 48 של חרוזים פאראמגנטיים 60 μL של המדגם, תקופת דגירה של 5 דק. לנקות את הצינורות על מתלה מגנטי במשך 5 דקות עד פתרון הופך את המקום. הסר את תגובת שיקוע. הערה: במכלול זה חרוז מטרות ההסרה של הדימרים פריימר (< 60 bp). במידת הצורך, התאם את הריכוז חרוז כדי להסיר סימון שאינם ספציפיים אחרים.</li>
	<li>עם צינורות על מתלה מגנטי, להוסיף 500 μL של טריות 80% EtOH. מיד לאחר הוספת EtOH לכל הצינורות, פיפטה החוצה הנוזל. אל תסיר את החרוזים. חזור על תוספת EtOH והסרה עוד פעם אחת.</li>
	<li>מילה נהדרת את הדוגמאות כדי להסיר עודפי EtOH על ידי השארת הצינורות פתוחים על מתלה מגנטי במשך 5 דקות, או עד סדקים קטנים הגלויות בהחרוזים...</li>
	<li>הוסף 20 μL טה המאגר, דגירה בדגימות את המגנט, בטמפרטורת החדר, למשך 5-10 דקות.</li>
	<li>במקום הצינורות בחזרה על המגנט. ברגע חרוזים ונוזלים מופרדים, להעביר את תגובת שיקוע צינור טריים כדי לקבל את המוצר PCR נקי.</li>
	<li>(אופציונלי) דמיינו את המוצר כדי לאשר טיהור אמפליקון מוצלחת על-ידי טעינת 4-6 μL/לדוגמה ב- 1.5% ג'ל. הלהקה bp 460 צריך להיות גלוי, צריך להיות אין פריימר דיימר.</li>
	<li>אם לא ממשיכים מיד לאינדקס PCR לאחסן את הדגימות 4 ° C.</li>
</ol>5. לטעום Barcoding וטיהור
<ol><li>להקצות שילובים ייחודיים פריימר כל דגימה על-ידי בחירת תחל קדימה או אחורה, או את שתיהן, ערכה אינדקס ספריית זמינים מסחרית. הערה: באופן ייחודי תיוג דגימות מאפשר בידול לאחר רצף. ערכות מספקים בדרך כלל מספיק תחל את רצף דגימות 96-384.</li>
	<li>לצרף את צבעי בסיס כפול, או מדדי, דוגמאות על-ידי ביצוע PCR בתגובה 25 μL המכילה 2.5 μL של כל פריימר (N7xx ו- S5xx), 12.5 μL של זמינים מסחרית PCR מאסטר מיקס, 5 μL של ddH2O, ו- 2.5 μL של המוצר אמפליקון נקי.</li>
	<li>לעבור הצינורות thermocycler מתוכנת: דנטורציה הראשונית ב 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות; 8-14 מחזורים של 1) 95 ° C ל 30 s, 2) 55 ° C ל 30 s, 3) 72 ° C ל 30 s; סיומת הסופי ב-72 מעלות למשך 5 דקות; והחזק הסופי ב- 10 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>ברגע נעשה את ה-PCR, דמיינו את המוצר PCR על-ידי טעינת 4-6 μL/לדוגמה ב- 1.5% agarose ג'ל. מחפש להקה. 550 bp כדי לאשר הגברה. הערה: השתמש בתוצאות ויזואליזציה להודיע תנאי הרכיבה של ה-PCR מדד. . תוריד את ספירת סבובי כדי להמתיק מחייב שאינם ספציפיים או הגדל את ספירת סבובי להשיג להקות גלויים עבור כל דגימה.</li>
	<li>חזור על הפעולות לנקות ברשימה בשלב 4. כדי למנוע דילול במהלך ניקיון, לבצע אינדקס PCR כפילויות, בריכה המוצר כאן.</li>
	<li>אם לא מיד שימשיך ספריית כמת, נורמליזציה, לאחסן את הדגימות-4 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>6. ספריית כימות ונורמליזציה
<ol><li>מעריכים את הריכוז של כל מוצר לבר-קוד מטוהרים, משלב 5.5 שימוש fluorometer או ספקטרופוטומטרים (ראה שלב 2.2). לדלל את הדגימות במאגר טה לקבל ריכוזים של 1 pM. הערה: ספריית כמת יש צורך להשיג את הדוגמית מעמיסים ריכוז מומלץ עבור פלטפורמת רצף. ספריית כימות מושגת באמצעות qPCR, אך הערכת הריכוז מדגם לפני qPCR חוסך ריאגנטים וזמן. ריכוז 1 pM מומלץ להגדיל את הדיוק של ספריית כמת, כמו זה הריכוז אכזרי של הסטנדרטים qPCR הניתנים את ערכת כימות24.</li>
	<li>ביצוע qPCR לתגובה 10 μL המכיל μL 6.0 של מיקס מאסטר qPCR (מתוך ספריית כימות קיט), μL 2.0 של ddH2O μL 2.0 של הדגימה או רגיל. הפעל כל דוגמה סטנדרטי דולר עבור ודיוק רב יותר. לרוץ כל מדגם ברמות דילול שלושה או יותר (למשל-, 0-1 pm, מאי 1 ו 22:00 עבור ריכוזים התחלה משוער) כדי להבטיח כימות מדויק. הערה: מידע מפורט על תחל שסופקו ועל סטנדרטים ישתנו בהתבסס על ערכת כימות בשימוש והם זמינים בגליון נתונים טכניים של מוצרים. עיין בטבלה של חומרים עבור ערכת כימות השתמשו במחקר זה.</li>
	<li>להעביר את qPCR בצלחת או צינורות מכשיר PCR בזמן אמת מתוכנת: דנטורציה הראשונית של 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות; 35 מחזורי 1) 95 ° C עבור s 30 ו 2) 60 מעלות צלזיוס במשך 45-סופרן; צעד דיסוציאציה של 1) 95 ° C 15 s, 2) 60 ° C ל 30 s, ו- 3) 95 ° C 15 s.</li>
	<li>לחשב את הממוצע החל ריכוז עבור כל דגימה, באמצעות הערכים כימות המתקבל התוצאות qPCR ואת רמות הדילול מדגם בשימוש. הערה: לדוגמה, ריכוז ממוצע של 14:00 עבור כוללות מדגם מדולל התשואות של הריכוז ההתחלתי המקורי של 200 ננומטר. אם אף אחת מרמות לדילול דגימה נתון נופל בתוך הטווח של עקומות סטנדרטי, כמת תוצאות וייתכן שלא תהיה מדויקת; בכל מקרה, לכוונן את רמות הדילול ולבצע מחדש qPCR.</li>
	<li>לדלל כל מדגם לבר-קוד מטוהרים, 4 nM במאגר טה, מבוסס על ריכוז ממוצע שחושבו בצעד 7.5. הערה: לדוגמה, ריכוז ממוצע מדגם של 200 ננומטר, שתדללו דוגמה 1:50 ב- TE מאגר להשגת ריכוז 4 nM. ריכוז דגימה מדויקת משתנים בהתאם מערכת רצף וערכת ריאגנט בשימוש. עיין במדריך למשתמש של מערכת רצף עבור הריכוז המומלץ ביותר.</li>
	<li>צור ספריית משולב על-ידי הוספת נפחים שווים (בדרך כלל 5-10 μL) כל הספריות בודדים לתוך צינור יחיד. הערה: כמו כל דוגמאות צריך להיות ב 4 nM ריכוז, הוספת נפחים שווים משיג על ריכוז שווה של כל הדגימות בספריה במאגר.</li>
	<li>חזור על שלבים 6.2-6.4 על הספרייה המשולבת כדי לאשר את הריכוז nM 4.</li>
	<li>לחשב את הריכוז ספריה משולבת ו לדלל או מחדש מהווים גמר, במאגר הספריה באמצעות מאגר טריס לפי הצורך כדי להשיג 4 nM.</li>
	<li>אם לא ממשיכים מיד לתחנת טעינה הדגימה, לאחסן את הדגימות ב-20 ° C. לבצע רצף זמן קצר לאחר כימות כדי למזער את אובדן או שינויים DNA ריכוז במהלך האחסון.</li>
</ol>7. ספריית דנטורציה, דילול, ולבצע רצף לרוץ (באותו יום)
<ol><li>Denature הספרייה 4 nM המשולב משלב 6.9 עם NaOH. הערה: השלבים הכנה ספריית הסופי להשתנות עבור כל מערכת רצף. עיין במדריך למשתמש של מערכת רצף עבור פרוטוקולים יותר מפורט, מעודכן. משתמשים חדשים כדי להתאמן על השימוש של פלטפורמת רצף או לשלוח שלהם ספריות למתקן רצף של הליבה.</li>
	<li>לדלל את הספריה denatured לריכוז הרצוי טעינה באמצעות המאגר המסופק בערכה ריאגנט רצף (טבלה של חומרים). הערה: טעינה אופטימלית ריכוזים משתנים בהתאם מערכת רצף בדרך כלל בטווח שבין 1-250 pM25.</li>
	<li>Denature, לדלל את הפקד רצף. הערה: הוספת פקד רצף מתקנת עבור רצף בעיות הנובעות ספריות המגוון נמוך. Denature הפקד רצף באמצעות NaOH, לדלל את ריכוז זהה כמו הספרייה.</li>
	<li>לשלב את הספריה רצפי הבקרה. הערה: היחס של רצפי בקרה לספריית משולב יהיה תלוי ספריית המגוון ואת מערכת רצף, אבל זה בדרך כלל 1:126.</li>
	<li>לטעון את הספריה משולב ואת רצף התערובת שליטה על רצף זרימה התא.</li>
</ol>8. אמפליקון רצף ניתוח
<ol><li>להעריך את ההצלחה הכוללת של ההפעלה על ידי בחינת המדדים לרוץ על הסביבה מחשוב ענן המתאים למערכת רצף בשימוש. הערה: המדדים לרוץ, כגון מספר הקריאות רצף, ישתנו בהתבסס על רצף פלטפורמה וערכת ריאגנט בשימוש. ערכי יעד עבור מערכות רצף נפוצות מפורטים בטבלה 1.</li>
	<li>הורד את הנתונים הגולמיים רצף של תוכנת קוד-פתוח ביואינפורמטיקה להזמנה כמותית תובנות אקולוגיה מיקרוביאלית (QIIME)27 או Mothur28. הערה: שניהם QIIME Mothur הם פתוח להורדה בחינם. הוראות מפורטות על שימוש בתוכניות אלה ניתן למצוא באינטרנט, מפורטים מספיק עבור משתמשים מתחילים. השלבים שלהלן מספקים סקירה רחבה של צינור ביואינפורמטיקה שנערך QIIME. היכרות עם פיתון לא הכרחי אבל יקל על היישום של קבצי ה-script הבא</li>
	<li>ליצור ולאמת את קובץ מיפוי באמצעות קובץ ה-script "validate_mapping_file.py" ב- QIIME. הערה: הקובץ מיפוי מכיל כל המטה-נתונים הדרושים לביצוע ניתוח נתונים, כולל זיהוי הדגימה, רצפים פריימר אמפליקון ותיאור מדגם. שלב האימות בודק את כל הנתונים הדרושים הוזן בתבנית מתאימה.</li>
	<li>Demultiplex ולסנן רצפים באמצעות script "split_libraries.py" (איור 1). הערה: קובץ script זה מקצה לבר-קוד קריאות דגימות בהתבסס על הצירופים פריימר אינדקס, מזהי מדגם קלט בקובץ המיפוי. היא גם מבצעת מספר איכות סינון צעדים כדי לשלוט על רצף שגיאה מבוסס על-ידי המשתמש גזור-offs ציון איכות מינימלי, רצף אורכי של סוף-זמירה.</li>
	<li>להקצות יחידות מבצעיות בטקסונומיה (אוטוס) רצפים באמצעות קובץ ה-script "pick_open_references_otus.py". הערה: בשלב זה, רצפים מקובצים נגד אוסף רצף הפניה בהתבסס על סף של זהות (בדרך כלל 97%). קורא אשר אינן תואמות את האוסף רצף ההתייחסות מקובצים אחד נגד השני. De novo והפניה סגור OTU איסוף אפשרויות זמינות גם, אבל פתוח-הפניה האיסוף מומלץ על-ידי מפתחים QIIME.</li>
	<li>לנרמל את הטבלה OTU באמצעות לכתיב "alpha_rarefaction.py" או "normalize_table.py". הערה: שלב זה מתקן עבור וריאציה סכומי עמודה, או רצף הכולל הקראה עבור דגימה, הנובעים טכנולוגיות רצף מודרני. נורמליזציה יכול להתבצע באמצעות rarefaction מסורתיים, או באמצעות שיטות אלטרנטיביות כגון שינוי גודל הסכום המצטבר.</li>
	<li>לבצע מספר אלפא-המגוון בטא-המגוון, ניתוחים גיוון בהרכב בטקסונומיה בעת ובעונה אחת באמצעות קובץ ה-script "core_diversity_analysis.py". הערה: לחלופין, ניתוחים אלה ניתן להפעיל בנפרד באמצעות קבצי ה-script בודדים (למשל, "alpha_diversity.py").</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

רצף הדור הבא של מטוסי אף-16 rRNA להפוך בגישה סטנדרטית לזיהוי חיידקים, התומך חקר כיצד וקטור microbiomes להשפיע על השידור הפתוגן. פרוטוקול שמפורטות כאן פרטים על השימוש בשיטה זו כדי לחקור את מכלול קהילה מיקרוביאלי אני pacificus, זן וקטור עבור מחלת ליים; עם זאת, ניתן בקלות להחיל אותה ללמוד שנתות מינים או וקטור arthropod מינים אחרים.
אכן, רצף rRNA מטוסי אף-16 עבור ניתוח microbiome שימש בהרחבה ללמוד את microbiomes של וקטורים כולל יתושים, psyllids וביתושים29,</su...

התחייה של התפשטות מחלות נישאות וקטור בעשורים האחרונים מהווים איום רציני לבריאות האדם וחיות גלובלית. חיסונים יעילים חסרים עבור רוב המחלות האלה, מאמצי הבקרה הם מוגבל בשל האופי ביולוגי המורכב של וקטורים ואינטראקציות וקטור-פונדקאי. להבין את התפקיד של אינטראקציות חיידקים בתוך וקטור הפתוגן בשידור שיכולים לאפשר הפיתוח של אסטרטגיות מקוריות אשר לעקוף האתגרים הללו. בפרט, אינטראקציות בין וקטור-הקשורים commensals מיקרוביאלי, אנחנו חיים איתם בסמביוזה פתוגנים, המכונה של microbiome, עשויות להיות השלכות חשובות לשידור הפתוגן. ראיות רבות עכשיו תומך קביעה זו, עם דוגמאות הדגמת קישור בין וקטור microbiome הקוד עבור מחלות כמו מלריה, Zika וירוס ומחלת ליים1,2,3. עם זאת, לתרגם את הממצאים הללו לאסטרטגיות לבקרת מחלות דורש הבנה הרבה יותר מפורטת של מבנה, תפקוד, מקורם של וקטור microbiomes. זיהוי ואפיון של הקהילה מיקרוביאלי וקטור תחת משתנה תנאים אקולוגיים וניסויים מהווים נתיב חשוב קדימה בתחום זה.
הליך של זיהוי תושבי מיקרוביאלי וקטור הפתוגן מסופק כאן על ידי ניצול המערבי שחור-רגלי השניה, Ixodes pacificus, זן וקטור של המחלה מחלת ליים Borrelia burgdorferi. בעוד קרציות הנמל סוגים נוספים של פתוגנים האנושית מאשר כל פרוקי-רגליים, יחסית מעט מאוד ידוע על האקולוגיה ביולוגיה והקהילה של שנתות microbiomes4. זה מתבטא קרציות הנמל מערך מגוון של וירוסים, חיידקים, פטריות, protozoans, הכוללים commensals, endosymbionts ו-5,תושבים מיקרוביאלי ארעי4. עבודה מוקדמת הוכיחה וריאציות חזקה ב- microbiomes Ixodes המשויך גאוגרפיה, מינים, מין, שלב חיים וארוחת דם מקור6,7,8. עם זאת, המנגנונים וריאציה זו עדיין לא ידועים ומתחייב שמפורט יותר חקירות של המקור והרכבה של קהילות אלה חיידקים. קרציות יכול לרכוש חיידקים באמצעות שידור אנכי, קשר עם מארחים, ספיגת מן הסביבה דרך spiracles, הפה, נקבובית אנאלי9. הבנת הגורמים בעיצוב את היווצרות ראשונית והפיתוח של microbiome שנתות, במיוחד את התרומה היחסית של השידור האנכי וסביבתיים, חשוב להבנת דפוסי הטבעי של וריאציות של שנתות microbiome המגוון ואת האינטראקציה של קהילות אלה במהלך השידור הפתוגן, עם היישומים האפשריים כדי לשלוט במחלה או וקטור.
טכניקות מולקולריות רבי עוצמה, כגון הדור הבא רצפי, כעת קיים לזיהוי קהילות מיקרוביאלי, יכול להיות מועסק כדי לאפיין וקטור microbiomes תחת מגוון תנאים סביבתיים או ניסיוני. לפני כניסתו של גישות אלה רצף תפוקה גבוהה, זיהוי חיידקים הסתמך בעיקר על מיקרוסקופ ותרבות. בעוד מיקרוסקופ היא טכניקה מהירה וקלה, מורפולוגיים שיטות לזיהוי חיידקים הם מטבעם סובייקטיבי, גס, מוגבל על-ידי רגישות נמוכה, זיהוי10. שיטות מבוססות-תרבות נמצאים בשימוש נרחב עבור זיהוי חיידקים והוא יכול לשמש כדי לקבוע את הרגישות של חיידקים סמים טיפולים11. עם זאת, שיטה זו סובל גם רגישות נמוכה, כאשר ההערכה היא כי פחות מ 2% של הסביבה חיידקים יכולים להיות תרבותי במעבדה הגדרת12. גישות מכתימים היסטולוגית יש גם כבר מועסקים לזהות לשפה חיידקים ספציפיים בתוך וקטורים, לאפשר חקירות של הפצות שונות taxa בתוך השניה ושל לימוד היפותזות על אינטראקציות מיקרוביאלי. עם זאת, ידיעה מוקדמת זהות מיקרוביאלי נדרש לבחירת שהכתמים המתאים, ביצוע גישה זו נועד עבור זיהוי ואפיון מיקרוביאלי. יתר על כן, צביעת היסטולוגית הוא תהליך מאוד אינטנסיבית, מייגעת, אינה סקיילבילית טוב עבור מדגמים גדולים. הגישות המסורתיות מולקולרי כגון סנגר רצף מוגבלות באופן דומה שלהם רגישות וזיהוי של קהילות מיקרוביאלי מגוונות.
הדור הבא רצפי מאפשר זיהוי מהיר של חיידקים מן מספר רב של דוגמאות. הנוכחות של גנים הסמן הרגיל ומאפשר התייחסות מסדי נתונים נוספים משופרת ברזולוציה בטקסונומיה, לעיתים קרובות לשלב סוג או מין. יחידת משנה קטנים ribosomal RNAs משמשים לעתים קרובות כדי להשיג מטרה זו, עם 16 rRNA להיות הנפוצה ביותר בשל נוכחותם של אזורים שנשמרת ומשתנה בתוך הגן, המאפשר היצירה של צבעי בסיס אוניברסלי עם amplicons ייחודי עבור כל בקטריאלי מינים13,14. דו ח זה מפרט הליך של זיהוי taxa, microbiome שנתות באמצעות מטוסי אף-16 rRNA הדור הבא רצפי. בפרט, פרוטוקול זה מדגיש את השלבים הכרוכים בהכנת הדגימות רצף. כללית יותר פרטים על הרצף ומסופקים שלבים ביואינפורמטיקה, שכן ישנם מגוון רחב של פלטפורמות רצף ניתוח תוכניות זמין כעת, כל אחד עם קיים תיעוד נרחב. הכדאיות הכוללת של גישה זו הדור הבא רצפי מומחש החלתו על חקירה של הקהילה מיקרוביאלי הרכבה בתוך וקטור מחלת מפתח.

<table><tbody><tr>שם <td>פריט</td><td>של חומר/ציוד</td><td>קטלוג חברת</td><td>#</td></tr><tr><td>1</td><td>DNeasy Blood & ערכת רקמות</td><td>Qiagen</td><td>69504</td></tr><tr><td>2</td><td>קיוביט 4 פלואורומטר</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q3326</td></tr><tr><td>3</td><td>NanoDrop 8000 ספקטרופוטומטר</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-8000-GL</td></tr><tr><td>4</td><td>2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK2501</td></tr><tr><td>5</td><td>AMPure XP חרוזים</td><td>Agen Court</td><td>A63880&nbsp;</td></tr><tr><td>6</td><td>מתלה מגנטי</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MR02</td></tr><tr><td>6</td><td>מאגר TE</td><td>Teknova</td><td>T0223</td></tr><tr><td>7</td><td>ערכת אינדקס Nextera</td><td>Illumina</td><td>FC-121-1011</td></tr><tr><td>8</td><td>ערכת כימות ספריית KAPA</td><td>Roche</td><td>KK4824</td></tr><tr><td>9</td><td>MiSeq System</td><td>Illumina</td><td>SY-410-1003</td></tr><tr><td>10</td><td>ערכת ריאגנט MiSeq v3&nbsp;</td><td>Illumina</td><td>MS-102-3001</td></tr><tr><td>11</td><td>10 מ"מ Tris-HCl עם 0.1% טווין 20</td><td>Teknova</td><td>T7724</td></tr></tbody></table>

אפיון microbiome שנתות על-ידי מטוסי אף-16 הדור הבא rrna אמפליקון רצף

Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing

במהלך העשורים האחרונים, מחלות נישאות וקטור מחדש, מורחב-מדאיגה המחירים, גורם משמעותי התחלואה והתמותה ברחבי העולם. חיסונים נרחב זמין ויעיל חסרים עבור רוב המחלות האלה, המחייב הפיתוח של אסטרטגיות להפחתת הסיכון למחלות הרומן. למטרה זו, שדרה מבטיח שליטה במחלה כולל מיקוד microbiome וקטור, הקהילה של חיידקים המאכלסים את הווקטור. Microbiome וקטור ממלא תפקיד מרכזי ב- dynamics הפתוגן, מניפולציות של microbiome הובילו שידור שפע או פתוגן וקטור מופחתת על קומץ של מחלות נישאות וקטור. עם זאת, לתרגם את הממצאים הללו לתוך המחלה בקרת יישומים דורש הבנה מעמיקה של וקטור אקולוגיה מיקרוביאלית, מבחינה היסטורית מוגבל על-ידי הטכנולוגיה לא מספיק בתחום זה. כניסתו של הדור הבא רצפי גישות אפשרה רצף מהיר, מקבילים ביותר של קהילות שונות מיקרוביאלי. פילוח הגן rRNA והתפאורה מאוד מטוסי אף-16 הנחתה את אפיוני של חיידקים מתנה בתוך וקטורים תחת משתנה תנאים אקולוגיים וניסויים. טכניקה זו כוללת הגברה של הגן rRNA מטוסי אף-16, דוגמת barcoding באמצעות PCR, טעינה בדגימות אל תא זרימה עבור רצף, ואת ביואינפורמטיקה הגישות כדי להתאים את רצף נתונים עם מידע פילוגנטי. מין או סוג ברמת זיהוי עבור מספר גבוה של משכפל יכולה בדרך כלל להיות מושגת באמצעות גישה זו, ובכך לעקוף את האתגרים של זיהוי נמוך, רזולוציית הפלט culturing מסורתיים, מיקרוסקופ או צביעת היסטולוגית טכניקות. לכן, בשיטה זו הוא מתאים היטב אפיון וקטור מיקרובים בתנאים מגוונים אך כעת לא יכול לספק לכם מידע אודות הפונקציה מיקרוביאלי, מיקום בתוך וקטור, או התגובה לטיפול אנטיביוטי. בסך הכל, מטוסי אף-16 הדור הבא רצפי היא טכניקה עוצמה להבנת טוב יותר את הזהות ואת התפקיד של חיידקים וקטור ב dynamics המחלה.

סך של קרציות 42 מביצה נפרדים שלושה מצמדים, שתי תקופות החשיפה הסביבתית, 0 ו- 2 שבועות, באדמת עובדו על רצף microbiome. . קבוצת כל טיפול, נחשבת אחת מצמד וחשיפה זמן, הכיל 6-8 לשכפל דוגמיות שנתות. תמציות שנתות מעובדים אלה העלו ברצף הדור הבא, הניב 12,885,713 קריאות לזווג-end עובר סינון. כלל בהפעלה זו היו 3 פקדים שלילי מן השלב החילוץ, מניב סכום כולל של קריאות 211,214 (כלול במונה הקודם). בהמשך מדדי איכות לרוץ יחד עם ערכי האופטימלי עבור כל מדד מפורטים בטבלה מס ' 2. Rarefaction עקו...

כאן אנו מציגים פרוטוקול הדור הבא רצפי עבור מטוסי אף-16 rRNA רצף המאפשרת זיהוי ואפיון של קהילות חיידקים בתוך וקטורים. שיטה זו כרוכה DNA החילוץ, הגברה, barcoding דגימות באמצעות PCR, רצף תאים זרימה, ביואינפורמטיקה כדי להתאים את רצף נתונים למידע פילוגנטי.

אפיון Microbiome שנתות על-ידי מטוסי אף-16 הדור הבא rRNA אמפליקון רצף

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האקולוגיה של מחלות הנישאות על ידי וקטור כגון, איזה תפקיד ממלא המיקרוביום הווקטורי בדינמיקה של פתוגנים, וכיצד נוצרים ומשתנים מיקרוביום וקטורי? היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם בכך שהיא מאפשרת שכפול גבוה, רזולוציה וזיהוי גבוהים, המאפשרים למשתמש לאפיין במדויק את המיקרוביום הווקטורי בתנאים אקולוגיים וסביבתיים משתנים. הדגמה חזותית של שיטה זו חשובה, מכיוון שקשה ללמוד את שלבי הגדרת ריצוף המיקרוביום, וישנם מוצרים וטכניקות רבים ושונים, אך מעט משאבים זמינים ללימוד שלבים אלה.התחל הליך זה באיסוף קרציות, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי להסיר מזהמים על פני השטח מהקרציות, הוסיפו 500 מיקרוליטר מי חמצן ומערבולת למשך 15 שניות. חזור על שטיפה זו עם 70% אתנול, ולאחר מכן מים מזוקקים פעמיים.הכניסו את הקרציות לצינור PCR חדש והניחו להן להתייבש באוויר. בצינור זה, משבשים מכנית את רקמות הקרציות על ידי ריסוק הקרציות עם בן תמותה ועלי. טהר DNA מקרציות בודדות, בהתאם להוראות המופיעות בערכת מיצוי DNA זמינה מסחרית.לנפח סופי של 100 מיקרוליטר. יצירת בקרה שלילית בשלב המיצוי היא קריטית להבחנה מאוחרת יותר בין מזהמים חשודים לחיידקים וקטוריים אמיתיים. שימוש בטכניקה סטרילית במהלך שלב החילוץ ושלבי PCR מאוחרים יותר נחוץ גם כדי למזער את השפעת הזיהום הנפוץ בריצוף 16S.הגדר את ה-amplicon PCR בתגובה של 27.5 מיקרוליטר המכילה חמישה מיקרוליטר מכל פריימר במיקרו-מולרית אחת ו-12.5 מיקרוליטר של תערובת PCR זמינה מסחרית. כלול גם חמישה מיקרוליטרים של DNA המופק מקרציות בודדות בריכוז של חמישה ננוגרם למיקרוליטר. העבר את הצינורות לתרמו-סייקלר והפעל את התוכנית הרשומה בפרוטוקול הטקסט.לאחר סיום ה-PCR, דמיין את מוצר ה-PCR על ידי העמסת ארבעה עד שישה מיקרוליטר לדגימה על ג'ל אגרוז של 1.5%. חפש פס ב-460 זוגות בסיסים כדי לאשר הגברה. באמצעות צינור PCR חדש לכל דגימה, שלב את מוצר ה-PCR עם מים מזוקקים כפולים כדי לקבל בסך הכל 60 מיקרוליטר.עבור דגימות עם ריכוזי DNA נמוכים, בצע amplicon PCR במשולש כדי להפחית את הטיית ההגברה ולאגד את הדגימות לריכוז. הביאו חרוזים פרמגנטיים לטמפרטורת החדר ומערבלו אותם היטב לפני השימוש. הוסף 48 מיקרוליטר חרוזים פרמגנטיים ל -60 מיקרוליטר מהדגימה ודגר למשך חמש דקות.הנח את הצינורות על מתלה מגנטי למשך חמש דקות עד שהתמיסה תתבהר. לאחר מכן, הסר את הסופרנטנט. עם צינורות על המדף המגנטי, הוסיפו 500 מיקרוליטר של אתנול 80% טרי שהוכן לאחרונה.מיד לאחר הוספת אתנול לכל הצינורות, פיפטה החוצה את הנוזל, אל תסיר את החרוזים. חזור על תוספת והסרת האתנול פעם נוספת. יבש את הדגימות באוויר כדי להסיר עודפי אתנול על ידי השארת הצינורות פתוחים על המדף המגנטי למשך חמש דקות או עד שנראים סדקים קטנים בחרוזים.כעת, הוסיפו 20 מיקרוליטר של מאגר TE ודגרו את הדגימות מהמגנט בטמפרטורת החדר. לאחר חמש עד 10 דקות הנח את הצינורות בחזרה על המגנט. לאחר הפרדת החרוזים והנוזל, העבירו את הסופרנטנטים לצינור טרי כדי להשיג את מוצר ה-PCR הנקי.הקצה שילובי פריימרים ייחודיים לכל דגימה, על ידי בחירת פריימרים קדימה או אחורה או שניהם מתוך ערכת אינדקס ספרייה זמינה מסחרית. כדי לחבר את הפריימרים או המדדים הכפולים לדגימות, הכינו תגובת PCR המכילה 2.5 מיקרוליטר מכל פריימר, 12.5 מיקרוליטר PCR Master Mix זמין מסחרית, חמישה מיקרוליטר מים מזוקקים כפולים ו-2.5 מיקרוליטר של מוצר אמפליקון מנוקה. העבר את הצינורות לתרמו-ציקלר המתוכנת כמפורט בפרוטוקול הטקסט.לאחר סיום ה-PCR, דמיין את מוצר ה-PCR על ידי העמסת ארבעה עד שישה מיקרוליטר לדגימה על ג'ל אגרוז של 1.5%. חפש רצועה ב-550 זוגות בסיסים כדי לאשר הגברה לפני ביצוע הליך הניקוי כמו קודם. כדי לבצע כימות מדויק של כל מוצר ברקוד מטוהר, הפעל qPCR על כל דגימה ותקן בשלוש עותקים והפעל כל דגימה בשלוש רמות דילול או יותר.הכן 10 תגובות qPCR של מיקרוליטר המכילות שישה מיקרוליטר של qPCR Master Mix, שני מיקרוליטר מים מזוקקים כפולים ושני מיקרוליטר של הדגימה או התקן. העבר את לוחית ה-qPCR למכשיר PCR בזמן אמת המתוכנת כמתואר בפרוטוקול הטקסט ובצע את הריצה. לאחר הכימות, צור את הספרייה המשולבת על ידי הוספת נפחים שווים של כל הספריות הבודדות לצינור אחד.לאחר דילול וניקוי הספרייה המשולבת ובקרת הרצף, טען את התערובת המשולבת על תא זרימת הרצף. נקה היטב את תא הזרימה לפני הטעינה לאופטיקה אופטימלית. לאחר מכן, טען את תא הזרימה על הרצף ובצע ניתוח רצף אמפליקון.עקומות נדירות לנורמליזציה של ספירת רצפים מוצגות כאן. עקומות אלה מצביעות על כך שנדירות ל-2000 רצפים לדגימה אמורה להספיק כדי ללכוד את המגוון המלא של יחידות טקסונומיות תפעוליות שנצפו. לאחר נדירות וסינון איכות קריאת הרצף, מתבצעת פלט מגוון אלפא ובטא.מוצגת כאן תרשים ניתוח קואורדינטות עקרונות שנוצר באופן אוטומטי המתאר כיצד הרכב המיקרוביום של הקרציות שונה בהתבסס על הטיפול. יתר על כן, הדמיה של המיקרובים הקיימים בתוך כל דגימה, המוצגת כאן ברמת הפילום שלהם, נוצרת אוטומטית עבור כל הדגימות. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור על טכניקה סטרילית כדי למזער את ההשפעה של זיהום מיקרוביאלי שיכול להשפיע באופן קריטי על פירוש נתוני הרצף.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו צביעה היסטולוגית כדי לענות על שאלות נוספות כגון, היכן נמצאים החיידקים הנצפים בתוך הווקטור? לאחר פיתוחה, שיטה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום האקולוגיה המולקולרית לחקור את תפקידן של אינטראקציות מיקרוביאליות בתוך הווקטור ולחקור כיצד זה עשוי להשפיע על העברת פתוגנים.

tick-microbiome-characterization-next-generation-16s-rrna-amplicon

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אפיון הקהילה המיקרוביאלית היה מטרה ארוכת שנים במיקרוביולוגיה סביבתית. שיטות ריצוף מהדור הבא מאפשרות כעת אפיון של קהילות מיקרוביאליות בעומק חסר תקדים עם עלות ועבודה מינימליות. אנו מפרטים כאן את הגישה שלנו לרצף גנים של RNA ריבוזומלי חיידקי 16S באמצעות רצף שולחני.

רצף של הדור הבא של 16S ריבוזומלי amplicons ג&#39;ין RNA

זמן ספיגה/יינון לייזר בסיוע מטריקס של ספקטרומטריית מסה של טיסה (MALDI-TOF MS) וטכניקות מולקולריות (ריצוף גנים 16S rRNA) מאפשרות זיהוי של פתוגנים חיידקיים נדירים באבחון שגרתי. מטרת פרוטוקול זה טמונה בשילוב של שתי הטכניקות מה שמוביל לנתונים מדויקים ואמינים יותר.

זיהוי של חיידקים פתוגנים נדירים לפי 16S rRNA ג&#39;ין סידור MALDI-TOF MS

אנחנו מתארים שיטה יעילה, איתנה, וחסכונית לחילוץ חומצות גרעין מן מטליות לאפיון של קהילות חיידקי באמצעות רצף amplicon הגן 16S rRNA. השיטה מאפשרת גישה עיבוד משותף סוגי מדגם מרובים ויכול להכיל מספר תהליכים טיפוליים במורד הזרם.

הפקת חומצות גרעין יעיל 16S rRNA ג&#39;ין רצף עבור בקטריאלי קהילת אפיון

כתב יד זה מתאר פרוטוקול מתוקננת מפורט של תפוקה גבוהה מטוסי אף-16 rRNA-אמפליקון רצף. הפרוטוקול מציג פרוטוקול משולב, לובשי מדים, ריאלי וזולה החל באיסוף הנתונים ניתוחים דגימת צואה. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח של מספר רב של דוגמאות עם סטנדרטים קפדניים מספר פקדים.

פרוטוקול מודרך לקבלת צואה אפיון חיידקים על ידי מטוסי אף-16 rRNA-אמפליקון רצף

זרימת עבודה אוטומטית למחצה מוצג עבור רצף יישוב של rRNA מטוסי אף-16 מ חלב וסוגים אחרים של הדגימה נמוך-ביומסה.

שיטה של מטוסי אף-16 יישוב רצף של דגימות חלב

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול להשיג אמפליקון רצף נתונים של קרקע, rhizosphere, microbiomes endosphere השורש. מידע זה יכול לשמש כדי לחקור את הרכב ואת הרב-גוניות של צמח-הקשורים קהילות מיקרוביאלי, מתאים לשימוש עם מגוון רחב של מיני צמחים.

לחקור את השורש Microbiome: שליפת נתונים הקהילה חיידקי מן האדמה, Rhizosphere, Endosphere שורש

מתוארים כאן הוא הליך סטנדרטי הפעלה פשוטה עבור הפרופיל microbiome באמצעות רצף מטאגנמית של 16S וניתוח באמצעות כלים זמינים בחופשיות. פרוטוקול זה יסייע לחוקרים החדשים לשדה microbiome, כמו גם אלה הדורשים עדכונים על שיטות להשיג פרופיל חיידקי ברזולוציה גבוהה יותר.

אנליזה microbiota באמצעות שני שלבים PCR ו-הדור הבא של 16 rRNA גן רצף

בחיפוש יסודי ביולוגיה של התא היא להגדיר את המנגנונים העומדים בבסיס זהותה של האברונים המרכיבים התאים האיקריוטים. כאן אנו מציעים שיטה לזהות את הגנים האחראים על תקינות מורפולוגית ופונקציונלית של אברונים צמחים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ואת הדור הבא של כלים רצף.

פלואורסצנטי, מיקרוסקופ הקרנת ואת הדור הבא הרצף: כלים שימושיים לזיהוי גנים המעורבים אברון Integrity

Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) היא שיטה לכימות מתילציה של ציטוזין באזורים גנומיים ממוקדים של עניין. שיטה זו משתמשת בהמרת ביסולפיט בשילוב עם הגברת PCR של אזורי יעד לפני ריצוף הדור הבא כדי לייצר כימות מוחלט של מתילציה של DNA ברמה ספציפית לבסיס.

ממוקד DNA מתילציה ניתוח על ידי רצף של הדור הבא

אנו מתארים פרוטוקול להגברת אתרי אינטגרציה רטרו-ויראלית מה-DNA הגנומי של תאים נגועים, ריצוף הצמתים המוגברים של הווירוס-מארח ולאחר מכן מיפוי רצפים אלה לגנום ייחוס. אנו מתארים גם טכניקות לכימות התפלגות אתרי האינטגרציה ביחס להערות גנומיות שונות באמצעות BEDTools.

הגברה, רצף הדור הבא, ואת הגנום מיפוי ה- DNA של אתרי אינטגרצית retroviral

למד אפיון microbiome בקרציות באמצעות ריצוף 16S rRNA מהדור הבא. שיטה זו מאפשרת זיהוי ברזולוציה גבוהה של קהילות מיקרוביאליות ותרומה להבנת אקולוגיית מחלות מועברות-נשא.

אפיון Microbiome שנתות על-ידי מטוסי אף-16 הדור הבא rRNA אמפליקון רצף

גלה סרטונים נוספים