Name: Adipo-ברור: רקמה ניקוי שיטה עבור הדמיה תלת-ממדית של רקמת שומן (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: למד את שיטת Adipo-Clear לניקוי רקמת שומן להדמיה תלת-ממדית ברזולוציה גבוהה. השיטה מאפשרת לחקור את הארגון המרחבי של תאי שומן ואת האינטראקציות ביניהם תוך שימור המבנה התלת-ממדי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים כריסטינה שממוקמים טאו טונג, אליסון צפון, מרכז המשאבים Bioimaging באוניברסיטת רוקפלר לקבלת סיוע ותמיכה. אנו מודים גם Xiphias ג ' נרל אלקטריק ז'ו לעריכת הסרט. עבודה זו נתמכה על ידי האדם הגבול המדע תוכנית הארגון (PC).

טיפול בבעלי חיים וניסוי בוצעו על פי הנהלים אושרה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים שימוש הוועדה ב אוניברסיטת רוקפלר.
1. רקמות הכנה
<ol><li>לבצע זלוף intracardiac רגיל ~ 20 מ של 1 x buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) ב 4 ° C עד שהדם יוסר לחלוטין הרקמה.</li>
	<li>לעבור את perfusate ~ 20 מ"ל של פתרון מקבע (4% paraformaldehyde (PFA) ב 1 x PBS) ב 4 ° C עד הצוואר ואת הזנב באופן משמעותי התקשח. התראה: PFA רעיל. יש להימנע ממגע עם העור, העיניים, קרום רירי. פתרונות צריכה להיעשות בתוך ברדס fume.</li>
	<li>לנתח את רפידות השמן עניין בקפידה כדי להסיר את משטח שמן כולו ללא פגיעה בו. השתמש הסתיימה בלאנט מלקחיים כדי להימנע צובט או לסחוט את הרקמה. להימנע מזיהום הרקמה ביתור עם כל פרווה.</li>
	<li>פוסט-לתקן את הרקמה 4% מחברים ב- PBS 1 x לילה ב 4 º C. עבור כל כרית השומן, שלאחר לתקן עם ~ 10 מ של פתרון קיבוע צינור חרוטי 15 מ"ל.</li>
	<li>לשטוף את הרקמה 3 פעמים (1 h כל) עם 1 x PBS בטמפרטורת החדר (RT).</li>
	<li>לאחסן את הרקמה עבור לטווח קצר (עד שבועיים) 1 x PBS ב 4 ° C, מוגן מפני אור. לאחסון לטווח ארוך (למשל, 1-2 שנים), לעבור את המאגר PBS x 1 עם אזיד הנתרן 0.05% (כמו כחומר משמר). התראה: אזיד הנתרן הוא רעיל מאוד כאשר בלע בעל פה או נספג דרך העור. אזיד הנתרן פתרונות (ב-5% או יותר) צריך להיות מטופל ברדס fume מרוכזת.</li>
</ol>2. Delipidation, Permeabilization
עיתוי: 1-2 ימים
<ol><li>הכנת 20%, 40%, 60% ו- 80% מתנול מעבר צבע עם מאגר B1n, (טבלה 1) (v/v), למשל, עבור מאגר 20% מתנול/B1n, לערבב 20 מ של מתנול 80 מ ל מאגר B1n. לאחסן כל מאגרי ב 4 º C. גליצין קריסטלים לזרז ממאגרים מתנול/B1n 60% ו- 80% עקב הרוויה. הימנעו הקריסטלים; השתמש הפתרון נוזלי שוטף הבאים. התראה: מתנול הוא הפכפך, מגרה. הימנע העור או קשר עין.</li>
	<li>הסר בעדינות את השיער הדגימה במיקרוסקופ לנתיחה. כל השיער, מוך או פסולת המצורפת המדגם יגרום צללים במהלך דימות. להעביר את הדגימה נקי לתוך צינור חדש.</li>
	<li>לבצע את כל הצעדים הבאים על קרח או ב 4 ° C אלא אם צוין אחרת. עבור מדגמים קטנים (למשל, אחורי רפידות שומן תת עורית/perigonadal של עכברים צעירים רזה), השתמש צינורות microcentrifuge 2 mL מ ל 1.6 של הפתרון. עבור מדגמים גדולים או דגימות עם תוכן שומני גבוהה (למשל, רפידות השמן מן העכברים המשמינים), השתמש מ ל צינורות עם 4 מ"ל של הפתרון.<ol>
<li>מקום הצינורות המכילים את הדגימות בצורה אופקית על תפקודי לב / נשימה שוכן בגובה ~ 100 סל"ד. ודא כי הדגימות יכול לנוע בחופשיות בתוך הצינור.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מייבשים את הדגימה בסדרה מדורגת של 20%, 40%, 60%, 80% ו- 100% מתנול/B1n מאגר עבור הזמן המצוין (טבלה 2). מזער את הפתרון carry-over.</li>
	<li>Delipidate הדגימה עם 100% דיכלורומתאן (DCM) (3 פעמים), כל אחד עם זמן הדגירה שצוינו בטבלה 2. הדגימה יש לשקוע לתחתית הצינור בסוף מנקי DCM השני והשלישי. אם לא, ולהאריך את זמן הדגירה כדי להבטיח delipidation מלאה (למשלמ- 30 דקות להאריך h 1-2). התראה: צריך להיות מטופל DCM בתוך ברדס fume. השתמש מיכלי זכוכית צינורות microcentrifuge ואחסון אשר עשויות פוליפרופילן עבור incubations. הצינורות microcentrifuge אין להשתמש לאחסון לטווח ארוך של DCM. צלחות פטרי, פיפטות סרולוגית שנעשו מפוליסטירן אינם תואמים DCM. DCM הוא המרבץ. להעביר את הדגימה אל פתרון טריים במהירות כדי למנוע לייבוש.</li>
	<li>לשטוף פעמיים עם 100% מתנול עבור הזמן המצוין (טבלה 2).</li>
	<li>אופציונלי: אם המדגם הוא לא perfused היטב, הצבע של המוגלובין של כדוריות דם אדומות הנותרים עלול לגרום autofluorescence חזק. אקונומיקה עם 5% H2O2 ב מתנול (1 נפח של 30% H2O2 כדי כרכים 5 של מתנול) בן לילה ב 4 º C.</li>
	<li>נתרענן המדגם בסדרה מאגר מתנול הפוכה/B1n: 80%, 60%, 40%, 20% מתנול/B1n ו- 100% B1n מאגר (פי 2) עבור הזמן המצוין (טבלה 2).</li>
	<li>לשטוף את הדגימה עם מאגר PTxwH (טבלה 1) עבור 2 h-RT.</li>
	<li>לאחסן את הדגימה delipidated במאגר PTxwH ב 4° C (עד 1 שנה) או להמשיך מיד לשלב immunostaining.</li>
</ol>3. כל הר Immunostaining
עיתוי: 8-10 ימים
הערה: כל השלבים הבאים צריך להתבצע ב RT אלא אם כן צוין אחרת, עם טלטול והגנה מפני אור. עבור מדגמים קטנים, השתמש צינורות microcentrifuge 2 mL מ ל 1.6 של פתרון. עבור מדגמים גדולים, להשתמש מ ל צינורות עם 4 מ"ל של פתרון. מומלץ לאמת תחילה את הנוגדנים על חתיכות קטנות של רקמות או מקטעי רקמת שטופלו מתנול.
<ol><li>לדלל נוגדן ראשוני במאגר PTxwH לריכוז המומלץ. Centrifuge הפתרון מדולל נוגדנים ב ~ 20,000 g x 10 דקות למנוע מציגה פוחת משקעים נוגדן או הסיכומים.</li>
	<li>תקופת דגירה הדגימה delipidated עם הפתרון נוגדן ראשוני של הזמן המצוין (טבלה 2).</li>
	<li>לשטוף את הדגימה עם מאגר PTxwH בסדרה של צעדים דגירה: 5 דקות, 10 דקות, 15 דקות, 20 דקות, 1 h, 2 h, 4 שעות ו בן לילה.</li>
	<li>לדלל הנוגדן משני במאגר PTxwH לריכוז המומלץ. Centrifuge הפתרון מדולל נוגדנים ב x ~ 20,000 g 10 דקות למנוע מציגה פוחת משקעים נוגדן או הסיכומים. הערה: כדי להימנע רקע הנגרמת על ידי רקמת autofluorescence, נוגדנים משניים מצומדת עם fluorophores הפולטות אור אזורים מרחיקת אדום ואדום מומלץ. בהתאם למספר קווי לייזר זמין על המיקרוסקופ, יכול לדימות עד 3-4 סמני בו-זמנית בדוגמא אחת.</li>
	<li>תקופת דגירה הדגימה עם הפתרון נוגדנים משניים של הזמן המצוין (טבלה 2).</li>
	<li>לדוגמה תשטוף עם מאגר PTxwH בסדרה של צעדים דגירה: 5 דקות, 10 דקות, 15 דקות, 20 דקות, 1 h, 2 h, 4 שעות ו בן לילה.</li>
	<li>אופציונלי: עבור סוגי רקמות הם שבירים, לתקן את הרקמה ויטראז'ים עם 4% מחברים ב- 1 x PBS לילה ב 4 ° C כדי לעזור לשמר את רקמת מורפולוגיה. הערה: שלב זה עשוי להגדיל את הרקע הדמיה. אין צורך לבצע שלב זה של רקמת שומן.</li>
	<li>לשטוף את הדגימה עם PBS 1 x בסדרה של צעדים דגירה: 5 דקות, 10 דקות ו- 30 דקות.</li>
	<li>הסר בעדינות מוך הדגימה במיקרוסקופ לנתיחה.</li>
</ol>4. רקמות סליקה
עיתוי: 1-2 ימים
<ol><li>אופציונלי: להטביע את הדגימה agarose כדי להקל על מדגם הרכבה של מיקרוסקופ אור גיליונות. הערה: שלב זה מומלץ בחום רקמת שומן לייצב את צורתה במהלך דימות.<ol>
<li>הכינו את הפתרון ההטבעה עם 1% agarose ב x 1 PBS (w/v). מגניב הפתרון ההטבעה ~ 40 ° C כדי למנוע חשיפת המדגם לחום מוגזם.</li>
		<li>למקם את הדגימה נקי לתוך תבנית (למשל, פטרי או שקילה הסירה) ולסדר אותו אל המיקום הרצוי. הימנע כל דחויים נוזלי. שופכים בעדינות את הפתרון ההטבעה המדגם. להימנע בועות אוויר.</li>
		<li>תן את agarose באופן מלא לחזק ב RT. לחתוך החוצה גוש המכיל את הדגימה. הערה: כל השלבים הבאים כולל לילה incubations צריכה להתבצע ב- RT, עם טלטול והגנה מפני אור. עבור מדגמים קטנים, השתמש צינורות microcentrifuge 2 mL מ ל 1.6 של פתרון. עבור מדגמים גדולים, להשתמש מ ל צינורות עם 4 מ"ל של פתרון.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מייבשים את הדגימה מתנול הצבע ב- H2o: 25%, 50%, 75% ו 100% (3 פעמים) עבור הזמן המצוין (טבלה 2). הערה: מדגם ניתן יהיה להשאיר למשך הלילה בשלב 100% מתנול.</li>
	<li>דגירה המדגם ב- 100% DCM עבור h 1 ברעידות (3 פעמים). לדוגמה יש לשקוע לתחתית הצינור בסוף כל כביסה DCM. אם לא, ולהאריך את זמן הדגירה כדי להבטיח הסרה מלאה של מתנול. לדוגמה ניתן יהיה להשאיר למשך הלילה בשלב DCM 100%.</li>
	<li>דגירה המדגם של אתר dibenzyl (אנגלית) בן לילה ברעידות מתון כדי להשיג שבירה תואמים. הערה: מדגם בסופו של דבר יהפוך שקוף בהאור הנראה. שים לב: מדיניות ה. הוא דבר מסוכן הימנע מכל מגע עם העור. בתוך ברדס fume עם כפפות שכבות כפול להתמודד עם זה... למחוק את הכפפות ברגע מזוהם עם אנגלית. השתמש מיכלי זכוכית עבור אחסון של microcentrifuge צינורות (פוליפרופילן) עבור incubations. הצינורות microcentrifuge אין להשתמש לאחסון לטווח ארוך של אנגלית. צלחות פטרי, פיפטות סרולוגית שנעשו מפוליסטירן אינן תואמות עם אנגלית. נקה כל נוזלים עם 100% אתנול.</li>
	<li>דגירה הדגימה עם אנגלית טריים עם קלה רועד עבור חנות ה 2 דגימת ה-RT בחושך או להמשיך ישירות הדמיה. הערה: דגימות מומלצים לדימות תוך חודש. למרות fluorophores מסוימים יציב יותר מאשר לאחרים, אחסון לטווח ארוך של הדגימות בשלב זה לא מומלץ.</li>
</ol>5. מיקרוסקופ
<ol><li>הדמיה עם מיקרוסקופ אור גיליונות התואמת אנגלית. הערה: המטרות רק כי הם מאושר דימות מבוסס הממס האורגני והתאמתי מקדם שבירה של אנגלית יכול לשמש כמו טבילה מטרות בתחום ההדמיה מדיניות ה-שקוע.<ol>
<li>הר מדגם agarose-מוטבע על גבי בעל שיכול למנוע תנועה במהלך דימות. לטבול את הדגימה לתא יהיה מלא.</li>
		<li>לאסוף ערימה-z כיסוי המדגם כולו (למשל, 1-2 X הגדלה) כדי להשיג כל רקמה/מבנה ההפצה של סמן עניין.</li>
		<li>לעבור אובייקטיבית עם הגדלה גבוהה יותר (למשל, 4-12 X הגדלה) כדי להגדיל האזורים לעניין התמונה מבני נתונים היסטוריים. הערה: קולגן היא לתורם המרכזי מטריצה חוץ-תאית של רקמת שומן, המקיף את תאי השומן כל13. קולגן יש ספקטרום פליטה אופייני הנע בסביבות 400 nm 550 ננומטר14. הדמיה הדגימה עם קו לייזר 488 (ירוק) ואיסוף האור הנפלט בטווח אורך גל שנמצאת בתוך ספקטרום הפליטה של קולגן (למשל, 525-550 ננומטר) תספק את האות autofluorescence רקמות, אשר היה בעבר הראו ניסחו תאי השומן מתאר ורקמת הכולל אדריכלות12.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הדמיה עם הפוך קונאפוקלית או מיקרוסקופ שני הפוטונים.<ol>
<li>למקם את הדגימה agarose-מוטבע שקופית קאמרית עם חלק תחתון זכוכית בלי לגעת בכל חלקי פלסטיק (או הקאמרית של דימות אחרים התואמים ליהיה זה יכול לאטום). ודא כי מדיניות ה לא ידלוף.</li>
		<li>לבחור את המטרות עם עובד למרחקים ארוכים כדי להשיג חדירה עמוקה יותר. הערה: הדמיה צריך להיעשות עם מיקרוסקופ קונפוקלי או שני הפוטונים הפוך דרך קרקעית זכוכית של השקופית קאמרית. יש למנוע מגע ישיר בין המדגם לבין טובלים המטרות כי לא מוצעות עבור דימות מבוסס מדיניות ה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3934003/">What We Talk About When We Talk About Fat.</a> Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).</li>
<li>Barbatelli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emergence+of+cold-induced+brown+adipocytes+in+mouse+white+fat+depots+is+determined+predominantly+by+white+to+brown+adipocyte+transdifferentiation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">The emergence of cold-induced brown adipocytes in mouse white fat depots is determined predominantly by white to brown adipocyte transdifferentiation.</a> American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 298 (6), E1244-E1253 (2010).</li>
<li>Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+adipogenesis+during+white+adipose+tissue+development%2C+expansion+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration.</a> Nature Medicine. 19 (10), 1338-1344 (2013).</li>
<li>Bartness, T. J., Liu, Y., Shrestha, Y. B., Ryu, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+innervation+of+white+adipose+tissue+and+the+control+of+lipolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">Neural innervation of white adipose tissue and the control of lipolysis.</a> Frontiers in Neuroendocrinology. 35 (4), 473-493 (2014).</li>
<li>Morrison, S. F., Madden, C. J., Tupone, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+Neural+Regulation+of+Brown+Adipose+Tissue+Thermogenesis+and+Energy+Expenditure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Central Neural Regulation of Brown Adipose Tissue Thermogenesis and Energy Expenditure.</a> Cell Metabolism. 19 (5), 741-756 (2014).</li>
<li>Xue, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-Independent+Angiogenesis+in+Adipose+Tissues+during+Cold+Acclimation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-Independent Angiogenesis in Adipose Tissues during Cold Acclimation.</a> Cell Metabolism. 9 (1), 99-109 (2009).</li>
<li>Shimizu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+rarefaction+mediates+whitening+of+brown+fat+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Vascular rarefaction mediates whitening of brown fat in obesity.</a> The Journal of Clinical Investigation. 124 (5), 2099-2112 (2014).</li>
<li>Abe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+reconstruction+of+brain+section+images+for+creating+axonal+projection+maps+in+marmosets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">3D reconstruction of brain section images for creating axonal projection maps in marmosets.</a> Journal of Neuroscience Methods. 286, 102-113 (2017).</li>
<li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4537058/">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li>
<li>Renier, N., Wu, Z., Simon, D. J., Yang, J., Ariel, P., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iDISCO%3A+A+Simple%2C+Rapid+Method+to+Immunolabel+Large+Tissue+Samples+for+Volume+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">iDISCO: A Simple, Rapid Method to Immunolabel Large Tissue Samples for Volume Imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li>
<li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+Brain+Activity+by+Automated+Volume+Analysis+of+Immediate+Early+Genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes.</a> Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).</li>
<li>Chi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Adipose+Tissue+Imaging+Reveals+Regional+Variation+in+Beige+Fat+Biogenesis+and+PRDM16-Dependent+Sympathetic+Neurite+Density%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density.</a> Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).</li>
<li>Khan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Dysregulation+and+Adipose+Tissue+Fibrosis%3A+Role+of+Collagen+VI%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Metabolic Dysregulation and Adipose Tissue Fibrosis: Role of Collagen VI.</a> Molecular and Cellular Biology. 29 (6), 1575-1591 (2009).</li>
<li>Croce, A. C., Bottiroli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autofluorescence+Spectroscopy+and+Imaging%3A+A+Tool+for+Biomedical+Research+and+Diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Histochemistry+EJH%22%5BJournal%5D)">Autofluorescence Spectroscopy and Imaging: A Tool for Biomedical Research and Diagnosis.</a> European Journal of Histochemistry EJH. 58 (4), (2014).</li>
<li>Oh, D. Y., Morinaga, H., Talukdar, S., Bae, E. J., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+Macrophage+Migration+Into+Adipose+Tissue+in+Obese+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Increased Macrophage Migration Into Adipose Tissue in Obese Mice.</a> Diabetes. 61 (2), 346-354 (2012).</li>
<li>Cinti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocyte+death+defines+macrophage+localization+and+function+in+adipose+tissue+of+obese+mice+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Adipocyte death defines macrophage localization and function in adipose tissue of obese mice and humans.</a> Journal of Lipid Research. 46 (11), 2347-2355 (2005).</li>
<li>Wang, W., Seale, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+brown+and+beige+fat+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Control of brown and beige fat development.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (11), 691-702 (2016).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

Adipo-ברור היא שיטה פשוטה וחזק שהבהרת רקמת שומן, אשר ניתן בקלות לבצע התקנה במעבדה רגילה. לעומת שיטות ניקוי ממס מבוסס אחרות כגון iDISCO / iDISCO10,11,12, פנוי Adipo ממוטבת במיוחד לניקוי רקמת שומן ורקמות אחרות עם תכולת שומן גבוהה. הצעד delipidation לחלוטין מסיר שומנים שומן, ולכן מקלה על immunolabeling לאורך כל הרקמה כל, בעיקר ממזער את פיזור האור, ומאפשר הדמיה end-to-end ללא אובדן של XY רזולוציה. בנוסף זריחה אור גיליונות מיקרוסקופי...

עד לאחרונה, רקמת שומן היה יזום של כמו אוסף אמורפי של תאי שומן. במהלך העשורים האחרונים, ההבנה שלנו גדלה מתוחכמים יותר, עם שומן שהוכר להיות איבר מורכבים המכילים סוגים שונים של adipocytes, כמו גם סימנים מקדימים adipocyte, תאים חיסוניים, fibroblasts, להערכת ו עצבים תחזיות. אינטראקציות בין תאים אלה שוכנות שומן יש מבטאים את ההשפעות על רקמת שומן, הפיזיולוגיה organismal, פתופיזיולוגיה1. למרות מחקרים המתעוררים יש פרם חשוב המנגנונים המולקולריים שבבסיס אינטראקציות מסוימות, הבנה מקיפה דורש פרופילים מבניים אמין של הרקמה כולו בתלת מימד (3D).
הידע הנוכחי שלנו של רקמת שומן מורפולוגיה מבוססת במידה רבה על ניתוח היסטולוגית סעיפים דקים (5 μm) עם הדמיה ההגדלה גבוהה יחסית (יותר מ 10 X)2,3. עם זאת, גישה זו יש מספר מגבלות משמעותיות. מבנים filamentous הראשון, מורכבות כגון העצבים הסימפתטית, להערכת את, אשר ידועים תפקיד חשוב הפונקציה אדיפוז4,5,6,7, שקשה להעריך באמצעות סעיפים דקים. שנית, בשל צורתה לכאורה אמורפי ואת חוסר נציג יחידות המבניים להתמקד, קשה להעריך את רקמת שומן מבנים המבוססת רק על סעיף מכתים. שלישית, רקמת שומן יש תוכן שומנים בדם גבוהה מאוד, יצירת אתגרים בהשגת עקבי מקטעים טורי המתאימים לטיפול שיקום אנטומי תלת-ממד, שיטה המקובלת ללמוד כל המוח מורפולוגיה8. בהינתן הגורמים הללו, יש צורך בגישה כולה-הר זה יכול לספק לוויזואליזציה תלת-ממדית של דיפו אדיפוז כולו תוך השגת עדיין את הרזולוציה הסלולר.
נפחי הדמיה ממוחשבת של איבר שלם הוא מאתגר בשל ההשפעות טשטוש של פיזור אור. המקור העיקרי של פיזור אור ברקמות ביולוגיות נובע ממשקים השומנים-מימית. למרות מאמצי ההכחדה של פיזור על-ידי הסרת שומנים כבר מתמשך עבור מעל למאה שנה, היו מספר רב של החידושים האחרונים9. אחת השיטות ניקוי רקמות פיתח כזה היא מאופשר immunolabeling הדמיה תלת-ממדית של איברים הממס-והפנים (iDISCO / iDISCO +)10,11. עם זאת, רקמת שומן מהווה אתגר מסוים נתון רמה גבוהה של שומנים, ולכן, שינויים נוספים iDISCO / iDISCO + פרוטוקול נדרשים באופן מלא תמצית ליפידים תוך הגנה על הרקמה מפני קריסה. פרוטוקול ששונה שפיתחנו, כעת נקרא Adipo-נקי, מעסיקה מבוססת על מתנול/דיכלורומתאן delipidation של רקמת שומן כדי להשיג שקיפות אופטימלית מתאים דימות ברזולוציה גבוהה הנפחי12. כי delipidation צעד בעיקר מרווה endogenously הביע פלורסנט חלבונים כמו GFP ו- RFP, ויזואליזציה של חלבונים כזאת חייבת להיות מושגת על ידי immunolabeling. בסך הכל, פרוטוקול זה פשוט וחזק יכול להיות מיושם ללמוד רקמות ברמת הארגון של תאי שומן-תושב, עקיבה השושלת adipocyte ובתאים, מורפוגנזה אדיפוז במהלך הפיתוח.

<table><tbody><tr><td>1x פוספט חוצץ</td><td>מלח קורנינג</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P6148-1KG</td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>A412SK-4</td><td></td></tr><tr><td>טריטון X-100</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>X100-500 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>טווין 20</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P2287-500 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>הפרין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>H3393-100KU</td><td></td></tr><tr><td>דיכלורומתאן</td><td>סיגמא אולדריץ</td><td>' 270991</td><td></td></tr><tr><td>מי חמצן 30%</td> <td>פישר סיינטיפיק</td><td>325-100</td><td></td></tr><tr><td>בנזיל אתר</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>108014</td><td></td></tr><tr><td>אגרוז</td><td>Invitrogen</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אזיד</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>71289-5G</td><td></td></tr><tr><td>גליצין</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-1</td><td></td></tr><tr><td>ארנב פוליקלונלי אנטי-טירוזין הידרוקסילאז</td><td>Millipore</td><td>AB152</td><td>1:200 דילול</td></tr><tr><td>עז פוליקלונלי אנטי-CD31/PECAM-1</td><td>R& D Systems</td><td>AF3628</td><td>ריכוז סופי של 2 ומיקרו; g/mL</td></tr><tr><td>עכברוש חד שבטי אנטי-CD68, שיבוט FA-11</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA1957</td><td>ריכוז סופי של 2 ומיקרו; g/mL</td></tr><tr><td>דונקי אנטי-ארנב IgG (H+L) Alexa Fluor 647</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-605-152</td><td>ריכוז סופי של 5-10 ומיקרו; גרם/מ"ל</td></tr><tr><td>חמור נגד עזים IgG (H+L) Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen</td><td>A11077</td><td>ריכוז סופי של 5-10 ומיקרו; g/mL</td></tr><tr><td>חמור נגד חולדות IgG (H+L) Alexa Fluor 647</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>712-605-153</td><td>ריכוז סופי של 5-10 ומיקרו; g/mL</td></tr><tr><td>תא הדמיה</td><td>ibidi</td><td>80287</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ גיליון אור</td><td>LaVision BioTec</td><td>Ultramicroscope II</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת הדמיה</td><td>LaVision BioTec</td><td>Imspector תוכנת</td><td></td></tr><tr><td>הדמיה מיקרוסקופיה</td><td>Bitplane</td><td>Imaris</td><td></td></tr></tbody></table>

adipo-ברור: רקמה ניקוי שיטה עבור הדמיה תלת-ממדית של רקמת שומן

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

רקמת שומן ממלאת תפקיד מרכזי אנרגיה הומאוסטזה ומתת הומיאותרמיות. הוא מורכב מסוגים שונים של adipocytes, וכן סימנים מקדימים adipocyte תאים חיסוניים, fibroblasts, כלי דם, עצבים תחזיות. למרות שליטה מולקולרית של התא סוג מפרט ואת האינטראקציה תאים אלה יש כבר יותר ויותר התחום, הבנה מקיפה יותר של תאים אלה שוכנות שומן יכולה להיות מושגת דמיין שלהם הפצה ואדריכלות לאורך כל הרקמה שלם. אימונוהיסטוכימיה קיימות גישות immunofluorescence לנתח היסטולוגיה אדיפוז להסתמך על סעיפים פרפין-מוטבע דק. עם זאת, חלקים דקים ללכוד רק חלק קטן של רקמה; כתוצאה מכך המסקנות עלולים להיות מוטים על ידי ניתוח מה החלק של רקמות. לכן פיתחנו של רקמת שומן פינוי טכניקה, Adipo-נקי, להתיר ויזואליזציה תלת-ממדית מקיפה דפוסי מולקולרית, תאית ברקמות adipose שלם. Adipo-ברור היה ממאמרו של iDISCO / iDISCO +, עם שינויים מסוימים שבוצעו כדי להסיר לחלוטין את השומנים מאוחסן ברקמות תוך שמירה על מורפולוגיה רקמה מקורית. בשילוב עם מיקרוסקופ אור גיליונות פלורסצנטיות, נדגים כאן את השימוש בשיטת Adipo פנוי כדי לקבל תמונות ברזולוציה גבוהה הנפחי של רקמת שומן כולו.

פנוי Adipo מוכן כל שומן רפידות יכול לדימות תלת-ממד כדי לנתח כמה אינטראקציות סלולרי ומורפולוגיה רקמות מושפעות בארה ב רזה והשמנה. בשיטה זו ניתן להחיל בקלות כדי לנתח מבנה אדיפוז כללי על ידי איסוף האות autofluorescence רקמות בערוץ ירוק. אנחנו בעבר הראו כי autofluorescence את אות בכיסויי אדיפוז בחיוב עם perilipin מכתים, סמן נפוץ חלוקה לרמות adipocytes בוגר12. לדוגמה, סריקה האחורי תת עורית השמן פנקס (psWAT) באמצעות מיקרוסקופ אור גיליונות עם הגדלה נמוכה (1.3 X) מציג הארגו...

בשל התכנים שומנים גבוהה בדם, מאתגרת רקמת שומן להמחיש היסטולוגית בשיטות מסורתיות. Adipo-ברור הוא רקמה פינוי טכניקה המאפשרת תיוג חזקים, דימות ברזולוציה של פלורסנט הנפחי של רקמת שומן. כאן, אנו מתארים את שיטות הכנת הדוגמא, רעלני, מכתים, ניקוי של הרכבה עבור הדמיה.

Adipo-ברור: רקמה ניקוי שיטה עבור הדמיה תלת-ממדית של רקמת שומן

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של רקמת השומן, כגון כיצד רכיבים שונים של רקמת השומן מתקשרים ברקמה שלמה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מסירה לחלוטין את עודפי השומנים המאוחסנים ברקמת השומן תוך שמירה על הארכיטקטורה התלת מימדית שלה. בעוד ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי הארגון התלת מימדי של רקמת השומן, ניתן ליישם אותה בדרך כלל גם על רקמות אחרות עם תכולת שומנים גבוהה כגון בלוטת זיכרון ובלוטות לימפה.הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון ששלבי הניקוי והפינוי דורשים זמני דגירה מספיקים, שיכולים להיות קשים לקביעה. התחל בשימוש במלקחיים קהים כדי לנתח את כרית השומן המעניינת ממודל חיה טרי. הסר בזהירות את כל כרית האופנה מבלי לצבוט או לסחוט את הרקמה או לזהם את הרקמה המנותחת בפרווה.מניחים את כרית השומן בכ-10 מיליליטר של תמיסת קיבוע בצינור חרוטי של 15 מיליליטר ומקבעים בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת לאחר שטיפת הדגימה עם PBS, הסר בעדינות כל פסולת מהדגימה תחת מיקרוסקופ דיסקציה. שיער, מוך או פסולת אחרת המחוברת לדגימה יגרמו לצללים במהלך ההדמיה.העבירו את הדגימה הנקייה לצינור פוליפרופילן המכיל מאגר B1N קר כקרח, 20 אחוז מתנול. הנח את הצינור המכיל את הדגימה בצורה אופקית על שייקר מסלול, הגדר אותו 100 סל"ד ונער במשך 30 דקות עד שעה בהתאם לגודל הדגימה. ודא שהדגימות יכולות לנוע בחופשיות בתוך הצינור.המשך לייבש את הדגימות באמצעות סדרה מדורגת של 40 אחוז, 60 אחוז ו-80 אחוז מתנול במאגר B1N ואחריו 100 אחוז מתנול. צמצם את פתרון ההעברה. לאחר התייבשות, החלף את תמיסת המתנול של 100 אחוז ב-100 אחוז דיכלורומתאן או DCM כדי להפחית את הדגימה.חזור על הכביסה פעמיים בהתאם לזמני הדגירה המפורטים בטבלה 2. הדגימה צריכה לשקוע לתחתית הצינור בסוף שטיפת ה-DCM השנייה והשלישית. אם לא, האריכו את זמן הדגירה כדי להבטיח הסרת שומנים מלאה.לאחר הפחתת שומנים יש לשטוף פעמיים עם 100 אחוז מתנול למשך הזמן המצוין בטבלה 2. החזר את הדגימה לסדרת חיץ מתנול B1N הפוכה לזמנים המצוינים בטבלה 2. לאחר החזרת הנוזלים, שטפו את הדגימה עם מאגר PTXWH למשך שעתיים בטמפרטורת החדר.הדגימה מוכנה כעת לצביעה חיסונית או שניתן לאחסן אותה במאגר PTXWH בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד שנה. ראשית, יש לדלל את הנוגדן העיקרי במאגר PTXWH לריכוז המומלץ. לאחר מכן, צנטריפוגה את תמיסת הנוגדנים המדוללת ב-20 אלף גרם למשך 10 דקות כדי למנוע הכנסת משקעים או הצטברות נוגדנים.חשוב לבחור נוגדנים ראשוניים מתאימים התואמים לטיפול במתנול ו-DCM. יש לאמת נוגדנים חדשים עם חתיכות קטנות של רקמה או עם קטעי רקמה שטופלו במתנול. דגרו את הדגימה נטולת השומנים עם תמיסת הנוגדנים העיקרית למשך 3 עד 5 ימים בהתאם לגודל הדגימה.לאחר הדגירה הראשונית יש לשטוף את הדגימה במספר שינויים של מאגר PTXWH. למחרת, יש לדלל את הנוגדן המשני במאגר PTXWH לריכוז המומלץ. צנטריפוגה תמיסת הנוגדנים המדוללת כמו קודם.דגרו את הדגימה עם תמיסת הנוגדנים המשנית למשך 3 עד 5 ימים בהתאם לגודל הדגימה. שוב, שטפו את הדגימה עם מאגר PTXWH בסדרה של שלבי דגירה כמו קודם. למחרת, שטפו את הדגימה עם 1XPBS למשך 5 דקות, 10 דקות ולאחר מכן 30 דקות.הטמע רקמת שומן באגרוז כדי להקל על הרכבת הדגימה למיקרוסקופ גיליון קל. ראשית, הכינו את תמיסת ההטבעה עם 1 אחוז אגרוז ב-1XPBS. מצננים את תמיסת ההטבעה לסביבות 40 מעלות צלזיוס כדי למנוע חשיפת הדגימה לחום מוגזם.תוך הימנעות מהעברת נוזלים, הניחו את דגימת הרקמה הנקייה בתבנית וסדרו אותה למיקום הרצוי. לאחר מכן שפכו בעדינות את תמיסת ההטבעה על הדגימה תוך הימנעות מבועות אוויר. יש להעביר את כל בועות האוויר לפריפריה לפני שהאגרוז מתמצק.לאחר שהאגרוז התמצק במלואו, גזרו גוש המכיל את הדגימה. העבירו את הדגימה ל-25 אחוז מתנול במים, הגנו מפני אור ודגרו עם טלטול למשך הזמן המוצג בטבלה 2. המשך לייבש את הדגימה דרך שיפוע מתנול.דגרו את הדגימה ב-100 אחוז DCM למשך שעה אחת עם ניעור. דגימות DCM Wash מתייבשות בקלות באוויר, מה שישפיע על בהירות הדגימה ויגרום לתמונות מטושטשות. חשוב להעביר דגימות במהירות לתמיסה טרייה כדי למנוע התייבשות.הדגימה צריכה לשקוע לתחתית הצינור בסוף כל שטיפת DCM. דגרו את הדגימה באתר Dibenzyl או DBE למשך הלילה עם טלטול קל כדי להשיג התאמת מקדם שבירה. הדגימה תהפוך בסופו של דבר לאור שקוף ובלתי נראה.למחרת, לאחר דגירה של הדגימה עם DBE טרי עם ניעור קל למשך שעתיים, אחסן את הדגימה בטמפרטורת החדר בחושך או המשך ישירות להדמיה. כדי לדמות את הדגימה עם מיקרוסקופ גיליון אור התואם ל-DBE, הרכיב את הדגימה המוטמעת של אגרוז על מחזיק שיכול למנוע תנועה במהלך ההדמיה. כדי לדמות את הדגימה עם מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך או שני פוטונים, הנח את הדגימה המוטמעת באגרוז בשקופית תא עם תחתית זכוכית.סריקת כרית שומן תת עורית אחורית באמצעות מיקרוסקופ גיליון בהיר עם הגדלה נמוכה מראה את הארגון האוני של אדיפוציטים. מידע מפורט יותר כגון גודל האדיפוציטים יכול להיחשף על ידי התקרבות לאזורי העניין עם הגדלה גבוהה יותר. כרית שומן תת עורית אחורית מוכתמת בטירוזין הידרוקסילאז, סמן למערכת העצבים הסימפתטית, צולמה על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי של יריעות קלות.צביעת TH חשפה מבנים שנראים כמו צרורות עצבים גדולים כפי שמצוין על ידי החץ כאן. עצבוב כלי דם כמו גם ארבוריזציה סופית צפופה בפרנכימה של הרקמה מתגלים גם על ידי צביעת TH. באמצעות מולקולת הידבקות תאי אנדותל טסיות או PCAM1 הידוע גם בשם CD31 כסמן לסימון כלי דם, נצפה כי כל האדיפוציטים נמצאים במגע עם הנימים בכל הרקמה התומכים בביקוש הגבוה להחלפת חומרים מזינים וחמצן יעילים בשומן.לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של השומן לחקור שאלות נוספות כגון מורפוגנזה מוקדמת של רקמות ומיפוי גורל של אבות אדיפוציטים. ניתן ליישם אותו גם כדי לחקור את ההיסטולוגיה של רקמת השומן האנושית. אל תשכח שעבודה עם פרפורמלדהיד, מתנול, דיכלורומתאן ואתר דיבנזיל עלולה להיות מסוכנת ביותר ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון שימוש במכסה אדים וציוד מגן אישי בעת ביצוע הליך זה.

adipo-clear-tissue-clearing-method-for-three-dimensional-imaging

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כדי לקבל תמונות ברזולוציה גבוהה של תאים המסומנים בפלורסנט בתוך רקמות גדולות, באופן אידיאלי, יש לדמות את הדגימות הביולוגיות ללא חתך. 3DISCO הוא הליך ניקוי רקמות פשוט המבוסס על דגירה רציפה עם ממיסים אורגניים. עם הניקוי, האיברים הופכים שקופים ומאפשרים סריקת לייזר מקצה לקצה של הדגימה.

הדמיה כחכחה מערכות ביולוגיות שלמות ברמה תאית על ידי 3DISCO

בשל קשר דרסטי והשלילי בין השמנת יתר ומחלות רקע אחרים, מחקר על תפקיד השומן משחק במחלה ועל בריאות כללית היא מוצדקת. אנו מציגים פרוטוקול לבידוד והכריתה של מחסני שומן ומאפשרים לחקר השומן באמצעות באתר ובשיטות חוץ גופית.

לוקליזציה, זיהוי, וכריתה של בסיס מיון Murine שומן

המוקד של המחקר הנוכחי הוא להמחיש את כולה-הר immunostaining והדמיה הטכניקה כשיטת אידיאלי עבור הדמיה תלת-ממדית של רכיב סלולרי ואדריכלות רקמת שומן.

הדמיה של מבנה שומן לבן תלת-ממד באמצעות צביעת כולה-הר

היווצרות כלי דם חדשים, העצבוב סימפטי לשחק תפקיד מרכזי ב שיפוץ רקמת שומן. עם זאת, נותרו בעיות טכניות ב להמחיש ומדידת באופן כמותי את רקמת שומן. כאן אנו מציגים פרוטוקול בהצלחה תווית ולהשוות באופן כמותי את הצפיפויות של כלי הדם, סיבי עצב ברקמות שומן שונות.

שיתוף צביעת כלי הדם, סיבי עצב ברקמת שומן

השילוב של תיוג נוגדנים, ניקוי אופטי, ומיקרוסקופ אור מתקדם מאפשר ניתוח תלת מימדי של מבנים או איברים מושלמים. המתואר כאן היא שיטה פשוטה לשלב אימונויניום של פרוסות כליות עבות, ניקוי אופטי עם cinnamate אתיל, והדמיה מיקוד המאפשר הדמיה וכימות של מבנים תלת ממדיים כליה.

ניקוי אופטי ודימות רקמות כליות של אימונוולילד

כאן, אנו מתארים שיטת סליקה פשוטה, זולה ומהירה כדי לפתור את המבנה 3D של רקמת שומן לבנה עכבר ואדם באמצעות שילוב של סמנים כדי לדמיין כלי דם, גרעין, תאים חיסוניים, נוירונים, וחלבונים מעיל שומנים-טיפות על ידי הדמיה פלואורסצנטית.

חקר מבנה רקמת שומן על ידי ניקוי מתילסיילאט והדמיה תלת-ממדית

פרדיפוציטים מבודדים מהמקטע הווסקולרי של רקמת השומן החום הבין-סקפולרי מעכברים שזה עתה נולדו ומתמיינים לתאים שצוברים טיפות שומנים, מבטאים סמנים מולקולריים ומראים את המורפולוגיה המיטוכונדריאלית של אדיפוציטים חומים בוגרים. תאים אלה מנותחים עוד יותר על ידי immunofluorescence ומיקרוסקופ אלקטרונים הולכה.

התמיינות והדמיה של אדיפוציטים חומים מהמקטע הווסקולרי של רקמת השומן הבין-סקפולרית מעכברים שזה עתה נולדו

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול לבידוד, תרבית ופנוטיפ של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים מרקמת שומן תת-עורית אנושית (hSATMVECs). בנוסף, אנו מתארים מודל ניסיוני של hSATMVEC-adipocyte cross-talk.

חקר שיחות צולבות של תאי אנדותל שומן/אדיפוציטים ברקמת שומן תת-עורית אנושית

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים אופטימליים לניקוי רקמות כדי לדמות את אבי העורקים העכברי בתלת מימד (3D). אנו מתארים נהלים חדישים לצביעה חיסונית, ניקוי אופטי והדמיה מתוך כוונה להגדיר את הקרבה האנטומית של מערכת העצבים ההיקפית עם פלאק טרשת עורקים והאדוונטיטיה בטרשת עורקים.

הדמיה תלת מימדית של רקמות אבי העורקים בטרשת עורקים

חלבונים הנקשרים אקטין פילמנטיות (F-אקטין) באמצעות מודולים שונים אקטין מחייב. בסרטון הזה אנחנו מדגימים את ההליך של אקטין שיתוף שקיעה, אשר מהווה ב assay חוץ גופית בשימוש שגרתי לנתח חלבונים או תחומים ספציפיים הנקשרים F-אקטין.

אקטין Co-Assay שקיעה, כי ניתוח של חלבון מחייב את ה-F-אקטין

למד את שיטת Adipo-Clear לניקוי רקמת שומן להדמיה תלת-ממדית ברזולוציה גבוהה. השיטה מאפשרת לחקור את הארגון המרחבי של תאי שומן ואת האינטראקציות ביניהם תוך שימור המבנה התלת-ממדי.

Adipo-ברור: רקמה ניקוי שיטה עבור הדמיה תלת-ממדית של רקמת שומן

גלה סרטונים נוספים