Adipo-ברור: רקמה ניקוי שיטה עבור הדמיה תלת-ממדית של רקמת שומן

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של רקמת השומן, כגון כיצד רכיבים שונים של רקמת השומן מתקשרים ברקמה שלמה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מסירה לחלוטין את עודפי השומנים המאוחסנים ברקמת השומן תוך שמירה על הארכיטקטורה התלת מימדית שלה. בעוד ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי הארגון התלת מימדי של רקמת השומן, ניתן ליישם אותה בדרך כלל גם על רקמות אחרות עם תכולת שומנים גבוהה כגון בלוטת זיכרון ובלוטות לימפה.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון ששלבי הניקוי והפינוי דורשים זמני דגירה מספיקים, שיכולים להיות קשים לקביעה. התחל בשימוש במלקחיים קהים כדי לנתח את כרית השומן המעניינת ממודל חיה טרי. הסר בזהירות את כל כרית האופנה מבלי לצבוט או לסחוט את הרקמה או לזהם את הרקמה המנותחת בפרווה.

מניחים את כרית השומן בכ-10 מיליליטר של תמיסת קיבוע בצינור חרוטי של 15 מיליליטר ומקבעים בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת לאחר שטיפת הדגימה עם PBS, הסר בעדינות כל פסולת מהדגימה תחת מיקרוסקופ דיסקציה. שיער, מוך או פסולת אחרת המחוברת לדגימה יגרמו לצללים במהלך ההדמיה.

העבירו את הדגימה הנקייה לצינור פוליפרופילן המכיל מאגר B1N קר כקרח, 20 אחוז מתנול. הנח את הצינור המכיל את הדגימה בצורה אופקית על שייקר מסלול, הגדר אותו 100 סל"ד ונער במשך 30 דקות עד שעה בהתאם לגודל הדגימה. ודא שהדגימות יכולות לנוע בחופשיות בתוך הצינור.

המשך לייבש את הדגימות באמצעות סדרה מדורגת של 40 אחוז, 60 אחוז ו-80 אחוז מתנול במאגר B1N ואחריו 100 אחוז מתנול. צמצם את פתרון ההעברה. לאחר התייבשות, החלף את תמיסת המתנול של 100 אחוז ב-100 אחוז דיכלורומתאן או DCM כדי להפחית את הדגימה.

חזור על הכביסה פעמיים בהתאם לזמני הדגירה המפורטים בטבלה 2. הדגימה צריכה לשקוע לתחתית הצינור בסוף שטיפת ה-DCM השנייה והשלישית. אם לא, האריכו את זמן הדגירה כדי להבטיח הסרת שומנים מלאה.

לאחר הפחתת שומנים יש לשטוף פעמיים עם 100 אחוז מתנול למשך הזמן המצוין בטבלה 2. החזר את הדגימה לסדרת חיץ מתנול B1N הפוכה לזמנים המצוינים בטבלה 2. לאחר החזרת הנוזלים, שטפו את הדגימה עם מאגר PTXWH למשך שעתיים בטמפרטורת החדר.

הדגימה מוכנה כעת לצביעה חיסונית או שניתן לאחסן אותה במאגר PTXWH בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד שנה. ראשית, יש לדלל את הנוגדן העיקרי במאגר PTXWH לריכוז המומלץ. לאחר מכן, צנטריפוגה את תמיסת הנוגדנים המדוללת ב-20 אלף גרם למשך 10 דקות כדי למנוע הכנסת משקעים או הצטברות נוגדנים.

חשוב לבחור נוגדנים ראשוניים מתאימים התואמים לטיפול במתנול ו-DCM. יש לאמת נוגדנים חדשים עם חתיכות קטנות של רקמה או עם קטעי רקמה שטופלו במתנול. דגרו את הדגימה נטולת השומנים עם תמיסת הנוגדנים העיקרית למשך 3 עד 5 ימים בהתאם לגודל הדגימה.

לאחר הדגירה הראשונית יש לשטוף את הדגימה במספר שינויים של מאגר PTXWH. למחרת, יש לדלל את הנוגדן המשני במאגר PTXWH לריכוז המומלץ. צנטריפוגה תמיסת הנוגדנים המדוללת כמו קודם.

דגרו את הדגימה עם תמיסת הנוגדנים המשנית למשך 3 עד 5 ימים בהתאם לגודל הדגימה. שוב, שטפו את הדגימה עם מאגר PTXWH בסדרה של שלבי דגירה כמו קודם. למחרת, שטפו את הדגימה עם 1XPBS למשך 5 דקות, 10 דקות ולאחר מכן 30 דקות.

הטמע רקמת שומן באגרוז כדי להקל על הרכבת הדגימה למיקרוסקופ גיליון קל. ראשית, הכינו את תמיסת ההטבעה עם 1 אחוז אגרוז ב-1XPBS. מצננים את תמיסת ההטבעה לסביבות 40 מעלות צלזיוס כדי למנוע חשיפת הדגימה לחום מוגזם.

תוך הימנעות מהעברת נוזלים, הניחו את דגימת הרקמה הנקייה בתבנית וסדרו אותה למיקום הרצוי. לאחר מכן שפכו בעדינות את תמיסת ההטבעה על הדגימה תוך הימנעות מבועות אוויר. יש להעביר את כל בועות האוויר לפריפריה לפני שהאגרוז מתמצק.

לאחר שהאגרוז התמצק במלואו, גזרו גוש המכיל את הדגימה. העבירו את הדגימה ל-25 אחוז מתנול במים, הגנו מפני אור ודגרו עם טלטול למשך הזמן המוצג בטבלה 2. המשך לייבש את הדגימה דרך שיפוע מתנול.

דגרו את הדגימה ב-100 אחוז DCM למשך שעה אחת עם ניעור. דגימות DCM Wash מתייבשות בקלות באוויר, מה שישפיע על בהירות הדגימה ויגרום לתמונות מטושטשות. חשוב להעביר דגימות במהירות לתמיסה טרייה כדי למנוע התייבשות.

הדגימה צריכה לשקוע לתחתית הצינור בסוף כל שטיפת DCM. דגרו את הדגימה באתר Dibenzyl או DBE למשך הלילה עם טלטול קל כדי להשיג התאמת מקדם שבירה. הדגימה תהפוך בסופו של דבר לאור שקוף ובלתי נראה.

למחרת, לאחר דגירה של הדגימה עם DBE טרי עם ניעור קל למשך שעתיים, אחסן את הדגימה בטמפרטורת החדר בחושך או המשך ישירות להדמיה. כדי לדמות את הדגימה עם מיקרוסקופ גיליון אור התואם ל-DBE, הרכיב את הדגימה המוטמעת של אגרוז על מחזיק שיכול למנוע תנועה במהלך ההדמיה. כדי לדמות את הדגימה עם מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך או שני פוטונים, הנח את הדגימה המוטמעת באגרוז בשקופית תא עם תחתית זכוכית.

סריקת כרית שומן תת עורית אחורית באמצעות מיקרוסקופ גיליון בהיר עם הגדלה נמוכה מראה את הארגון האוני של אדיפוציטים. מידע מפורט יותר כגון גודל האדיפוציטים יכול להיחשף על ידי התקרבות לאזורי העניין עם הגדלה גבוהה יותר. כרית שומן תת עורית אחורית מוכתמת בטירוזין הידרוקסילאז, סמן למערכת העצבים הסימפתטית, צולמה על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי של יריעות קלות.

צביעת TH חשפה מבנים שנראים כמו צרורות עצבים גדולים כפי שמצוין על ידי החץ כאן. עצבוב כלי דם כמו גם ארבוריזציה סופית צפופה בפרנכימה של הרקמה מתגלים גם על ידי צביעת TH. באמצעות מולקולת הידבקות תאי אנדותל טסיות או PCAM1 הידוע גם בשם CD31 כסמן לסימון כלי דם, נצפה כי כל האדיפוציטים נמצאים במגע עם הנימים בכל הרקמה התומכים בביקוש הגבוה להחלפת חומרים מזינים וחמצן יעילים בשומן.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של השומן לחקור שאלות נוספות כגון מורפוגנזה מוקדמת של רקמות ומיפוי גורל של אבות אדיפוציטים. ניתן ליישם אותו גם כדי לחקור את ההיסטולוגיה של רקמת השומן האנושית. אל תשכח שעבודה עם פרפורמלדהיד, מתנול, דיכלורומתאן ואתר דיבנזיל עלולה להיות מסוכנת ביותר ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון שימוש במכסה אדים וציוד מגן אישי בעת ביצוע הליך זה.