Name: TChIP-Seq: יצירת פרופילים ייחודיים לסוג התא Epigenome (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-23T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: למד את פרוטוקול tChIP-Seq לניתוח שינויים בהיסטונים ספציפיים לסוג תא בנוירונים של עכברים. שיטה זו מאפשרת בידוד כרומטין ממטרות ספציפיות ומספקת תובנות לגבי רגולציה אפיגנטית בגנום.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לכל חברי המעבדה איוואסאקי לקריאה ביקורתית של כתב היד. עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מענק הסיוע למחקר מדעי בתחומים חדשניים (#26113005 כיהן ו JP17H05679 ל ס. י); מענק הסיוע מדענים ומפתחים צעירים (א) (JP17H04998 ל ס. י) מ משרד החינוך, המדע, הספורט והתרבות של יפן (MEXT); והחלוץ פרויקטים "אבולוציה סלולרית" ו RIKEN כל פרוייקט "המחלה, Epigenome" מ RIKEN (כדי כיהן, ס. י).

<ol><li>Mito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+survey+of+epigenetic+modifications+by+tandem+chromatin+immunoprecipitation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific survey of epigenetic modifications by tandem chromatin immunoprecipitation sequencing.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1143(2018).</li>
<li>Kadota, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTCF+binding+landscape+in+jawless+fish+with+reference+to+Hox+cluster+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">CTCF binding landscape in jawless fish with reference to Hox cluster evolution.</a> Scientific Reports. 7 (1), 4957(2017).</li>
<li>Jung, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+sequencing+depth+in+ChIP-seq+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Impact of sequencing depth in ChIP-seq experiments.</a> Nucleic Acids Research. 42 (9), (2014).</li>
<li>Becker, P. B., Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosome+remodeling+and+epigenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Nucleosome remodeling and epigenetics.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (9), a017905(2013).</li>
<li>Kidder, B. L., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+library+preparation+for+next-generation+sequencing+analysis+of+genome-wide+epigenetic+and+transcriptional+landscapes+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Efficient library preparation for next-generation sequencing analysis of genome-wide epigenetic and transcriptional landscapes in embryonic stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. , 3-20 (2014).</li>
<li>Gilfillan, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+and+possibilities+of+low+cell+number+ChIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Limitations and possibilities of low cell number ChIP-seq.</a> BMC Genomics. 13, 645(2012).</li>
<li>Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIPmentation%3A+fast%2C+robust%2C+low-input+ChIP-seq+for+histones+and+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors.</a> Nature Methods. 12 (10), 963-965 (2015).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RNA-sequencing+transcriptome+and+splicing+database+of+glia%2C+neurons%2C+and+vascular+cells+of+the+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex.</a> Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).</li>
<li>Hornstein, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligation-free+ribosome+profiling+of+cell+type-specific+translation+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Ligation-free ribosome profiling of cell type-specific translation in the brain.</a> Genome Biology. 17 (1), 149(2016).</li>
<li>Zhao, Y., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+catalog+of+currently+documented+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Comprehensive catalog of currently documented histone modifications.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), a025064(2015).</li>
<li>Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde+crosslinking%3A+a+tool+for+the+study+of+chromatin+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde crosslinking: a tool for the study of chromatin complexes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (44), 26404-26411 (2015).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

פרוטוקול שלנו היה ממוטב הנוירונים במוח העכבר, שבו הביטוי של ויזת עבודה H2B מתויג דגל הנגרמת על ידי הזרקת טמוקסיפן. היזמים להשתמש בביטוי ויזת עבודה H2B, חומרים רקמת המוצא של הסכום של הרקמות הם פרמטרים מרכזי עבור מוצלחת tChIP-תת סעיף. לפיכך, אופטימיזציה של גורמים אלה להתייחס לכל סוג התא של ריבית.
שלב קריטי בין ההליכים בשימוש פרוטוקול זה הוא ה-DNA הטיה כדי להשיג באורך כרומטין של bp 100-5005. באופן כללי, סטנדרטיזציה של השלב ultrasonication הוא מאתגר מאז זה מאוד תלוי במגוון ...

ברקמות של בעלי חיים מורכבים של סוגי תאים שונים. הכונה בכל תא מגדיר את סוג התא. כרומטין שינויים - DNA מתילציה של היסטון-שינוי - ביסוד יחודיות תא-סוג של ביטוי גנים. לפיכך, המדידה של תקנה epigenetic בסוג התא כל רצונך בכך, אבל זה כבר אתגר טכני.
כדי לחקור את אפיגנטיקה בסוג לתא מסוים, היה רצף immunoprecipitation טנדם כרומטין (tChIP-Seq) פיתחה לאחרונה (איור 1)1. TChIP, מבוטא מתויג epitope הליבה היסטון חלבון ויזת עבודה H2B מ מקדם ייחודיים לסוג התא. תכונה זו מאפשרת את ניתוקה של chromatins את התאים של עניין, למרות החומר מתחיל תערובת של סוגי תאים שונים. השבב הבא-Seq — כרומטין טיהור באמצעות שינוי היסטון מארק בעלת רצף עמוק הדור הבא של מבודדים DNA – נוכל לעקוב אחר המצב epigenetic סוג התא יישוב באופן הגנום כולו.
בעזרת טכניקה זו, חקרנו לאחרונה נוירון ספציפי trimethylation של היסטון H3 חלבון-ליזין 4 (H3K4me3) סימני. במחקר זה, פיתחנו בטוק עכבר ב אילו C-סופני מתויג דגל ויזת עבודה H2B חלבון בא לידי ביטוי על רקומבינציה בתיווך Cre (Rosa26חטיבתי floxed-pA ויזת עבודה H2B-דגל...). על ידי מעבר עם עכבר אחזקת הגן רשת (ER) Cre-endoplasmic תחת השליטה של האמרגן CamK2a, הקו העכבר שהושג המושרה ויזת עבודה H2B-דגל בנוירונים פעיל עם טמוקסיפן הזרקה (Camk2aויזת עבודה H2B-דגל)1. החל מהמוח של הקו העכבר הוקמה, ביצענו tChIP-Seq עם נוגדן anti-H3K4me3. מאז H3K4me3 סימני לעיתים קרובות להתאים לאזורים יזם, נוכל לגלות מאות mRNAs במיוחד לידי ביטוי נוירונים1.
כאן, אנו מתארים שיטה tChIP טיפוסי-Seq שמכסה את השלבים של רקמות לנתיחה לבנייה הספרייה (איור 1). המטרה הסופית של פרוטוקול זה היא לשתף שלנו מומלצות עבור הביצועים של tChIP-Seq לבין היישום העתידי של שיטה זו על סוגי תאים אחרים והשינויים היסטון.

<table><tbody><tr><td>שפופרת חלבון LoBind, 2 מ"ל</td><td>Eppendorf</td><td>No.&nbsp; 0030108132</td> עבור צינור LoBind <td>חלבון ליזה תאים</td></tr><tr><td>, 1.5 מ"ל</td><td>Eppendorf</td><td>No.&nbsp; 0030108116</td><td>להכנת ChIP והכנת ספרייה</td></tr><tr><td>צינור DNA LoBind, 1.5 מ"ל</td><td>Eppendorf</td><td>No.&nbsp; 0030108051</td><td>להכנת ChIP וספרייה</td></tr><tr><td>צינור PCR 8 רצועות</td><td>BIO-BIK</td><td>3247-00</td><td>להכנת ChIP וספרייה</td></tr><tr><td>SK Mill</td><td>TOKKEN</td><td>SK-200</td><td>מטחנה קריוגנית שימושית להכנת אבקת תאים לקיבוע</td></tr><tr><td>כדור מתכת</td><td>TOKKEN</td><td>SK-100-DLC10</td><td>אביזר של SK Mill</td></tr><tr><td>2 מ"ל צינור נירוסטה</td><td>TOKKEN</td><td>TK-AM5-SUS</td><td>אפשרות לתא ליזה</td></tr><tr><td>2 מ"ל מחזיק צינור נירוסטה</td><td>TOKKEN</td><td>SK-100-TL</td><td>אפשרות לליזה תאית</td></tr><tr><td>16% פורמלדהיד (w/v), ללא מתנול</td><td>פירס</td><td>28906</td><td>לתיקון תאים. הכן תמיסה של 1% לפני השימוש.</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Nacalai Tesque</td><td>17109-35</td><td>הכן 2.5 M מלאי</td></tr><tr><td>D-PBS (-)(1x)</td> <td>Nacalai Tesque</td><td>14249-24</td><td>לשטיפת ליזאט ו-DNA מטוהר</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Nacalai Tesque</td><td>02443-05</td><td>עבור מאגר ליזה 1. הכן 1 מ ', מלאי pH 7.5.</td></tr><tr><td>5 M NaCl, כיתה ביולוגיה מולקולרית</td><td>Nacalai Tesque</td><td>06900-14</td><td>עבור מאגר ליזה 1, מאגר ליזה 2, מאגר ChIP, ומאגר Tris-EDTA-NaCl</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA, כיתה ביולוגיה מולקולרית</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>311-90075</td><td>עבור מאגר ליזה 1, מאגר ליזה 2, מאגר פליטת ChIP, ומאגר Tris-EDTA-NaCl</td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>072-04945</td><td>עבור מאגר ליזה 1</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Nacalai Tesque</td><td>25223-75</td><td>עבור מאגר ליזה 1</td></tr><tr><td>Triton X-100, כיתה ביולוגיה מולקולרית</td><td>Nacalai Tesque</td><td>12967-32</td><td>עבור מאגר ליזה 1</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Nacalai Tesque</td><td>35406-91</td><td>עבור מאגר ליזה 2, מאגר פליטת ChIP ומאגר Tris-EDTA-NaCl. הכן מלאי 1 מ ', pH 8.0.</td></tr><tr><td>0.1 M EGTA pH ניטרלי</td><td>Nacalai Tesque</td><td>08947-35</td><td>עבור מאגר ליזה 2</td></tr><tr><td>קוקטייל מעכב פרוטאז (100x)</td> <td>Nacalai Tesque</td><td>25955-24</td><td>כדי לחסום פירוק של חלבון</td></tr><tr><td>RIPA buffer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89900</td><td>עבור ליזה תאים וכביסה</td></tr><tr><td>milliTUBE 1 מ"ל AFA סיבים</td><td>Covaris</td><td>520130</td><td>צינור סוניקטור. אביזר של Focused-ultrasonicator</td></tr><tr><td>ממוקד-אולטרה-סוניקטור</td><td>Covaris</td><td>S220 או E220</td><td>לעיכול DNA לגודל הולם עבור ChIP-Seq</td></tr><tr><td>UltraPure 10% SDS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15553-027</td><td>עבור ChIP Elution Buffer</td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Nacalai Tesque</td><td>30141-14</td><td>לטיהור DNA מליזאט</td></tr><tr><td>Proteinase K, רקומביננטי,</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td> בדרגת PCR <td>3115887001</td><td>לטיהור DNA מליזאט</td></tr><tr><td>אתנול</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>054-07225</td><td>הכינו תמיסה של 70%</td></tr><tr><td>נוגדן חד-שבטי נגד FLAG M2 המיוצר בעכבר</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1804</td><td>לטיהור כרומטין המתבטא בתאי עניין</td></tr><tr><td>Dynabead M-280 כבשים נגד עכבר IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11201D</td><td>זה יכול לשמש עבור אנטי-FLAG IP ואנטי-H3K4me3 IP</td></tr><tr><td>אנטי-טרי-מתיל היסטון H3 (K4), נוגדן חד שבטי לעכבר</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>301-34811</td><td>כל נוגדן אחר שעובד לניתוח ChIP יעבוד</td></tr><tr><td>פי 10 מגיב חוסם</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td></td><td>11096176001 לחסימה במהלך טיהור זיקה</td></tr><tr><td>דנהרדט' s פתרון</td><td>Nacalai Tesque</td><td>10727-74</td><td>לחסימה במהלך טיהור זיקה</td></tr><tr><td>גליקוגן (5 מ"ג/מ"ל)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9510</td><td>לטיהור DNA מליזאט</td></tr><tr><td>קיוביט 2.0 פלואורומטר</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32866</td><td>לכימות DNA</td></tr><tr><td>מבודד קיוביט dsDNA HS ערכת בדיקה</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32851</td><td>לכימות DNA מבודד</td></tr><tr><td>צינור 0.5 מ"ל</td><td>Axygen</td><td>10011-830</td><td>לכימות על ידי Qubit</td></tr><tr><td>Phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1)</td><td>Nacalai Tesque</td><td>25970-56</td><td>לטיהור DNA מליזאט</td></tr><tr><td>חרוזי AMPure XP</td><td>בקמן קולטר</td><td>A63881</td><td>SPRI חרוזים מגנטיים להכנת ספרייה</td></tr><tr><td>מתלה קרח מתכת</td><td>Funakoshi</td><td>IR-1</td><td>כדי לשמור על התא קפוא</td></tr><tr><td>מצנן דגימה</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>T7771S</td><td>מסייע בתיקון תאים עם נזק מינימלי</td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939BA</td><td>לבדוק את איכות שברי ה-DNA המבודדים. ניתן להשתמש במנתח שברים אחר.</td></tr><tr><td>Bioanalyzer 2100 Expert Software</td><td>Agilent Technologies G2946CA</td><td></td><td>מסופקת עם</td></tr><tr><td>ערכת ה-DNA ברגישות גבוהה</td> של Bioanalyzer <td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td>כדי לבדוק את איכות שברי ה-DNA המבודדים</td></tr><tr><td>ערכת הכנת ספריית KAPA LTP Roche</td><td></td><td>07961898001</td><td>מסופק עם 10x מאגר תיקון קצה KAPA, תערובת אנזימים לתיקון קצה KAPA, מאגר זנב KAPA A, אנזים זנב KAPA A, מאגר קשירה KAPA, KAPA DNA Ligase ותמיסת PEG/NaCl</td></tr><tr>מתאם<td>ברקודי DNA BIOO</td><td>Scientific</td><td>NOVA-514101</td><td>להכנת ספרייה. מסופק עם מתאמי ברקוד DNA ותערובת פריימר.</td></tr><tr><td>ערכת הגברת ספרייה בזמן אמת KAPA</td><td>Roche</td><td>07959028001</td><td>מסופקת עם 2x KAPA HiFi HS בזמן אמת PCR Master Mix, PCR Primer Mix ותקני פלורסנט</td></tr><tr><td>2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix</td><td>Roche</td><td>KM2602</td><td>להכנת ספרייה. בנוסף, אנזים זה עשוי להידרש עבור ערכת ההגברה של ספריית KAPA בזמן אמת</td></tr><tr><td>מאגר EB</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td>10 מ"מ Tris-Cl, pH 8.5 לפליטת צלחת qPCR של DNA</td></tr><tr><td>386 בארות</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4309849</td><td>עבור PCR בזמן אמת</td></tr><tr><td>QuantStudio 7 Flex מערכת PCR בזמן אמת</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4485701</td><td>לכימות</td></tr><tr><td>סרט דבק אופטי DNA MicroAmp</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>4311971</td><td>לסרט דבק PCR מיקרו</td></tr><tr><td>אמפר שקוף</td> בזמן אמת <td>תרמו פישר מדעי</td><td>4306311</td><td>לאיטום צלחת</td></tr><tr><td>תערובת</td><td></td><td></td> מאסטר לתיקון קצה <td>לשלב 1.4 ומיקרו; L של 10x מאגר תיקון קצה KAPA, 1 ומיקרו; L של תערובת אנזימים לתיקון קצה KAPA, ו-1.6 ומיקרו; L של H2O</td></tr><tr>תערובת <td></td><td></td><td>מאסטר A-taling</td><td>קומביין 1 ומיקרו; L של KAPA A-Tailing Buffer, 0.6 ומיקרו; L של אנזים זנב KAPA A, ו-8.4 ומיקרו; L של H2O</td></tr><tr>תערובת <td></td><td></td><td>חיץ קשירה</td><td>שילוב 2 ומיקרו; L של מאגר קשירת KAPA ו-6 ומיקרו; L של H2O</td></tr><tr>מיקס <td></td><td></td><td>מאסטר PCR בזמן אמת</td><td>שילוב 5 ומיקרו; L של 2x KAPA HiFi HS בזמן אמת PCR Master Mix, 0.35 ומיקרו; L של תערובת פריימר PCR (10 ומיקרו; M כל אחד של פריימר קדימה AATGATACGGCGACCACCGAG ופריימר הפוך CAAGCAGAAGACGGCATACGAG), ו-3.15 ומיקרו; L של H2O</td></tr><tr><td>תערובת מאסטר</td><td></td><td></td> PCR <td>שילוב 10 ומיקרו; L של 2x KAPA HiFi Ready Mix, 0.9 ומיקרו; L של תערובת פריימר PCR, ו-0.6 ומיקרו; L of H2O</td></tr><tr><td>מציג גנומיקה אינטגרטיבית</td><td>מכון ברוד</td><td>IGV_2.3.88</td><td>דפדפן גנום להמחשת נתוני ריצוף</td></tr><tr><td>DNA אולגיונוקלאוטיד: 5&prime;-GCCTACGCAGGTCTTGCTGAC-3&prime;</td><td>Eurofins Genomics</td><td></td><td>פריימר להגברת אזור המקדם של GAPDH</td></tr><tr><td>DNA אולגיונוקלאוטיד: 5&prime;-CGAGCGCTGACCTTGAGGTC-3&prime;</td><td>Eurofins Genomics</td><td></td><td>פריימר להגברת אזור המקדם של GAPDH</td></tr><tr><td>SYBR Premix Ex Taq</td><td>Takara</td><td>RR420L</td><td>כדי לכמת את ה-DNA המתאים לאזור המקדם GADPH</td></tr><tr><td>קוביות Thermal Cycler Takara</td><td></td><td>TP870</td><td>כדי לכמת את ה-DNA המתאים לאזור המקדם GADPH</td></tr></tbody></table>

tchip-seq: יצירת פרופילים ייחודיים לסוג התא epigenome

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

תקנה epigenetic ממלא תפקיד מרכזי ביטוי גנים. מאז שינוי היסטון התגלה בשנות השישים, תפקידיה פיזיולוגיים ופתולוגיים נחקרו בהרחבה. אכן, כניסתו של רצף עמוק הדור הבא, immunoprecipitation כרומטין (ChIP) באמצעות נוגדנים שינוי היסטון ספציפי יש מהפכה התפיסה שלנו לגבי רגולציה epigenetic ברחבי הגנום. לעומת זאת, רקמות בדרך כלל מורכבים של סוגי תאים שונים, תערובת מורכבת שלהם מציב אתגרים אנליטית כדי לחקור את epigenome בסוג לתא מסוים. כדי לטפל המדינה כרומטין ייחודיים לסוג התא באופן הגנום כולו, שפיתחנו לאחרונה טנדם כרומטין immunoprecipitation רצף (tChIP-Seq), אשר מבוססת על הטיהור סלקטיבי של כרומטין על-ידי הליבה מתויג חלבוני היסטון מתא סוגי ריבית, ואחריו שבב-תת סעיף. המטרה של פרוטוקול זה הוא ההקדמה של שיטות עבודה מומלצות של tChIP-תת סעיף. טכניקה זו מספקת כלי רב-תכליתי לחקירה רקמות ספציפיות epigenome שינויים היסטון מגוונים, מודל אורגניזמים.

כאן, אנו מתארים את רקמת לנתיחה, קיבוע, פירוק התא, טנדם טיהור של כרומטין, ספריית DNA הכנה סקוונסרים הדור הבא. במהלך ההליכים, אחד יכול לבדוק את האיכות של ה-DNA, אשר היא המפתח רצף מוצלח, על מספר השלבים (איור 2). מאז נוקלאוזום בודד מוקף בדרך כלל bp 147 דנ א 4, הוטו DNA לא צריך להיות קצר יותר בגודל הזה. מיד לאחר ultrasonication, ה-DNA היה מבודד, לפעול על מחשב אלקטרופורזה microfluidic (איור 2 א). למרות מאמצינו כ...

אנו מתארים פרוטוקול צעד אחר צעד עבור טנדם כרומטין רצף immunoprecipitation (tChIP-Seq) המאפשרת הניתוח של שינוי היסטון הגנום כולו ייחודיים לסוג התא.

TChIP-Seq: יצירת פרופילים ייחודיים לסוג התא Epigenome

Epigenetic regulation plays central roles in gene expression. Since histone modification was discovered in the 1960s, its physiological and pathological ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האפיגנטיקה כגון כמה שינויים כרומטיים מוסדרים באופן ספציפי לסוג התא יחד עם גנומים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנחנו יכולים לבודד כרומטין מהתאים הממוקדים ולאחר מכן בצע צועני טיפוסי במורד הזרם. אז שיטה זו יכולה לספק תובנות לתוך trimincil ספציפי נוירון, lysinc 4, opisoncilly.זה יכול להיות מיושם גם על שינוי histone אחרים, סוגי תאים אחרים, ולאחר מכן אורגניזמים מודל אחרים. הדגימה של ההליך תהיה מארי מיטו, טכנאית מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, להשתמש מספריים האביב בסדר לנתח את הרקמה של עניין לחתיכות קטנות.מוסיפים את שברי הרקמה למיכל נקי מלא בחנקן נוזלי. לאחר מכן, להעביר את שברי הרקמה לשני צינורות מיליליטר מלא חנקן נוזלי. לאחסן את הצינורות במינוס 80 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות עם הכובע פתוח כדי לאדות את החנקן הנוזלי.מניחים את הצינורות המכילים את דגימות הרקמה על מתלה קרח מתכתי צונן. לאחר מכן, מניחים כדור מתכת בצינור 1.5 מיליליטר ומצננים אותו עם חנקן נוזלי. מניחים את כדור המתכת המצונן לאחד מצינורות הדגימה.סגרו את הכובע והגדירו את הצינור למחזיק הצינור של מטחנה קריוגנית. מיד, לטבול את מחזיק הצינור התאספו חנקן נוזלי במשך דקה אחת. הכנס את מחזיק הצינור הקפוא לתוך הקלטת החיצונית של המטחנה הקריוגנית.ולנער אותו במרץ במשך 30 שניות, 60 פעמים. לאחר מכן, לפרק את המטחנה קריוגניים, להסיר את כדור המתכת. ומ מניחים את הצינור לתוך מצנן מדגם מקורר מראש.לאחסן את הצידנית ב 20 מעלות צלזיוס שלילי במשך 15 דקות. לאחר מכן, הוסיפו 900 מיקרוליטרים של 1% פורמלדהיד לצינור ופיגט כדי לערבב. העבר את ההשעיה לצינור חדש של שני מיליליטר עם 900 מיקרוליטרים של 1% פורמלדהיד.לאחר מכן, לתקן את ההשעיה במשך 10 דקות עם סיבוב עדין ב 23 מעלות צלזיוס. כדי לעצור את תגובת קיבעון, להוסיף 100 microliters של 2.5 גליצין טוחן לצינור. וצנטריפוגה ב 3,000 פעמים כבידה לחמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.לאחר מכן, השלך את העל-טבעי. מוסיפים מיליליטר אחד של PBS לצינור ומערבולת כדי לערבב. צנטריפוגה ב 3,000 פעמים כבידה לחמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.חזור על שלב שטיפה זה, פעמיים נוספות. לאחר מכן, להוסיף 500 microliters של מאגר תזה אחד גלולה פיפטה לערבב. צנטריפוגה הצינור במשך חמש דקות ב 3, 000 פעמים כבידה בארבע מעלות צלזיוס ולהשליך את העל טבעי.מוסיפים מיליליטר אחד של מאגר תזה 2 לכדור ומערבולת כדי לערבב. לאחר מכן, צנטריפוגה ההשעיה במשך חמש דקות ב 3, 000 פעמים כבידה בארבע מעלות צלזיוס ולהשליך את העל טבעי. לאחר מכן, להוסיף 800 microliters של מאגר בדיקה immunoprecipitation רדיו עם קוקטייל מעכב פרוטאז גלולה פיפטה לערבב.צנטריפוגה ההשעיה במשך חמש דקות ב 3, 000 פעמים כבידה בארבע מעלות צלזיוס ולהשליך את העל טבעי. לאחר מכן, להוסיף 500 microliters של חיץ RIPA עם קוקטייל מעכב פרוטאז לכדור. לאחר מכן, צנטריפוגה ההשעיה במשך חמש דקות ב 3, 000 פעמים כבידה בארבע מעלות צלזיוס ולהשליך את העל טבעי.מוסיפים מיליליטר אחד של חיץ RIPA עם קוקטייל מעכב פרוטאז. מיד לאחר הוספת חיץ RIPA עם קוקטייל מעכב פרוטאז, להעביר את lysate לצינור sonicator. ושים את הצינור על אולטרסוניאטור.באמצעות ההגדרות המתוארות בפרוטוקול הטקסט, תטווה את הכרומטין. לאחר מכן, להעביר את המדגם לצינור חלבון נמוך 1.5 מיליליטר. וצנטריפוגה זה במשך חמש דקות ב20, 000 פעמים כוח הכבידה בארבע מעלות צלזיוס.לאסוף את supernatant מהדגימה ולהעביר אותו צינור חלבון חדש מחייב נמוך. בפרוטוקול זה, רצף אימונופרציפיטציה כרומטין טנדם הוצג והוכח. במהלך ההליך נבדקה איכות הדנ"א במספר שלבים.מיד לאחר sonication, ה-DNA מגושם היה מבודד ונבדק עם מכונת אלקטרופורזה microfluidic. לאחר שימוש בנוגדנים נגד FLAG ונוגדן אנטי H3K3me3 לביצוע טיהור זיקה, איכות ה- DNA נבדקה שוב. הספציפיות של טיהור החיסון של DNA על H2B-FLAG אושרה עם דגימות בקרה שליליות.היכן שזוהו כמויות זניחות של דנ"א. בהמשך הפרוטוקול אומתה איכות ספריית רצף. ChIP ו- T-ChIP המוצלחים הוכחו באמצעות ניתוח העשרה באמצעות פריימרים המכוונים לאזור האמרגן של הגן GAPDH.חלוקות ייצוגיות לאורך שלושה גנים נוירון הושגו. והעשרת קריאות בחמשת הקצוות המובילים של הגנים על ידי נוירון T-ChIP לחפש על המוח כולו T-ChIP לחפש נצפתה. לאחר ייצוב, טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום האפיגנטי לחקור שינוי היסטון ספציפי לסוג התא באופן כללי בנוירונים בעכברים.אל תשכח כי עבודה עם פורמלדהיד יכול להיות מסוכן מאוד לנקוט אמצעי זהירות כגון לבישת בגדי גומי ומשקפיים תמיד צריך להילקח בעת ביצוע הליך זה.

tchip-seq-cell-type-specific-epigenome-profiling

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

שילוב של immunoprecipitation הכרומטין ורצף אולטרה תפוקה גבוהה (שבב ואילך) יכול לזהות ולמפות DNA חלבונים אינטראקציות בקו רקמה או תא נתון. התווה הוא איך ליצור תבנית באיכות גבוהה עבור סידור שבב שלאחר מכן, תוך שימוש בניסיון עם TCF7L2 גורם השעתוק לדוגמא ירושלים.

דור של תבנית הכרומטין immunoprecipitation איכות גבוהה עבור ה-DNA רצף תפוקה גבוהה (שבב ואילך)

שיטות למיפוי אינטראקציות חלבון-DNA in vivo הופכות חיוניות לכל היבט של מחקר גנומי, אך הן מייגעות, יקרות וגוזלות זמן. כאן מוצגת מערכת רובוטית לטיפול בנוזלים זמינה מסחרית המבצעת אוטומציה של משקעים חיסוניים של כרומטין למיפוי אינטראקציות חלבון-DNA in vivo עם כמויות מוגבלות של תאים.

אוטומציה של ניסויי שבב seq כדי ליצור פרופילים אפיגנטיים על 10,000 תאים הלה

תקנת כוונון עדינה של שעתוק גנים בבסיס החלטת גורל תא עוברי. בזאת, אנו מתארים מבחני immunoprecipitation הכרומטין לשמש כדי לחקור תקנה אפיגנטיים של שני בידול הלב של תאי גזע ופיתוח הלב של עוברי עכברים.

תקנה אפיגנטיים של לב בידול בתאי גזע עובריים ורקמות

עבודה זו מתארת ​​פרוטוקול לכרומטין immunoprecipitation (שבב) באמצעות קו עכבר T- התא הבוגר. פרוטוקול זה מתאים לחקור את ההפצה של סימני היסטון ספציפיים באתרי מקדם ספציפי או גנום רחב.

הכרומטין Immunoprecipitation (שבב) ב עכבר T-cell שורות

אנו מציגים immunoprecipitation ששונה כרומטין יליד רצף (צ'יפ-seq) מתודולוגיה לדור של רצף datasets מתאים נוקלאוזום צפיפות שבב-seq מסגרת אנליטית שילוב נגישות נוקלאז micrococcal (MNase) עם מדידות שינוי היסטון.

דור של כרומטין יליד Immunoprecipitation רצף ספריות לניתוח צפיפות נוקלאוזום

כאן, אנו מתארים, אופטימיזציה תפוקה גבוהה שבב-רצף פרוטוקול ו ניתוחים חישובית צינור מצפני הגנום כולו כרומטין דפוסי המדינה בין קפוא גידול רקמות שורות תאים.

פלטפורמה משולבת עבור מיפוי הגנום כולו של כרומטין הברית באמצעות שבב בתפוקה גבוהה-רצף ברקמות הגידול

כאן, אנו מתארים שיטות לביצוע שבב-Seq ומפות CARIP-Seq, כולל ספריית לקראת הדור הבא רצפי, ליצירת epigenomic הכללית ו- RNA הקשורים כרומטין תאים ES.

CARIP-Seq ו שבב-Seq: שיטות לזיהוי RNAs הקשורים כרומטין והן אינטראקציות חלבון-DNA בתאי גזע עובריים

קביעה מדויקת של מיקומים מחייבי חלבון ברחבי הגנום חשובה להבנת ויסות הגנים. כאן אנו מתארים שיטת מיפוי גנומית המטפלת בדנ"א כרומטין-אימונו-חיסוני עם עיכול exonuclease (ChIP-exo) ואחריו רצף תפוקה גבוהה. שיטה זו מזהה אינטראקציות בין חלבון לדנ"א עם רזולוציית מיפוי קרובה של זוג בסיס ויחס אות לרעש גבוה בנוירונים של יונקים.

מיפוי ברזולוציה גבוהה של אינטראקציות חלבון-DNA בתאי גזע עכבר נוירונים באמצעות כרומטין Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo)

מאמר זה מתאר פרוטוקול ChIP-Seq בעל קנה מידה זעיר של אזורי DNA הקשורים לשינוי histone ספציפי (H3K27ac) באמצעות פלטפורמת מטפל בנוזל ChIP, ואחריו הכנת ספריה באמצעות tagmentation. ההליך כולל הערכת בקרה למטרות איכות וכמות וניתן לאמץ אותו לשינויי histone אחרים או גורמי תמלול.

הליך ChIP-Seq חצי-אטומי למחקרים אפיגנטיים בקנה מידה גדול

מחקר זה מציג פרוטוקול מולטיאום מרחבי Trekker–CUT&amp;Tag, המשלב ברקידוד מרחבי ישיר של חתך רקמה עם ניתוח מולטיאום חד-תאים. גישה זו מאפשרת פרופילינג חד-תאי של ביטוי גנים ושינוי ההיסטון H3K27ac בו-זמנית, ומציעה תובנות מכניות על ויסות גנים בהקשר של מיקרואנטומיה של רקמות.

לאחר פתרון מרחבי, פרופיילינג מולטיאומי חד-תאי משולב של מטרות טרנסקריפטום ואפיגנומיה בחתכי רקמה קפואים.

למד את פרוטוקול tChIP-Seq לניתוח שינויים בהיסטונים ספציפיים לסוג תא בנוירונים של עכברים. שיטה זו מאפשרת בידוד כרומטין ממטרות ספציפיות ומספקת תובנות לגבי רגולציה אפיגנטית בגנום.

TChIP-Seq: יצירת פרופילים ייחודיים לסוג התא Epigenome

גלה סרטונים נוספים