TChIP-Seq: יצירת פרופילים ייחודיים לסוג התא Epigenome
23 בינואר 2019
אנו מתארים פרוטוקול צעד אחר צעד עבור טנדם כרומטין רצף immunoprecipitation (tChIP-Seq) המאפשרת הניתוח של שינוי היסטון הגנום כולו ייחודיים לסוג התא.
שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האפיגנטיקה כגון כמה שינויים כרומטיים מוסדרים באופן ספציפי לסוג התא יחד עם גנומים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנחנו יכולים לבודד כרומטין מהתאים הממוקדים ולאחר מכן בצע צועני טיפוסי במורד הזרם. אז שיטה זו יכולה לספק תובנות לתוך trimincil ספציפי נוירון, lysinc 4, opisoncilly.
זה יכול להיות מיושם גם על שינוי histone אחרים, סוגי תאים אחרים, ולאחר מכן אורגניזמים מודל אחרים. הדגימה של ההליך תהיה מארי מיטו, טכנאית מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, להשתמש מספריים האביב בסדר לנתח את הרקמה של עניין לחתיכות קטנות.
מוסיפים את שברי הרקמה למיכל נקי מלא בחנקן נוזלי. לאחר מכן, להעביר את שברי הרקמה לשני צינורות מיליליטר מלא חנקן נוזלי. לאחסן את הצינורות במינוס 80 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות עם הכובע פתוח כדי לאדות את החנקן הנוזלי.
מניחים את הצינורות המכילים את דגימות הרקמה על מתלה קרח מתכתי צונן. לאחר מכן, מניחים כדור מתכת בצינור 1.5 מיליליטר ומצננים אותו עם חנקן נוזלי. מניחים את כדור המתכת המצונן לאחד מצינורות הדגימה.
סגרו את הכובע והגדירו את הצינור למחזיק הצינור של מטחנה קריוגנית. מיד, לטבול את מחזיק הצינור התאספו חנקן נוזלי במשך דקה אחת. הכנס את מחזיק הצינור הקפוא לתוך הקלטת החיצונית של המטחנה הקריוגנית.
ולנער אותו במרץ במשך 30 שניות, 60 פעמים. לאחר מכן, לפרק את המטחנה קריוגניים, להסיר את כדור המתכת. ומ מניחים את הצינור לתוך מצנן מדגם מקורר מראש.
לאחסן את הצידנית ב 20 מעלות צלזיוס שלילי במשך 15 דקות. לאחר מכן, הוסיפו 900 מיקרוליטרים של 1% פורמלדהיד לצינור ופיגט כדי לערבב. העבר את ההשעיה לצינור חדש של שני מיליליטר עם 900 מיקרוליטרים של 1% פורמלדהיד.
לאחר מכן, לתקן את ההשעיה במשך 10 דקות עם סיבוב עדין ב 23 מעלות צלזיוס. כדי לעצור את תגובת קיבעון, להוסיף 100 microliters של 2.5 גליצין טוחן לצינור. וצנטריפוגה ב 3,000 פעמים כבידה לחמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, השלך את העל-טבעי. מוסיפים מיליליטר אחד של PBS לצינור ומערבולת כדי לערבב. צנטריפוגה ב 3,000 פעמים כבידה לחמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.
חזור על שלב שטיפה זה, פעמיים נוספות. לאחר מכן, להוסיף 500 microliters של מאגר תזה אחד גלולה פיפטה לערבב. צנטריפוגה הצינור במשך חמש דקות ב 3, 000 פעמים כבידה בארבע מעלות צלזיוס ולהשליך את העל טבעי.
מוסיפים מיליליטר אחד של מאגר תזה 2 לכדור ומערבולת כדי לערבב. לאחר מכן, צנטריפוגה ההשעיה במשך חמש דקות ב 3, 000 פעמים כבידה בארבע מעלות צלזיוס ולהשליך את העל טבעי. לאחר מכן, להוסיף 800 microliters של מאגר בדיקה immunoprecipitation רדיו עם קוקטייל מעכב פרוטאז גלולה פיפטה לערבב.
צנטריפוגה ההשעיה במשך חמש דקות ב 3, 000 פעמים כבידה בארבע מעלות צלזיוס ולהשליך את העל טבעי. לאחר מכן, להוסיף 500 microliters של חיץ RIPA עם קוקטייל מעכב פרוטאז לכדור. לאחר מכן, צנטריפוגה ההשעיה במשך חמש דקות ב 3, 000 פעמים כבידה בארבע מעלות צלזיוס ולהשליך את העל טבעי.
מוסיפים מיליליטר אחד של חיץ RIPA עם קוקטייל מעכב פרוטאז. מיד לאחר הוספת חיץ RIPA עם קוקטייל מעכב פרוטאז, להעביר את lysate לצינור sonicator. ושים את הצינור על אולטרסוניאטור.
באמצעות ההגדרות המתוארות בפרוטוקול הטקסט, תטווה את הכרומטין. לאחר מכן, להעביר את המדגם לצינור חלבון נמוך 1.5 מיליליטר. וצנטריפוגה זה במשך חמש דקות ב20, 000 פעמים כוח הכבידה בארבע מעלות צלזיוס.
לאסוף את supernatant מהדגימה ולהעביר אותו צינור חלבון חדש מחייב נמוך. בפרוטוקול זה, רצף אימונופרציפיטציה כרומטין טנדם הוצג והוכח. במהלך ההליך נבדקה איכות הדנ"א במספר שלבים.
מיד לאחר sonication, ה-DNA מגושם היה מבודד ונבדק עם מכונת אלקטרופורזה microfluidic. לאחר שימוש בנוגדנים נגד FLAG ונוגדן אנטי H3K3me3 לביצוע טיהור זיקה, איכות ה- DNA נבדקה שוב. הספציפיות של טיהור החיסון של DNA על H2B-FLAG אושרה עם דגימות בקרה שליליות.
היכן שזוהו כמויות זניחות של דנ"א. בהמשך הפרוטוקול אומתה איכות ספריית רצף. ChIP ו- T-ChIP המוצלחים הוכחו באמצעות ניתוח העשרה באמצעות פריימרים המכוונים לאזור האמרגן של הגן GAPDH.
חלוקות ייצוגיות לאורך שלושה גנים נוירון הושגו. והעשרת קריאות בחמשת הקצוות המובילים של הגנים על ידי נוירון T-ChIP לחפש על המוח כולו T-ChIP לחפש נצפתה. לאחר ייצוב, טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום האפיגנטי לחקור שינוי היסטון ספציפי לסוג התא באופן כללי בנוירונים בעכברים.
אל תשכח כי עבודה עם פורמלדהיד יכול להיות מסוכן מאוד לנקוט אמצעי זהירות כגון לבישת בגדי גומי ומשקפיים תמיד צריך להילקח בעת ביצוע הליך זה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט לרצף אימונופריציפטציה של כרומטין טנדם (tChIP-Seq), ומדגיש את היישומותו בניתוח שינויים בהיסטונים הספציפיים לסוג התא בגנום. על ידי בידוד כרומטין מתאים ממוקדים, שיטה זו מאפשרת לחוקרים לחקור את הרגולציה האפיגנטית ולהעשיר את התובנות לגבי שינויים בהיסטונים הספציפיים לנוירונים.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המחקר
- אפיגנטיקה
- ניתוח שינויים בהיסטונים
- ספציפיות לסוג התא
רקע
- חשיבות שינויי הכרומטין בתפקוד התאי
- פוטנציאל להבנת התפתחות ותפקוד הנוירונים
- צורך בשיטות מדויקות לחקר שינויים בהיסטונים
שיטות ששימשו
- רצף אימונופריציפטציה של כרומטין טנדם (tChIP-Seq)
- תאי נוירון עכבר כמודל ביולוגי
- טיהור זיקה ובדיקת איכות DNA באמצעות אלקטרופורזה
תוצאות עיקריות
- אימות העשרה של שינויים בהיסטונים הספציפיים לתאי נוירון
- הוכחת ספציפיות הטיהור החיסוני עם בקרות שליליות
- תצפיות מפורטות של שינויים בהיסטונים לאורך גנים של נוירונים
מסקנות
- מחקר זה מספק פרוטוקול חשוב לחקר שינויים בהיסטונים באופן ספציפי לסוג התא.
- הוא מדגיש את החשיבות של tChIP-Seq בקידום המחקר באפיגנטיקה, במיוחד בהבנת ביולוגיית הנוירונים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Cell-type-specific epigenome profiling addresses a critical gap in target validation by enabling precise interrogation of histone modifications in defined cellular populations. This capability enhances predictive confidence in preclinical models by reducing biological noise from heterogeneous tissues. tChIP-Seq supports mechanistic de-risking in early discovery by linking epigenetic states to functional outcomes in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables therapeutic hypothesis interrogation through cell-type-specific chromatin state mapping.
- Operational Value: Provides biological de-risking by isolating epigenetic signals from target cell populations.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by clarifying mechanistic pathways in disease-relevant systems.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream epigenetic screening workflows.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through controlled chromatin isolation.
- Scalability: Enables platform reuse across histone modifications and model organisms.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains disease relevance from discovery through preclinical validation via neuron-specific epigenome profiling.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports decisions by linking histone modification patterns to functional gene expression.
- Biomarker Alignment: Facilitates translational biomarker development through epigenomic readouts in target cells.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification by providing epigenomic resolution in purified cell types.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through cell-type-specific chromatin analysis.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs for compound effect evaluation.
- Analytics: Generates enrichment measurements and sequencing readouts that enable condition comparison.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via neuron-specific epigenome profiling in disease models.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for epigenetic profiling across projects and histone marks.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in epigenetic regulation.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of chromatin isolation workflows.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in target validation.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on epigenomic fidelity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in epigenetics, molecular biology, and nucleic acid handling.
- Needs cryogenic grinding, sonication, and immunoprecipitation infrastructure.
- Demands cross-team standardization for chromatin preparation and antibody validation.
- Involves adaptation considerations across model systems and histone modification targets.
- Includes practical limitations such as tissue accessibility and formaldehyde handling hazards.
