Name: כריתת למינציה ואת חוט השדרה חלון השרשה בעכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: למד שיטת כריתת למינציה ושתלת חלון זכוכית בעמוד השדרה של עכברים לצורך הדמיה תוך-חייתית. שיטה זו מאפשרת מחקר דינמיקת חלבונים במערכת העצבים המרכזית ללא פגיעה ברקמה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

S.E. לוץ נתמך על ידי המרכז הלאומי לקידום המדעים הטרנסלאומיים, המכון הלאומי לבריאות, תחת גרנט KL2TR002002 ואוניברסיטת אילינוי שיקגו המכללה להתחלת הרפואה. סיימון Alford נתמך על ידי RO1 MH084874. התוכן הוא רק באחריות המחברים ואינו מייצג בהכרח את ההשקפות הרשמיות של ה-NIH. המחברים מודים לdritan Agalliu במחלקה לנוירולוגיה במרכז הרפואי של אוניברסיטת קולומביה, עבור העכברים Tg-5, הידברות המדעית והתובנות לגבי פיתוח הפרוטוקול הכירורגי ויישומי ההדמיה. המחברים מודים סוניל P. גנדי במחלקה לנוירוביולוגיה והתנהגות באוניברסיטת קליפורניה, אירווין לעיצוב האבטיפוס הראשון של מנגנון הסטריאוטקטיקה ובקר בעלי החיים, דיון בפרוטוקול הכירורגי ו אימונים. במיקרוסקופיה של שתי פוטון המחברים גם מודים לסטיב פיקנס (Nuhsbaum, Inc) לקבלת סיוע בהתאמה אישית של stereomicroscope כירורגי, רון ליפסקי (ייצור לוויתן) לעיבוד חלקי סטריאוטקטיקה.

כל הניסויים הולכים בעקבות האוניברסיטה של אילינוי, שיקגו מוסדית לטיפול בבעלי חיים ופרוטוקולי הוועדה. . זהו תהליך סופני
1. הכנה מגיב
<ol><li>הכנת נוזל השדרה מלאכותי מוחין (aCSF) כדי להכיל 125 mM הנאקל, 5 מ"מ KCl, 10 מ"מ גלוקוז, 10 מ"מ HEPES, 2 מ"מ MgCl2 ·6h 2 o, 2 מ"מ cacl2· 2H2o ב Ddh2 o.מסנן סטרילי ו להקפיא בשימוש בודדים השתמש ali,. חמה aCSF באמבט מים 39 ° c לפני השימוש.</li>
	<li>חום נמוך התכה הנקודה (2%) ב-aCSF עד התפרקה לחלוטין באמבט מים ל65 ° c. במהלך כריתת למינציה, מגניב את agarose מומסת עד 39 ° צ' באמבט מים, כך שהוא יכול להיות מוכן קרוב לטמפרטורה הפיזיולוגית עבור שלב 5.2. הערה: ניתן לאחסן את הפתרון האגקם ב-20 ° c בעלי שימוש יחיד.</li>
	<li>הכן סטרילי 50 mg/mL carprofen במים בקטיוסטטיים. חנות ב -4 ° c.</li>
	<li>נקי כיסוי-משקפיים עם 70% אתנול, 3 שוטף של ddH2O, ולאחסן יבש במיכל ללא אבק.</li>
</ol>2. לוח הדפסה תלת-ממדי
<ol><li>השתמש בתוכנת 3D CAD משמש ליצירת מודל לממדים המוצגים באיור 1. הפנים הוא אליפסה הרחב ביותר במשטח התחתון ביחס למדפסת לחתוך עם לונופה לחתוך לאליפסה קטנה יותר להרכיב לומן על פני השטח הנגדי. שתי זרועות מקרינים עם חורים כדי לקבל ברגים להאריך באופן משני, עבור המצורפים המזלג החזקת לוחית. ממבנה תלת-ממד זה, צרו קובץ שינוי משולש תלת-ממד (. קובץ STL). הערה: ראה איור 1B\u2012 2012D וקבצים משלימים 1 ו-2.</li>
	<li>העלה את הקובץ התלת-ממדי של רשת השינוי למדפסת תלת-ממדית.</li>
	<li>הדפס לוחות רקע באמצעות זרבובית 0.4 mm לקצה חם וגובה שכבה 0.2 מ"מ. בחר טמפרטורת חרירים של 205 ° צ', טמפרטורת המיטה של 45 ° c, ומהירות ההדפסה של 45 mm/s.</li>
	<li>העריכו את הרקע המודפס של הדפסת תלת-ממד התוצאות באופן חזותי עבור תקינות מבנית (איור 1E); כישלון מבנית גולמי (נעדר לומן, קיר מכווץ) מציין פגמים בהדפסה (איור 1F).</li>
</ol>3. הכנה כירורגית
<ol><li>מחממים את משטח החימום.</li>
	<li>בזמן שאתה עובד. בתוך מכסה כימי חברו את מזרק המשלוח. ליחידת האספקה</li>
	<li>בחר עכבר בן 8 \ u201212 בשבוע. . שוקלים את החיה לגרום להרדמה באמצעות 2%. בחדר האינדוקציה הכנס carprofen ב 5 מ"ג/ק"ג תת-עורי.</li>
	<li>הצב את האף-חרוט ולספק isofלאנה ב 2% עם שיעור הזרימה של 150 mL/min עבור תחזוקה של מישור כירורגי של הרדמה (איור 2A= =E). עוטפים את משטח החימום עם משטח סופג חד פעמי בשביל להקל על ניקוי.</li>
	<li>מיקום חיה על כרית החימום בתחנת הניתוח ולהתקין את קונוס האף. לשמן את התרמומטר עם ריבת נפט ולהכניס אותו 5 מ"מ לתוך הרקטום. הקלטת את התרמומטר לבדוק את הזנב ליציבות. החלת משחה אופטלמולוגית לעיניים של העכבר.</li>
	<li>כדי לשמור על מחות, להחיל 200 μL של מענה הפתרון של החיסון על ידי הזרקה תת עורית כל 30 דקות עד סיום הניסוי.</li>
	<li>רסס את dorsum עם 70% אתנול, להסיר פרווה עם קוצץ, ולנקות את האתר עם povidone-יוד.</li>
</ol>4. כריתת למינציה
<ol><li>מקמו את החיה בין פסי האוזן; אלה לשמור על המיקום הראשי של העכבר ביחס האף-קונוס.</li>
	<li>ודא כי בעלי חיים הוא מורדם עמוקות כמו המשוער על ידי חוסר של רפלקס הפינצ ' בתוך המערכת ואת הנשימה יציבה.</li>
	<li>לעשות חתך 1.5 ס מ rostral-caudal על קו האמצע מעל בית החזה התחתון/העליון באזור המותניים באמצעות #11 להב (איור 2). הפרידו את העור על ידי האוחז בו בעזרת מלקחיים בעלי שיניים בוטים ו/או אצבעות כעערות. השתמש מלקחיים כדי להפריד ולקלף לאחור כל רקמת חיבור שקופה שנותרה מתחת לעור. כעת יש לחשוף את השרירים השטפתם; לתפוס את זה עם חנית כירורגית קצף.</li>
	<li>שימוש בחניתות כירורגיים מקלקר (או מכוש) כדי לנקות את השרירים הנותרים, עמוק יותר של חוליית היעד (בית החזה 12). כדי ליצור מושב עבור הלוח האחורי, גם לנקות את השריר מן ההיבט האחורי של בית החזה 11, ואת ההיבט הקדמי של בית החזה 13. לשלוט על כל דימום על ידי החלת לחץ עדין עם חנית כירורגית או להשתמש בדופק מינימלי עם אקדח קאטרי. המשך להסיר את השריר שנותר הרחק הגידים באמצעות מלקחיים</li>
	<li>לאחר הסרת השרירים, לנתק בזהירות את הגידים על ידי חיתוך עם מלקחיים. צריך להיות מקום רב להמחיש ולתמרן את החוט כאשר שלב זה הושלם. בדוק כי החומר הדורא של החלל הבין-החוליות, עצם שקוף למחצה שכבתית, כלי הדם השטחית המרכזי מתחת לעצם, ועורק מקרין קדמי מוצגים כעת בבירור.</li>
	<li>להרטיב את האזור עם aCSF חם. השתמש במיקרו-מקדחה כדי ליישר את העצם הלמינארי באמצעות משיכות ישרות במקביל לציר הארוך של חוט השדרה (איור 2, איור 3). אם רצונך בכך, להשתמש בשלב דאייה כדי לסובב את פלטפורמת כירורגי עבור נוחות ארגונומית משופר (למשל, מפעיל יד ימין יכול לסובב את פלטפורמת כירורגי נגד כיוון הקידוח). הערה: השלב דאייה המשמש בנוי צלחת אלומיניום העליון השקופיות ± 15 מ"מ ביחס לוחית הבסיס קבוע.</li>
	<li>לתפוס בעדינות את התהליך שטחי spinous עם מלקחיים ולהרים את החוליה; העצם צריך להתרחק בקלות. אם יש התנגדות, לחזור על עצם דליל עם התרגיל ואם הצורך להשתמש במספריים הקשתית, להיות זהיר כדי לכוון את קצות המספריים כלפי מעלה כדי למנוע פגיעה ברקמה. הערה: כדי לשמור על השכבה ללא פגע, זה חיוני לא למשוך את העצם.</li>
	<li>השתמש #4 מלקחיים כדי לנקות את רסיסי העצם. השתמש בחנית כירורגית כדי להחיל לחץ יציב בעדינות כדי לשלוט על כל דימום. לשטוף את הרקמה עם aCSF חם. אל תאפשר לרקמות להתייבש.</li>
</ol>5. כיסוי-השתלת זכוכית
<ol><li>בעדינות להחיל 3 מ"מ כיסוי בורוסיליקט-זכוכית לחוט החשוף.</li>
	<li>הבטחה לעלות הצמח מקורר ל-39 ° c. באמצעות מרית קטנה, למרוח חם 2% agarose/aCSF לקצה של זכוכית כיסוי ולאפשר פעולה קפילר לצייר אותו מתחת לפני השטח. הערה: בטמפרטורה מתחת 39 ° c, העלה עשוי להתחיל ג'ל. אם זה קורה, לחמם מחדש באמצעות אמבט מים או מיקרוגל. מפעילים מסוימים מעדיפים להחיל תחילה טיפה אחת של הצמח ולהניח את העטיפה על הזכוכית העליונה.</li>
	<li>החלת דבק רקמה על התהליכים הגרקולריות חשוף של החוליה הסמוכה שלמה ברמת הבית החזה 11 החוליות עמוד השדרה ואת החזה ברמה 13 החוליות השדרה. החל דבק רקמות נוסף בטבעת סביב האתר כריתת למינציה, על הגיד הסמוך ואת התהליך הרוחבי. הערה: דבק ברקמה נדרש לדבקות מתאימה של מלט שיניים בשלבים הבאים. התהליכים הפרקולתיים יוצרים מושב טבעי שעליו משענת הלוחית האחורית (איור 3). הדבקה לתהליכים הפרקולתיים מהווה את נקודות ההחזקה החזקות ביותר.</li>
	<li>מערבבים מלט שיניים עם מאיץ במגש ערבוב פורצלן. לנצל מרית קטנה כדי להעביר צמנט שיניים על שכבת דבק רקמה. השתמש מלט שיניים לדבוק את הלוחית האחורית לשדה כירורגי, ממורכז מעל החלון. הרשו 10 דקות להמלט שיניים לרפא. הערה: החברה הדבקה של הלוח האחורי לתהליכים המדעיים הקדמי והאחוריים מספקת את יציבות המבנה הבסיסית של השתל.</li>
	<li>השתמש במלט שיניים נוספים כדי למלא את הבסיס הפנימי של הלוחית האחורית, ואת החלק התחתון של הלוחית האחורית: ממשק הרקמה. הערה: היישום הנוסף של מלט שיניים משפר את הדבקות ומפחית את הסיכון של דליפה של נוזלי טבילה אובייקטיבית מיקרוסקופ (מלוחים) החוצה את החלק התחתון של לוחית האחוריות.</li>
	<li>העבר את מחזיק לוחית הגיבוי למיקום המתאים מהחלון. לאבטח את הלוחית האחורית לתוך מחזיק לוחית הגיבוי עם ברגים. הערה: פרוטוקול זה ניצל מחזיק מראש לוחית לאחור (איור 2G\U2012H).</li>
	<li>החלת תמיסת מלח על הלוחית האחורית כדי לבדוק דליפה. אם כל נוזל דולף, לייבש את האזור ולהחיל מלט שיניים יותר.</li>
</ol>6. הכנת הדמיה
<ol><li>העבירו את החיה על המשטח הכירורגי לשולחן האופטי. הערה: הפלטפורמה הכירורגית שלנו, מחזיק לוחית הגיבוי, ומחזיק האף-קונוס של המערכת ניתן להעביר בין תחנות ניתוח והדמיה של שני הפוטונים כיחידה אחת, תוך החלת הרדמה רציפה (איור 2D,H). יחידות דומות ניתן להרכיב מתוך החזקת מזלגות, קורות, תמיכה עמוד הודעות השגה ממקורות מסחריים (g. מעבדות המשך). עבור המיקרוסקופיה, צריך להיות לפחות 11 סנטימטרים של סיווג בין מטרת המיקרוסקופ לבין הטבלה האופטית כדי להתאים את הגובה של הפלטפורמה הכירורגית.</li>
	<li>לצרף את הפלטפורמה כירורגי לטבלה אופטית באמצעות הצבה הרכבה נירוסטה ומזלג לאחר הסתעפות משועמם.</li>
	<li>החלת תמיסת מלח טרייה. בבאר של הלוחית האחורית להוריד עדשה טבילה במים לתוך הבאר.</li>
	<li>השתמש באור שמועבר או אפילייט כדי לזהות את אזור העניין והמיקוד. עבור למצב סריקת לייזר ולבצע הדמיה vivo על פי המתאים שני הפוטון לייזר הריגוש גל, dichroics ו-bandpass מסננים עבור fluorophores נוכח ברקמה6.</li>
</ol>

<ol><li>Weinger, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+cellular+dynamics+in+the+mouse+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of cellular dynamics in the mouse spinal cord.</a> Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).</li>
<li>Davalos, D., Akassoglou, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+the+mouse+spinal+cord+using+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (59), (2012).</li>
<li>Farrar, M. J., Schaffer, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+procedure+for+implanting+a+spinal+chamber+for+longitudinal+in+vivo+imaging+of+the+mouse+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A procedure for implanting a spinal chamber for longitudinal in vivo imaging of the mouse spinal cord.</a> Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).</li>
<li>Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implanting+glass+spinal+cord+windows+in+adult+mice+with+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Implanting glass spinal cord windows in adult mice with experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Journal of Visualized Experiments. (82), e50826(2013).</li>
<li>Figley, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spinal+cord+window+chamber+model+for+in+vivo+longitudinal+multimodal+optical+and+acoustic+imaging+in+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">A spinal cord window chamber model for in vivo longitudinal multimodal optical and acoustic imaging in a murine model.</a> PLOS ONE. 8 (3), e58081(2013).</li>
<li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+tissue+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).</li>
<li>Liebner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+morphology+of+the+blood-brain+barrier+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Functional morphology of the blood-brain barrier in health and disease.</a> Acta Neuropathologica. 135 (3), 311-336 (2018).</li>
<li>Shen, L., Weber, C. R., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tight+junction+protein+complex+undergoes+rapid+and+continuous+molecular+remodeling+at+steady+state%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The tight junction protein complex undergoes rapid and continuous molecular remodeling at steady state.</a> Journal of Cell Biology. 181 (4), 683-695 (2008).</li>
<li>Knowland, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepwise+recruitment+of+transcellular+and+paracellular+pathways+underlies+blood-brain+barrier+breakdown+in+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Stepwise recruitment of transcellular and paracellular pathways underlies blood-brain barrier breakdown in stroke.</a> Neuron. 82, 1-15 (2014).</li>
<li>Lutz, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caveolin1+Is+Required+for+Th1+Cell+Infiltration%2C+but+Not+Tight+Junction+Remodeling%2C+at+the+Blood-Brain+Barrier+in+Autoimmune+Neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Caveolin1 Is Required for Th1 Cell Infiltration, but Not Tight Junction Remodeling, at the Blood-Brain Barrier in Autoimmune Neuroinflammation.</a> Cell Reports. 21 (8), 2104-2117 (2017).</li>
<li>Harrison, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertebral+landmarks+for+the+identification+of+spinal+cord+segments+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Vertebral landmarks for the identification of spinal cord segments in the mouse.</a> Neuroimage. 68, 22-29 (2013).</li>
<li>Cupido, A., Catalin, B., Steffens, H., Kirchhoff, F. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/protocol/10.1007/978-1-4939-0381-8_2">Laser Scanning Microscopy and Quantitative Image Analysis of Neuronal Tissue</a>. Bakota, L., Brandt, R. , Springer. New York. 37-50 (2014).</li>
<li>Sekiguchi, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+large-scale+cellular+activity+in+spinal+cord+of+freely+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Imaging large-scale cellular activity in spinal cord of freely behaving mice.</a> Nature Communications. 7, 11450(2016).</li>
<li>Nadrigny, F., Le Meur, K., Schomburg, E. D., Safavi-Abbasi, S., Dibaj, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser-scanning+microscopy+for+single+and+repetitive+imaging+of+dorsal+and+lateral+spinal+white+matter+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Research%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser-scanning microscopy for single and repetitive imaging of dorsal and lateral spinal white matter in vivo.</a> Physiological Research. 66 (3), 531-537 (2017).</li>
<li>Adelsperger, A. R., Bigiarelli-Nogas, K. J., Toore, I., Goergen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+Low-flow+Digital+Anesthesia+System+for+Mice+and+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Use of a Low-flow Digital Anesthesia System for Mice and Rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).</li>
<li>Damen, F. W., Adelsperger, A. R., Wilson, K. E., Goergen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Traditional+and+Integrated+Digital+Anesthetic+Vaporizers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Comparison of Traditional and Integrated Digital Anesthetic Vaporizers.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (6), 756-762 (2015).</li>
<li>Miyamoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+COX-2+inhibitor+celecoxib+prevents+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+through+COX-2-independent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Selective COX-2 inhibitor celecoxib prevents experimental autoimmune encephalomyelitis through COX-2-independent pathway.</a> Brain. 129 (Pt 8), 1984-1992 (2006).</li>
<li>Muthian, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COX-2+inhibitors+modulate+IL-12+signaling+through+JAK-STAT+pathway+leading+to+Th1+response+in+experimental+allergic+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">COX-2 inhibitors modulate IL-12 signaling through JAK-STAT pathway leading to Th1 response in experimental allergic encephalomyelitis.</a> Journal of Clinical Immunology. 26 (1), 73-85 (2006).</li>
</ol>

. למחברים אין מה לגלות

השיטה המתוארת כאן מאפשרת הדמיה יציבה של חוט השדרה בעכברים דרך חלון זכוכית. שיטה זו הוחל על הערכת שיפוץ BBB ב-הטרנסגניים eGFP: Claudin5 +/-עכברים המבטאים חלבון מהיר BBB הצומת צר, אבל זה יכול להיות מיושם גם היטב למחקרים של חלבונים פלורסנט או תאים בחוט השדרה.
פותחו מספר שיטות לניתוח למינציה ולייצוב חוט השדרה. כל הפרוטוקולים מייצבים את חוט השדרה במהלך הטמעת ההדמיה והחלון לגישה חזותית למבנה העניין. מספר החוליה הוסר ומידת הפולשנית של הפרוטוקולים הזמינים משתנה (לדוגמה, רכיבים המודבקים על פני...

דגמי החיות הטרנסגניים מבטאים חלבונים פלורסצנט, כאשר הם משולבים עם מיקרוסקופ אינטרטל, מספקים פלטפורמה רבת עוצמה לטיפול בביולוגיה ופתופסולוגיה. כדי להחיל טכניקות אלה על חוט השדרה, פרוטוקולים מיוחדים נדרשים להכין את חוט השדרה עבור הדמיה. אסטרטגיה אחת כזו היא לבצע כריתת למינציה והשתלת חלון חוט השדרה. התכונות המרכזיות של פרוטוקול כריתת למינציה אידיאלית למיקרוסקופיה כוללות שימור מבנה ותפקוד של רקמות מקוריות, יציבות של שדה ההדמיה, זמן עיבוד מהיר ושלילת תוצאות. אתגר מסוים הוא לייצב את שדה ההדמיה נגד התנועה הנגרמת על ידי נשימה ודופק. מספר vivo ex ואסטרטגיות vivo דווחו כדי להשיג את המטרות הללו1,2,3,4,5. רוב בשיטות vivo כרוכות לאורך הדרך בעמוד השדרה2,4 ולעתים קרובות לאחר מכן על ידי השתלת מנגנון מתכת נוקשה3,4 עבור יציבות במהלך הניתוח ו יישומי דימות במורד הזרם. לחיץ את עמוד השדרה יכול להתפשר על זרימת הדם ולגרום דם-מוח מחסום (BBB) שיפוץ חלבון.
מטרת שיטה זו היא להפוך את חוט השדרה שלמים זמין לדימות אופטי בעכבר החי תוך מזעור הפלישה של הפרוטוקול ושיפור התוצאות. אנו מתארים כריתת למינציה אחת וכיסוי השתלת זכוכית הליך לזווג עם מינימלית פולשנית האליפסה 3d מודפס מתכתי שעדיין משיגה יציבות מכנית חזקה. לוחית הגיבוי היא דבקה ישירה השדרה הקדמית והאחורי החוליות עם מלט שיניים. הלוחית האחורית מצוידת בזרועות הארכה לרוחב עם חורי בורג שמתחברים באופן נוקשה לשלב המיקרוסקופ דרך זרוע מתכת. זה מעגן ביעילות את החוליה הקדמית והאחורי ללא שינוי לשלב המיקרוסקופ, מתן עמידות מכנית לחפץ התנועה שאחרת הוכנסו על ידי נשימה ודופק. השיטה ממוטבת עבור כריתת למינציה של חוליה אחת ברמת בית החזה 12, השמטת את התפסים מנוצל אסטרטגיות חלופיות ליציבות במהלך הדמיה vivo . ההליך הוא מהיר, לוקח כ 30 דקות לכל עכבר.
פרוטוקול זה יכול לשמש לחקר מנגנוני המחלות של BBB. Bbb הוא מערכת דינמית מיקרוסקולרית מורכבת של תאים אנדותל, שריר חלק כלי הדם, קרום הלב, ו אסטרוציט ברגל תהליכים המספקים סביבה סלקטיבית מאוד עבור מערכת העצבים המרכזית (cn). נתונים מייצגים מתארים את היישום של פרוטוקול זה בעכברים טרנסגניים הנדסה לבטא חלבון פלורסנט ירוק משופר (eGFP): קלאודין 5, חלבון BBB צר הצומת. ניתן גם להתאים אישית את קבצי ההדפסה מלוח הרקע עבור יישומים חלופיים.

<table><tbody><tr><td>מדפסת תלת מימד</td><td>Raise3D</td><td>Pro2</td><td>להדפסת לוחות אחוריים</td></tr><tr><td>נימה להדפסת תלת מימד PLA</td><td>Inland</td><td>PLA+-175-B</td><td>חומר הדפסת תלת מימד מפלסטיק שחור</td></tr><tr><td>תוכנת CAD</td><td>Dassault Systemes</td><td>Solidworks</td><td>המשמשת לעיצוב צורות תלת</td></tr><tr><td>מימד תוכנת מדפסת תלת מימד</td><td>תוכנת Raise3D</td><td>Ideamaker</td><td>המשמשת לממשק עם מדפסת תלת מימד</td></tr><tr><td>לוח אחורי סגלגל מודפס בתלת מימד</td><td>מותאם אישית</td><td></td><td>שדה הדמיה מייצב</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ ניתוח כירורגי</td><td>Leica</td><td>M205 C</td><td>מצויד ב-Leica FusionOptics, Planapo 0.63x M-series אובייקטיבי,</td></tr><tr><td>ומצלמת מיקרוסקופ</td> שלב גלישה <td>Leica</td><td>MC170</td><td>HD מצלמה צבעונית להדמיית שדה כירורגי</td></tr><tr><td>שלב גלישה</td><td>Leica</td><td>10446301</td><td>שלב הגלישה בנוי משתי לוחות מתכת. לוחית הבסיס קבועה. הצלחת העליונה מחליקה על ממשק משומן כדי לאפשר תנועה סיבובית וליניארית.</td></tr><tr><td>תחנה כירורגית ומזלג ייצוב</td><td>לוויתן Manufactoring</td><td>מותאם אישית</td><td>Laminectomy</td></tr><tr><td>SomnoSuite יחידת אספקת איזופלורן בזרימה נמוכה</td><td>קנט סיינטיפיק</td><td>SS-01</td><td>ניהול הרדמה כירורגית עם וופורייזר דיגיטלי משולב</td></tr><tr><td>נירוסטה 1.5 אינץ' עמוד הרכבה</td><td>ThorLabs</td><td>P50/M</td><td>להרכבת תחנה כירורגית על שולחן אופטי להדמיה</td></tr> <tr><td>דו-פוטוניתמזלג הידוק משועמם להרכבה בגודל 1.5 אינץ' Post</td><td>ThorLabs</td><td>PF175</td><td>לייצוב תחנה כירורגית הרכבה על שולחן אופטי להדמיה דו-פוטונית</td></tr><tr><td>מיקרו-מקדחה עצם אידיאלית</td><td>מנגנון הרווארד</td><td>72-6065</td><td>עצם דלילה לכריתת למינקטומיה</td></tr><tr><td>אמבט מים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>15-462-10</td><td>התחממות</td></tr><tr><td>מי מלח אקדח קוטרי</td><td>FST</td><td>18010-00</td><td>צריבה מינורית מדמם</td></tr><tr><td>כרית חימום</td><td>Benchmark</td><td>BF11222</td><td>מחמם סיליקון 1.9 אינץ' x 4.5 אינץ' עם 20 אינץ' מובילי טפלון, 10W, 5V</td></tr><tr><td>K סוג בדיקה רקטלית מצמד תרמי</td><td>Physitemp</td><td>RET3</td><td>מדידת טמפרטורת גוף העכבר</td></tr><tr><td>ג'לי נפט</td><td>Sigma</td><td>8009-03-8</td><td>בדיקה רקטלית סיכה</td></tr><tr><td>בקר תרמי מווסת משוב</td><td>מותאם אישית</td><td>NA</td><td>חלופות זמינות מסחרית כוללות את סדרת Physitemp TCAT</td></tr><tr><td>PVA חניתות עיניים כירורגיות</td><td>Beaver-visitec international</td><td>40400-8</td><td>גוזם חשמלי סופג דם</td></tr><tr><td></td><td>Wahl</td><td>41590-0438</td><td>חיתוך להב פרוות עכבר</td></tr><tr><td>, #11</td><td>FST</td><td>14002-14</td><td>מלקחיים לכלי כירורגי</td></tr><tr><td>, #5</td><td>FST</td><td>11254-20</td><td>מלקחיים לכלי כירורגי</td></tr><tr><td>, #4</td><td>FST</td><td>14002-14</td><td>כלי כירורגי</td></tr><tr><td>מלקחיים עם שיניים טיטניום</td><td>WPI</td><td>555047FT</td><td>כלי כירורגי</td></tr><tr><td>מספריים טיטניום איריס</td><td>WPI</td><td>555562S</td><td>כלי כירורגי</td></tr><tr><td>דבק רקמות Vetbond</td><td>3M</td><td>084-1469SB</td><td>הכנת משטח רקמה למגש ערבוב קרמי אקרילי דנטלי</td></tr><tr><td></td><td>Jack Richeson</td><td>420716</td><td>ערבוב חומר אקרילי דנטלי עם מאיץ</td></tr><tr><td>Orthojet אקריליק דנטלי</td><td>Lang Dental</td><td>1520BLK, 1503BLK</td><td>הדבקה לצמיתות של לוח אחורי לרקמה</td></tr><tr><td>זכוכית כיסוי עגולה קטנה, עובי #1, 3 מ"מ</td><td>מכשיר הרווארד</td><td>64-0720</td><td>חלון אופטי</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>7647-14-5</td><td>עבור aCSF</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>7447-40-7</td><td>עבור aCSF</td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>50-99-7</td><td>עבור aCSF</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>7365-45-9</td><td>עבור aCSF</td></tr><tr><td>MgCl2& מידות; 6H2O</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>7791-18-6</td><td>עבור aCSF</td></tr><tr><td>CaCl2&middot; 2H2O</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>10035-04-8</td><td>עבור aCSF</td></tr><tr><td>קרפרופן</td><td>רימדיל</td><td>QM01AE91</td><td>משככי כאבים</td></tr><tr><td>מים בקטריוסטטיים</td><td>הנרי שיין</td><td>2587428</td><td>מדלל לקרפרופן</td></tr><tr><td>איזופלורן</td><td>הנרי שיין</td><td>11695-6776-2</td><td>הרדמה</td></tr><tr><td>תמיסת רינגר חלב</td><td>בקסטר</td><td>0338-0117-04</td><td>הידרציה לעכבר</td></tr><tr><td>Agarose High EEO</td><td>Sigma</td><td>A9793</td><td>נקודת ג'ל 34-37 מעלות צלזיוס</td></tr><tr><td>משחת סיכה אופטלמית</td><td>Akwa</td><td>Tears 68788-0697</td><td>למנוע ייבוש קרנית</td></tr><tr><td>MOM מיקרוסקופ דו-פוטוני</td><td>סאטר</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

כריתת למינציה ואת חוט השדרה חלון השרשה בעכבר

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

פרוטוקול זה מתאר שיטה לניתוח חוט השדרה והשרשה חלון זכוכית עבור vivo הדמיה של חוט השדרה של העכבר. מאדה דיגיטלית משולבת מנוצל כדי להשיג מישור יציב של הרדמה בקצב נמוך בזרימה של isofלוריאן. עמוד שדרה אחד בחוליות מוסר, וזכוכית כיסוי מסחרית זמינה מצופה על מיטה דקה. הרקע פלסטיק 3D מודפס לאחר מכן מודבקת את השדרה השדרה הסמוכה באמצעות דבק רקמה ושיניים מלט. פלטפורמת ייצוב משמש כדי להפחית את התנועה מתוך נשימה ודופק. שיטה מהירה ונטולת מלחציים זו מתאימה היטב למיקרוסקופיה חריפה מרובת פוטון. נתונים מייצגים כלולים עבור יישום של טכניקה זו לשני פוטון המיקרוסקופיה של חוט השדרה ומיקרולטורה בעכברים טרנסגניים המבטא eGFP: קלאודין-5 – חלבון הצומת צר.

חלונות זכוכית מושתלים ומיקרוסקופ שני-פוטון מספק כלי שימושי להערכת שינויים דינמיים בחלבונים של המערכת. השלמות הפונקציונלית של BBB מושפעת מהביטוי, לוקליזציה תת-תאית ושיעורי תחלופה של חלבונים בעלי צומת צר7. מחקרים קודמים הוכיחו כי חלבונים הצומת צר עוברים שיפוץ מהיר ודינאמי במצב יציב8. כריתת למינציה המתואר כרגע וחלון זכוכית הכנה שימש הטרנסגניים eGFP: פרנסואז-5 עכברים9, אשר דוב פלורסנט הצומת הדוק חלבונים, כדי להעריך שיפוץ ...

פרוטוקול זה מתאר השרשה של חלון זכוכית אל חוט השדרה של העכבר כדי להקל על ההדמיה על ידי המיקרוסקופיה.

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

שיטה זו מאפשרת בדיקה של דינמיקת החלבון ב- vivo בתוך מערכת העצבים המרכזית ללא פגע כדי לענות על שאלות במדעי המוח ואימונולוגיה. היתרונות העיקריים של הליך זה הם יציבות תנועה מצוינת לרכישת תמונה, זמן ניתוחי קצר, חשיפה מופחתת מפעיל הרדמה גזית, ו backplates להתאמה אישית זול. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית קשה להסיר את העצם מבלי לפגוע ברקמת מערכת העצבים הבסיסית במהלך שלבי כריתת המעי הגס של ההליך.לפני תחילת ההליך, השתמש בתוכנת עיצוב בעזרת מחשב תלת-ממדי כדי ליצור מודל לממדים שצוינו. אז יש לנו חפץ, שהוא האובייקט התלת מימדי, עם זה אנחנו יכולים להתחיל. מה שאני יכול לעשות אז הוא אנחנו יכולים לשים הגדרות על זה עבור גירסת ההדפסה.אז אם אני פותח את ערוך את זה, להיכנס מתקדם, לפתוח חלון המאפשר לי להסתכל על כל ההגדרות האלה. הגדר את טמפרטורת הזרבובית ל-205 מעלות צלזיוס, את טמפרטורת המיטה ל-45 מעלות צלזיוס ואת מהירות ההדפסה ל-45 מילימטרים לשנייה במדפסת תלת-ממד. השתמש בזרבובית ent חמה 0.4 מילימטר וגובה שכבה של 0.2 מילימטר כדי להדפיס את הלוחות האחוריים.לאחר מכן להעריך את הלוחות האחוריים המודפסים חזותית לשלמות המבנית שלהם. כשלים מבניים חמורים מצביעים על פגמים בהדפסה. כאשר הצלחות האחוריות מוכנות, מניחים את ראשו של עכבר הרדמה בן שמונה עד 12 שבועות על כרית חום בין פסי האוזן של מרסן כירורגי ולהחיל משחה על העיניים של החיה.לאחר אישור חוסר תגובה קמצוץ בוהן, להשתמש בלהב מספר 11 כדי להפוך את rostral 1.5 ס"מ כדי caudal חתך קו האמצע מעל אזור המותני העליון בית החזה התחתון ולהפריד את העור מן הצדת. השתמש במקלפים כדי לקלף בחזרה כל רקמת חיבור שקופה שנותרה מתחת לעור כדי לחשוף את השרירים השטחיים. לעקור את השרירים עם חנית כירורגית קצף יחד עם השרירים העמוקים הנותרים של חוליית היעד.כדי ליצור מושב עבור הצלחת האחורית, לנקות את השריר מן ההיבט האחורי של בית החזה 11 ואת ההיבט הקדמי של בית החזה 13. שימוש במדפים כדי להסיר את השריר הנותר מן הגידים לפי הצורך. כאשר כל השריר הוסר, בזהירות לחתוך את הגידים עם מדחיפים עד מספיק מקום לדמיין ולתפעל את חוט השדרה מושגת.אשר כי מאטר דורה של החלל הבין חולייתי, עצם למינאר חצי תדר, כלי הדם השטחי המרכזי מתחת לעצם, ואת העורק המקרין לפנים גלויים בבירור. הרטב את האזור בנוזל מוח מלאכותי חם ולהשתמש מיקרו-מקדחה כדי לדלל את עצם למינאר באמצעות משיכות ישרות במקביל לציר הארוך של חוט השדרה. תופסים בעדינות את התהליך השטחי עם מטחנות, מרימים את החוליה.העצם צריכה להרים בקלות. השתמש במדפים מספר ארבע כדי לנקות את כל שברי העצם, שליטה בכל דימום עם חנית כירורגית ולחץ יציב עדין לפי הצורך. לאחר מכן שטפו את הרקמה בנוזל מוח מלאכותי חם.להשתלת זכוכית כיסוי, בעדינות להחיל זכוכית כיסוי borosilicate שלושה מילימטר על כבל חשוף. השתמש מרית קטנה כדי להחיל 39 מעלות צלזיוס התחמם 2% agarose על קצה הזכוכית ולאפשר פעולה נימי לצייר את agarose מתחת למשטח זכוכית כיסוי. החל דבק רקמות על תהליכי פרקי גרמי חשוף של החוליה הסמוכה שלם ברמה החזה 11 ו 13 קוצים חולייתיים.החל דבק רקמה נוסף בטבעת סביב אתר כריתת למין מעל הגיד הסמוך ואת התהליך הרוחבי. לאחר מכן, השתמש מרית חדשה כדי להחיל מלט שיניים מעורבב עם מאיץ על שכבת דבק הרקמה ולהחיל צלחת אחורית על השדה כירורגי מרוכז מעל חלון זכוכית כיסוי. החלת שכבות דקות מרובות של מלט דנטלי גורמת להיתוך חזק יותר של צלחת אחורית, אך הקפד למקם את הצלחת האחורית במהירות לפני שהמלט הדנטלי מתחיל להתייבש.לאחר מתן מלט שיניים לרפא במשך 10 דקות, למלא את הבסיס הפנימי ואת החלק התחתון של המקום האחורי עם דבק נוסף. החלת מלט שיניים בשכבות דקות יכול לעזור להפחית את הסיכון של מלט מתפשט על זכוכית כיסוי agarose, אשר יכול לסכן את הפרוטוקול כולו. כאשר המלט הדנטלי התייבש, יש למרוח מחזיק צלחת אחורית מנומקת על המיקום המתאים מעל החלון ולבורג את הצלחת האחורית למחזיק הצלחת האחורית.לאחר מכן להחיל מלוחים על הצלחת האחורית כדי לבדוק דליפה. לאחר מכן ניתן להעביר את החיה ואת הפלטפורמה הכירורגית לשולחן האופטי של מיקרוסקופ שני פוטון להדמיה דרך חלון הזכוכית המכסה. בניסוי מייצג זה, EGFP חיובי claudin-5 היה דמיין בתוך צמתים הדוקים שכותרתו פלואורסצנטי ברחבי מקלעת כלי דם.התיווח הברור של מבני הצומת ההדוקים בהקרנת Z מצביע על כך שתזוזת תמונה XY מינימלית מיוצרת לאחר כריתת למין מוצלחת, מיקום חלון והשתלת לוח אחורי. בעת ניסיון הליך זה חשוב לזכור כי מיקרוכירורגיה זו קשה ועשוי לקחת זמן לשלוט. עם זאת, לאחר השליטה, ניתוח זה יכול להתבצע כ 30 דקות.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כמו שני מיקרוסקופיית פוטון והדמיה של ויוו, כדי לענות על שאלות נוספות על שיפוץ כלי דם עצביים ותהליכי מחלה אחרים הקשורים לחוט השדרה.

laminectomy-and-spinal-cord-window-implantation-in-the-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

פרוטוקול פולשנית כדי לייצב את עמוד השדרה העכבר ולבצע...

בתחום ההדמיה vivo של חוט השדרה בעזרת עכבר דו פוטון מיקרוסקופית

השתלה של תאים העכבר גזע עצביים (NSCs) לתוך מיתרי השדרה של עכברים עם demyelination הוקמה מפורט. הכנה של NSCs, laminectomy של החוליה החזי 9 (T9), וכן השתלת NSCs מתוארת יחד עם הטיפול לפני ואחרי הניתוח של העכברים.

כירורגי של השתלת תאים עכבר גזע עצביים לתוך מיתרי השדרה של עכברים נגועים בנגיף הפטיטיס עכבר Neurotropic

סרטון זה מציג הליך כירורגי להשתלת חלון גולגולתי במודל עכבר לגישה אופטית יציבה לאזורים שונים במוח.

השתלת חלון הדמיה גולגולתי במודל עכבר: הליך כירורגי להשתלת כיסויים מבוססי זכוכית לגישה אופטית יציבה לאזורים במוח מורין

סרטון זה מדגים את רישום הפעילות העצבית של המוח דרך חלון אופטי בעכברים טרנסגניים. העכברים מבטאים חלבון פלואורסצנטי המאפשר זיהוי פעילויות עצביות. חלק קטן מהגולגולת מוסר בזהירות כדי להתקין חלון אופטי, ולאחר מכן הגולגולת מכוסה במלט שחור כדי לחסום אור לפני ההדמיה.

התקנת חלונות אופטיים במוחם של עכברים טרנסגניים כדי לדמות פעילויות עצביות

מקור: Pietruczyk, E. A., et al. כריתת למינקטומיה והשתלת חלון חוט השדרה בעכבר. J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים השתלת חלון חוט שדרה בעכבר מורדם להדמיה in vivo. הפרוטוקול מייצב את חוט השדרה החשוף באמצעות זכוכית כיסוי בורוסיליקט ולוח אחורי מודפס בתלת מימד. שיטה זו מאפשרת מיקרוסקופיה דו-פוטונית ברזולוציה גבוהה לחקור דינמיקה של מחסום דם-מוח ואינטראקציות נוירו-וסקולריות.

השתלת חלון חוט השדרה בעכבר להדמיה in vivo

וקטורים ויראליים לאפשר למניפולצית גן ממוקדת. אנחנו מדגימים את שיטה לביטוי גנים מותנים או אבלציה בחוט שדרת העכבר, באמצעות הזרקת stereotaxic של וקטור ויראלי לקרן האחורית, אתר בולט של קשר הסינפטי בין afferents החושיים הראשוניים ועצב של מערכת העצבים המרכזית.

הזרקת Stereotaxic של וקטור ויראלי למניפולציה גנטית מותנית בחוט השדרה המאוס

אנו מתארים שיטה להשתלה ותחזוקה של חלונות זכוכית מעל חוט השדרה החשוף של עכברים בוגרים לחקר דלקת מוח אוטואימונית ניסיונית. חלונות אלה מספקים גישה אופטית כרונית לחוט השדרה לניטור דינמיקת התאים ברמה התת-תאית בבעלי חיים חיים באמצעות מיקרוסקופיה דו-פוטונית.

השתלת זכוכית חוט השדרה של Windows בעכברים בוגרים עם ניסיון אוטואימוניות Encephalomyelitis

פגיעה בחוט השדרה היא מצב טראומטי שגורם לתחלואה קשה ותמותה גבוהה. בעבודה זו אנו מתארים בפירוט מודל חבלה של פגיעה בחוט השדרה בעכברים ואחרי השתלה של תאי גזע עצביים.

השתלת תאי גזע עצבית בדגם ניסיוני של Contusive פגיעה בחוט השדרה

בסרטון הזה, אנו מתארים הליך להשתלת חדר הדמיה אופטי כרוני על חוט השדרה הגבי של עכבר חי. קאמרי, ההליך כירורגי, וההדמיה כרונית נבדקים והפגינו.

נוהל השתלה קאמרי בעמוד השדרה לאורך In vivo הדמיה של כבל עכבר השדרה

פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור כריתת למינקטוע מדויקת עבור אינדוקציה של פגיעה יציבה בחוט השדרה מסוג transection במודל העכבר, עם נזק משני מינימלי למחקר פגיעה בחוט השדרה.

אינדוקציה של פגיעה מלאה בחוט השדרה מסוג טרנס-פעולה בעכברים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר פיתוח של מודל עכברי הניתן לשחזור של גליומה של חוט השדרה על ידי הזרקת תאי גידול לחלל הבין חולייתי, ומציע גישה יעילה יותר ופחות פולשנית למחקר ופיתוח טיפולי.

השתלה כירורגית של תאי גידול בחוט השדרה של עכברים

למד שיטת כריתת למינציה ושתלת חלון זכוכית בעמוד השדרה של עכברים לצורך הדמיה תוך-חייתית. שיטה זו מאפשרת מחקר דינמיקת חלבונים במערכת העצבים המרכזית ללא פגיעה ברקמה.

כריתת למינציה ואת חוט השדרה חלון השרשה בעכבר

גלה סרטונים נוספים