שיטה אוטומטית כדי לקבוע את הביצועים של דרוזופילה בתגובה לשינויים בטמפרטורה בחלל ובזמן

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לקבוע באופן אוטומטי את ביצועי גינקולוגיות דרוזופילה -שינוי הטמפרטורות באמצעות לתכנות מבוקרי טמפרטורה ארנה שמייצר שינויי טמפרטורה מהירים ומדויקים בזמן ובמרחב.

שיטה זו יכולה לעזור לנו לענות על שאלות מפתח על תגובת זבובים לשינויי טמפרטורה, כגון הבדלים בין גנוטיפים, האינטראקציה עם רמזים חושיים אחרים, או הפונקציה של קולטני טמפרטורה שונים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת שינויי טמפרטורה מהירים ומדויקים מרובים השולטים בזמן ובכלל ובדרך אוטומטית. התחל על ידי הצבת 20 זבובים זכר ו 20 נקבה בבקבוק גידול המכיל 45 מיליליטר של מזון זבוב בינוני, והנחת הבקבוק בתוך אינקובטור 25 מעלות צלזיוס תחת אור 12 שעות, 12 שעות מחזורים כהים.

לאחר 10 ימים, הרדמה זבובים eclosed לאחרונה על רפידות פחמן דו חמצני לכל היותר ארבע דקות. ולהשתמש מכחול כדי לאסוף זבובים בתולה ב 2.5 על ידי 9.5 ס"מ זבוב גידול בקבוקונים המכילים 6.5 מיליליטר של מזון זבובים טריים בינוני, מופרדים על ידי סקס לקבוצות של 20 זבובים לכל בקבוקון. ואז להחזיר את הבקבוקונים לאנקובטור במשך חמישה עד שבעה ימים.

כדי להגדיר זירה מבוקרת טמפרטורה, הפעל את הזירה ופתח את סקריפט שלבי הטמפרטורה במחשב הבקרה. ודא כי רצף הטמפרטורה מוגדר כראוי ובדוק שמשך הזמן של כל שלב ניסיוני מוגדר ל- 60 שניות. תחת סעיף בלוק ניסיוני ההתחלה, לאשר הגדרות אלה:המספר הרצוי של שלבים, התקנה איטרטיבית על / כבוי של דיודות פולטות אור אדום אינדיקציה, שתי מעלות צלזיוס עליית טמפרטורה לכל שלב, ו 16 מעלות צלזיוס כמו הטמפרטורה ההתחלתית.

לאחר מכן, הפעל את תסריט שלבי הטמפרטורה. התוכנה תהיה לאתחל במשך חמש שניות ולאחר מכן להפסיק. לניסויים התנהגותיים בטמפרטורה, מניחים גדיל של סרט מוליך לבן על החלק העליון של אריחי הנחושת של הזירה, ומבטיחים שכל הקצוות מכוסים.

מניחים טבעת אלומיניום מחוממת סביב אריחי הנחושת ולהשתמש ברקמה נקייה כדי לנגב את כיסוי הזכוכית. מניחים את הכיסוי על החלק העליון של טבעת האלומיניום, משאירים פער שדרכו ניתן לפוצץ זבוב פנימה ומקש על בקבוקון זבוב התאקלם פעמיים כדי לכפות את הזבובים לתחתית הבקבוקון. באמצעות שאפה בפה, ללכוד זבוב אחד ולסגור את הבקבוקון לפני לשים אותו בחזרה לתוך החממה.

לפוצץ את הזבוב לתוך הזירה דרך הפער בין כיסוי הזכוכית לטבעת האלומיניום ומיד לדחוף את תלתן הזכוכית כדי לסגור את הפער. מניחים מסגרת של אורות סביב הזירה כדי להבטיח תאורה סימטרית ולהתחיל להקליט עם תוכנית הקלטת וידאו. לאחר מכן הקש על מקש הרווח של מחשב הבקרה כדי להתחיל להפעיל את השלבים הניסיוניים.

כדי לעקוב אחר סרטוני הווידאו, פתח את תוכנת המעקב אחר שלבי הטיסה ופתח את קובץ התצורה בתוך תיקיית המעקב לעוף. הגדר את מיקום סרטוני הווידאו תיקיית וידאו ואת שמות סרטוני הווידאו בקבצי וידאו. ציין את גבולות הזירה לטוס בהגדרות הזירה בהתבסס על קואורדינטות x/y פיקסל של נקודות מרובות בקצה הזירה.

ספציפי את המיקום של נורות LED אדומות לא פעילות בהגדרות LED, בהתבסס על הקואורדינטות x/y פיקסל של המיקום של מרכז נורות LED. כדי לבדוק את המיקום של גבולות הזירה לטוס, להגדיר איתור באגים כ- true בהגדרות הזירה, לחץ על שמור והפעל את קובץ ה- Script במסוף. לכידת מסך של הווידאו תופיע עם ריבוע כחול שנוצר על ידי הקואורדינטות שהוכנסו בהגדרות הזירה.

לאחר מכן שנה את איתור הבאגים בהגדרות הזירה ל- false. לחץ על שמור והפעל שוב את המסך במסוף כדי להתחיל בתהליך המעקב. בניסוי התנהגותי טמפרטורה טיפוסי, זבובים בודדים שנחשפו ל-16, 20 או 24 מעלות צלזיוס מפגינים קטר גבוה יותר בתחילת הניסוי, מאשר לאחר חמש דקות.

הזירה מבוקרת הטמפרטורה יכולה לשמש גם להשוואת תגובות התנהגותיות זבוב מרקע גנטי שונה לשינויי טמפרטורה דינמיים. לדוגמה, בניסוי זה, המהירות של כל המינים שנבדקו גדלה בהתאם לעקומות התגובה שלהם ככל שהטמפרטורה עלתה, עד שהגיעה לנקודה של ביצועים מרביים, שלאחריה המהירויות שלהם נרקבו והזבובים נספו. כאשר זבובים בודדים נחשפו ל-40 מעלות צלזיוס באמצע ואריח צד אחד, כאשר אריח הצד השני ב-22 מעלות צלזיוס נוחים, הזבובים מסוג Wild הפסיקו במהירות לנוע לאורך הזירה ולהישאר במיקום הנוח.

לעומת זאת, מוטציית הזיכרון הקלאסית Dunce זבובים להמשיך לחקור את הזירה ולבלות פחות זמן מאשר פקדים במיקום נוח. כמו כן, בדיקת שילובים של טמפרטורה ומיקום שימושיים גם בהבנת הפונקציה של קולטני טמפרטורה שונים במהלך שינויי טמפרטורה דינמיים. כפי שמודגם בניסוי זה שבו מוטנטים בודדים d melanogaster נחשפו לטמפרטורות עולות בעוד מיקום נוח משתנה ב 22 מעלות צלזיוס סופק גם.

בעת ביצוע הליך זה, זכור לבצע את השלבים לפי הסדר ובמהירות כדי שתוכל ללכוד כמה שיותר התנהגות זבובים. לצד הליך זה ניתן להשתמש בשיטות אחרות כמו גיאוטקסיס שלילי או בדיקות חנק חום כדי לענות על שאלות נוספות כגון היכן זבובים נעים כרגיל או שיש להם עמידות רגילה בחום. ההשלכות של טכניקה זו להרחיב אותנו הבנת הפרעות נוירולוגיות או מוטציות שבהן תפיסת טמפרטורה או כאב לשחק תפקיד.

בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו ייאבקו כי כל צעד הוא פשוט בפני עצמו אבל הם נדרשים להיות מתואמים בצורה מושלמת ולכן הטכניקה צריכה להיות מתורגל.