Name: פפטיד40 MUB לשימוש באיתור האירועים דלקת נויטרופילים בתיווך (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: למדו את פרוטוקול MUB40 לזיהוי נויטרופילים בדגימות חיות וקבועות באמצעות קישור ללקטופרין. השיטה מאפשרת הדמיה בזמן אמת של הפרשת גרנולות ומסייעת בחקר מחלות דלקתיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי Fugain. לורט (אם-2015-15) (B.S.M.) Fondation ומענקים ANR JCJC (ANR-17-CE15-0012) (B.S.M.).

כל השיטות המתוארות כאן נבדקו ואושרו על ידי ארגוני הצרפתי CoRC (Comité de Recherche קליניק) CPP (des Comité דה הגנה Personnes), CNIL (הועדה הלאומית ואח ליברטה).
1. צביעת נויטרופילים ברקמת Histopathology עם Fluorescently מתויג MUB40
<ol><li>כדי להשיג את הרקמה עבור histopathology, לתקן מקטעים ביופסיה רקמות/נפח מתאים של 4% paraformaldehyde (PFA) במשך 30 דקות עד 4 h תלוי בעובי של המדגם. מקם את הדגימות במקרר 4 ° C במהלך קיבעון. הערה: שיטות קיבוע חלופי/תזמונים. הרבה בהתבסס על הצרכים הייחודיים של המשתמש.<ol>
<li>להסיר את כדורגלן, להוסיף 16% סוכרוז פתרון עם נפח מספיק כדי לכסות לחלוטין את הדגימה, ולמקם את הדגימה ב 4 ° C ל-4 שעות עד לילה.</li>
		<li>הסרת 16% סוכרוז פתרון להוסיף 30% סוכרוז פתרון בכל נפח גדול מספיק כדי לכסות לחלוטין את הדגימה, ומקם אותו ב 4 ° C ל-4 שעות עד לילה.</li>
		<li>הסר את הפתרון 30% סוכרוז, למחוק את הפתרון עודף מרקמות עם מגבת נייר. במקום סעיף הרקמה בתקשורת טמפרטורה (אוקטובר) חיתוך אופטימאליים, snap-הקפאת ב- 2-methylbutane מקורר באמבט קרח יבש-אתנול (-72 מעלות צלזיוס). ברגע קפואה (לאחר ~ 2 דקות), להסיר בלוקים מ- 2-methylbutane ומניחים אותם על קרח יבש עד אבני כרגע מוכן לאחסון לטווח ארוך. אחסן את רחובות קפוא ב-80 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך.</li>
	</ol>
</li>
	<li>בלילה לפני אבני רקמה הן לחתוך, להסיר אותם מן המקפיא-80 ° C, למקם אותם ב-20 ° C בלילה כדי equilibrate.<ol>
<li>שימוש של cryostat, OCT-מוטבע רקמות לחתוך לפרוסות בעובי μm 10 - 30, לספוח על שקופיות זכוכית באיכות גבוהה. הערה: ניתן להשתמש פרוסות עבה או דק יותר בהתאם לדרישות ניסיוני.</li>
		<li>עם עט שעווה או שיטה אחרת הידרופוביות, צייר תיבה מסביב הפרוסה רקמות בשקופית זכוכית ותנו יבש.</li>
		<li>להכין את הפתרון צביעת על-ידי ביצוע לדילול 1:1,000 MUB40-Cy5 (או גירסה40אחרים MUB פלורסנט, פתרון מניות 1 מ"ג/מ"ל) ב- 0.1% סאפונין-PBS פתרון. ריכוז40 MUB הסופי אופטימלית צריך להיות 1 μg/mL. הערה: ריכוז סופי נמוך יותר ניתן להשתמש (0.1-0.01 μg/mL) אבל עלול לגרום להורדת עוצמת האות. התראה: אבקת סאפונין יכול לגרום לגירוי של הנשימות. הקפד לשקול סאפונין באזור ארון או מוגן. ניתן להשתמש בשיטות חלופיות permeabilization כגון טריטון. להוסיף סמנים נוספים בריכוזים מומלץ יצרן (למשל., 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי), phalloidin, פלורסנט נוגדנים).</li>
		<li>בעדינות לטבול את השקופית זכוכית לתוך פתרון של 0.1% סאפונין-PBS שלוש פעמים.</li>
		<li>בזהירות כתם נמצא עודף נוזל סביב סעיף הרקמה ומוסיפים מספיק פתרון מכתימים לכסות לגמרי את סעיף הרקמה. מקם את השקופית לתא לחות כדי למנוע אידוי דגירה זה לשעה בטמפרטורת החדר. . לשמור את זה מוגן מפני אור.</li>
		<li>בעדינות לטבול את השקופית בתוך תמיסת סאפונין-PBS 0.1% 3 x. ואז, בעדינות לטבול את השקופית לתוך PBS פתרון 3 x. לבסוף, בעדינות לטבול את השקופית לתוך מזוקקים H2O 3 x. בזהירות יבש עודף נוזל מתוך השקופית.</li>
		<li>להוסיף כמות קטנה (~ 20 μL) של הרכבה בינונית (20 מ מ טריס pH 8.0, מספר N-propyl 0.5%, 90% גליצרול) ליד הפרוסה רקמות ולהניח בעדינות למטה coverslip זכוכית על גבי השקופית זכוכית. בעדינות ובצורה שווה הקש את coverslip אל סעיף הרקמה, בעזרת מגבת נייר, הסר בזהירות אמצעים כלשהם הרכבה extrudes מסביב לקצוות של coverslip.</li>
		<li>למקם את השקופית הנטען בארון חשוך במשך 24 שעות ביממה לאפשר את התקשורת הרכבה לגבש. לחלופין, במקום השקופית הנטען בגיל 37 מעלות לשעה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>תמונה הפרוסות רקמות על מיקרוסקופ פלואורסצנטי לפי שיטת הרכישה הרצוי.</li>
</ol>2. הדמיה של הפעלת נויטרופילים עם רטרו-Inverso-MUB40-Cy5 פפטיד
<ol><li>להשיג נויטרופילים האנושי באמצעות פרוטוקול הבאים. להכין את הפתרונות הבאים, מקם אותם בתוך ארון ללון אנאוקסיים. חשיפה לחמצן יתחיל להפעיל נויטרופילים, עוד יותר לגרום לתא המוות16,17. הערה: נויטרופילים יכול לחילופין להיטהר "על הספסל" MUB40-תיוג ניסויים; עם זאת, להיות מודע כי חשיפה חמצן יתחיל להשפיע על הפעלת נויטרופילים.<ol>
<li>הכן את הפתרון הבא: פתרון 1 [נתרן כלורי (NaCl) 0.9%]: הוספת 4.5 גר' NaCl עד 500 מ"ל של H2O. מסנן הפתרון. פתרון 2 (לתוספי 6%): להוסיף 6 גר' לתוספי בפתרון 0.9% NaCl 100 מ ל. פתרון 3 (מאגר כביסה): להמיס חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA) ב- PBS pH 7.2 כדי ריכוז EDTA הסופי של 2 מ מ. מייד לפני שימוש, להתמוסס שור אלבומין (BSA) בפתרון PBS/EDTA כך הריכוז הסופי של BSA הוא 10% w/v.</li>
		<li>צנטריפוגה צינורות איסוף דם ב g x 650 במשך 20 דקות בלי הפסקות.</li>
		<li>מבלי לשבש את פעולת הדם מופרדים, העברת צינורות איסוף דם שברים אנאוקסיים בארון, לאסוף פלזמה (למעלה) צינור חרוטי 50 מ.</li>
		<li>הסר את הצינור המכיל פלזמה מן הארון אנאוקסיים צנטריפוגה ב 2,900 x g כעשרים דקות עם הפסקות כדי הצניפה טסיות הדם.</li>
		<li>מבלי לשבש את פעולת טסיות הדם pelleted, בעדינות העברת הצינור פלזמה בחזרה לתוך ארון אנאוקסיים ו pipet טסיות פלזמה המסכן לתוך צינור מ"ל (להלן נקרא"פלזמה").</li>
	</ol>
</li>
	<li>הפרדת תאי דם אדומים של לויקוציטים<ol>
<li>באמצעות הצינורות המכילים כדוריות דם אדומות (RBCs) משלב 2.1.3., לשלב את RBCs לתוך צינור חרוטי 50 מ ל (5 דם אוסף שפופרת תוכן למחזור 50 מ ל).</li>
		<li>הוסף את NaCl 0.9% עד לנפח הכללי מגיע 44 מ. להוסיף 6 מ של לתוספי 6% (האחרונה).</li>
		<li>מערבבים בעדינות את תערובת דם/לתוספי על-ידי היפוך הצינור 10 - 20 פעמים. תן המשקע צינור במשך לפחות 30 דקות.</li>
		<li>בזמן שקיעת מתרחש, להכין מעבר צבע Percoll על-ידי הוספת 4.2 מ של Percoll פתרון 5.8 מ ל פלסמה צינור חרוטי 15 מ"ל ומערבבים היטב על ידי היפוך ברכבת התחתית.</li>
		<li>לאסוף את השבר העליונים של לתוספי אמנם מנסה למנוע pipetting כדוריות דם אדומות.</li>
		<li>להדק את הבורג כובע, להסיר את הצינור לתוספי תא אנאוקסיים, centrifuge את הצינור ב- 300 גרם x 10 דקות עם הפסקות.</li>
		<li>בזהירות למקם את הצינור בחזרה אל החדר אנאוקסיים מבלי להפריע את התאים pelleted, ולהסיר את הנוזל דרך pipetting.</li>
		<li>בעדינות מחדש להשעות בגדר תא ב 1 מ"ל של פלסמה ולהוסיף לאט מאוד לחלק העליון של הפתרון Percoll. יש להיזהר לא לגרום ערבוב השכבות כאשר pipetting את התאים למעלה.</li>
		<li>הסר בזהירות את הצינור פתרון Percoll מן אנאוקסיים קאמרית (הימנעות ערבוב), והוא צנטריפוגה ב 800 x g במשך 20 דקות בלי הפסקות. תאי תאי דם היקפיים (PBMCs) יישאר על פני הפתרון Percoll, נויטרופילים גלולה עם RBCs.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הסרת מזהמים RBCs<ol>
<li>להכין 14 מ"ל לרחוץ את בופר על-ידי הוספת 700 μL PBS + 10% BSA 14 מ"ל לרחוץ את המאגר.</li>
		<li>מקם את הצינור פתרון Percoll בחזרה אל החדר אנאוקסיים. להסיר את Percoll ואת PBMCs ויה pipetting והשהה מחדש את התאים pelleted 1 מ"ל לרחוץ את בופר. בגדר להיות מושעה מחדש יהיה צבע אדום בשל RBCs משחיתה.</li>
		<li>להוסיף 200 μL של אנטי-CD235a (glycophorin) beads מגנטי על התאים מחדש על תנאי, מערבבים בעדינות, תקופת דגירה של מינימום של 15 דקות. שלב זה טוען את RBCs מזהמים עם חרוזים מגנטי כך שניתן להסירם.</li>
		<li>שטיפת העמודה ההפרדה עם 2 מ של כביסה מאגר 3 x.</li>
		<li>בעוד אתה מחזיק צינור חרוטי 15 מ"ל תחת העמודה ההפרדה, pipette לאט לאט את התערובת נויטרופילים/RBC לחלק העליון של העמודה. לאסוף את התאים בצינור חרוט 15 מ"ל כפי שהם זרימה דרך. הזרימה דרך צריך להיות מעונן ולאבד את הצבע האדום בשל RBCs שנותרו מאוגד לעמודה.</li>
		<li>להוסיף 2 מ"ל לרחוץ את מאגר לחלק העליון של העמודה ולאסוף בצינור חרוט באותה 15 מ"ל. בסוף לשטוף את 2 מ"ל, הזרימה דרך צריך להיות ברור, המסמלת את כל נויטרופילים שנאסף.</li>
		<li>מערבבים בעדינות את הצינור כדי להבטיח הפצה אפילו של נויטרופילים ולאסוף μL 10 לספירת תאים. שימו לב הכרך האחרון עבור תא ספירת למטרות. למנות את המספר הכולל של תאים עם תא סטנדרטי כלשהו לספור בשיטה.</li>
		<li>הסר את הצינור נויטרופילים תא אנאוקסיים, centrifuge נויטרופילים ב g x 300 כעשרים דקות עם הפסקות.</li>
		<li>במקום נויטרופילים sedimented בחזרה אל החדר אנאוקסיים ולהסיר את המאגר כביסה דרך pipetting. מחדש להשעות בגדר נויטרופילים בפלסמה עם צפיפות התאים המרבי של 107 נויטרופיל/mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ספירת נויטרופילים מטוהרים והדמיה באמצעות MUB40<ol>
<li>להוסיף 1 μL של רי-MUB40-Cy5 (1 מ"ג/מ"ל) 1 מ ל Rosewell פארק אנדרטת המכון (RPMI) 1640 בינוני ללא פנול אדום. מערבבים על-ידי pipetting טוב.</li>
		<li>למטרות של פרוטוקול זה, התוצאה יש כבר המתוארים כאילו נויטרופילים חזק הפעלת ריאגנט, N-formylmethionyl-leucyl-פנילאלנין (FMLP), הוא הוסיף. להוסיף 1 μm של FMLP RPMI/רי-MUB40-Cy5 צינור מיקס ויה pipetting למעלה ולמטה. הערה: כל הליך ניסיוני יהיה שונה מנקודה זו ואילך, בהתאם לשאלות נותרים ללא מענה.</li>
		<li>העברה של 1 מ ל RPMI/רי-MUB40-Cy5/FMLP תערובת על צלחת זכוכית מיקרוסקופ התחתון. את המאכל הזה, להוסיף נפח של מטוהרים תאים המתאימים 106 סה כ נויטרופילים. מערבבים על ידי בעדינות pipetting.</li>
		<li>למקם את המנה במיקרוסקופ פלורסנט הפוכה ולהתחיל ייבוא תמונות. לדוגמה, מומלץ לרכוש תמונות בסיסית לפני התוספת של נויטרופילים-הפעלת ריאגנט כגון FMLP או חיידקים. בדוגמה זו, הפעל את רכישת RPMI/רי-MUB40-Cy5/נויטרופילים, ו- timepoint מאוחר יותר, pipette הכימית נויטרופילים-הפעלת לתוך קערה מזכוכית ולהמשיך ייבוא תמונות. הערה: השינויים שביצעת את השלבים הבאים ניתן לבצע בהתבסס על צרכי מדעי.</li>
		<li>תהליך רכש תמונות/זמן-lapse סרטים כמו מתייחס המיקרוסקופ ספציפי משמש.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Nathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+and+immunity%3A+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophils and immunity: challenges and opportunities.</a> Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).</li>
<li>Nicolás-Ávila, J. Á, Adrover, J. M., Hidalgo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+in+Homeostasis%2C+Immunity%2C+and+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Neutrophils in Homeostasis, Immunity, and Cancer.</a> Immunity. 46 (1), 15-28 (2017).</li>
<li>Coffelt, S. B., Wellenstein, M. D., de Visser, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+in+cancer%3A+neutral+no+more%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Neutrophils in cancer: neutral no more.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (7), 431-446 (2016).</li>
<li>Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+function+in+inflammation+and+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases.</a> Rheumatology. 49 (9), 1618-1631 (2010).</li>
<li>Glennon-Alty, L., Hackett, A. P., Chapman, E. A., Wright, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+and+redox+stress+in+the+pathogenesis+of+autoimmune+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Neutrophils and redox stress in the pathogenesis of autoimmune disease.</a> Free Radical Biology & Medicine. , (2018).</li>
<li>Borregaard, N., Cowland, J. B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9160655">Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte.</a> Blood. 89 (10), 3503-3521 (1997).</li>
<li>Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils%2C+from+marrow+to+microbes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Neutrophils, from marrow to microbes.</a> Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).</li>
<li>Rose, S., Misharin, A., Perlman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+Ly6C%2FLy6G-based+strategy+to+analyze+the+mouse+splenic+myeloid+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%3A+The+Journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">A novel Ly6C/Ly6G-based strategy to analyze the mouse splenic myeloid compartment.</a> Cytometry Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 81 (4), 343-350 (2012).</li>
<li>Shi, C., Hohl, T. M., Leiner, I., Equinda, M. J., Fan, X., Pamer, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ly6G%2B+neutrophils+are+dispensable+for+defense+against+systemic+Listeria+monocytogenes+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Ly6G+ neutrophils are dispensable for defense against systemic Listeria monocytogenes infection.</a> Journal of Immunology. 187 (10), 5293-5298 (2011).</li>
<li>Albanesi, M., Mancardi, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+mediate+antibody-induced+antitumor+effects+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Neutrophils mediate antibody-induced antitumor effects in mice.</a> Blood. 122 (18), 3160-3164 (2013).</li>
<li>Anderson, M. C., Chaze, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MUB40+Binds+to+Lactoferrin+and+Stands+as+a+Specific+Neutrophil+Marker%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+biology%22%5BJournal%5D)">MUB40 Binds to Lactoferrin and Stands as a Specific Neutrophil Marker.</a> Cell Chemical biology. 25 (4), 483-493 (2018).</li>
<li>Coïc, Y. -M., Baleux, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+a+specific+colonic+mucus+marker+using+a+human+commensal+bacterium+cell+surface+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Design of a specific colonic mucus marker using a human commensal bacterium cell surface domain.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (19), 15916-15922 (2012).</li>
<li>Roos, S., Jonsson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-molecular-mass+cell-surface+protein+from+Lactobacillus+reuteri+1063+adheres+to+mucus+components%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">A high-molecular-mass cell-surface protein from Lactobacillus reuteri 1063 adheres to mucus components.</a> Microbiology. 148, Pt 2 433-442 (2002).</li>
<li>Boekhorst, J., Helmer, Q., Kleerebezem, M., Siezen, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+proteins+with+a+mucus-binding+domain+found+exclusively+in+lactic+acid+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of proteins with a mucus-binding domain found exclusively in lactic acid bacteria.</a> Microbiology. 152, Pt 1 273-280 (2006).</li>
<li>Mancardi, D. A., Jönsson, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+Edge%3A+The+murine+high-affinity+IgG+receptor+Fc%CE%B3RIV+is+sufficient+for+autoantibody-induced+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cutting Edge: The murine high-affinity IgG receptor FcγRIV is sufficient for autoantibody-induced arthritis.</a> Journal of Immunology. 186 (4), 1899-1903 (2011).</li>
<li>Walmsley, S. R., Print, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-induced+neutrophil+survival+is+mediated+by+HIF-1alpha-dependent+NF-kappaB+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-induced neutrophil survival is mediated by HIF-1alpha-dependent NF-kappaB activity.</a> Journal of Experimental Medicine. 201 (1), 105-115 (2005).</li>
<li>Monceaux, V., Chiche-Lapierre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anoxia+and+glucose+supplementation+preserve+neutrophil+viability+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Anoxia and glucose supplementation preserve neutrophil viability and function.</a> Blood. 128 (7), 993-1002 (2016).</li>
</ol>

B.S.M. מופיע בתור ממציא על MUB40 פטנטים:
MUB40: EP11290403.2 הפטנטים האירופית, 09/09/2011.
רי-MUB40: אירופה EP פטנט מס ' 17306746.3, 11/12/17.

. הנה, שני מבחני מתוארים שבו משמש של פפטיד40 MUB ללמוד דלקת נויטרופילים והפעלה. אנו מראים איך MUB40 יכול לחשוף נויטרופילים להציג בסעיפים histopathology או להציג מצב ההפעלה שלהם באמצעות נויטרופילים מטוהרים בשידור חי. לשלבים הקריטיים עבור שימוש MUB40 ריאגנט מוכתמים הם בדיוק כמו עם כל שיטה לזיהוי פלורסנט אחרת. יש לנקוט כדי להבטיח תאימות של אותות פלואורסצנט כביסה נאותה צעדים ננקטו כדי להסיר רקע מכתים. השיקולים החשובים ביותר כדי להשיג תוצאות טובות מוכתמים הם האיכות של המיקרוסקופ, זכוכית שקופיו...

נויטרופילים באחת הזרועות העיקרית של מערכת החיסון המולדת, מגויסים באופן שגרתי לאתרים של דלקת סביב הגוף. המחקר של נויטרופילים נפגע במידה רבה על ידי שלהם אורך קצר במבחנה (פחות מ- 8 שעות) על ידי כלי איתור מוגבלת בתנאים הבזליים או לאחר ההפעלה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול נבדק היטב עבור גילוי רחב וספציפי של נויטרופילים בתרבית של דגימות קבוע/permeabilized. אנו מספקים גם פרוטוקול מפורט עבור צביעת נויטרופילים לחיות עם MUB40. באמצעות פרוטוקול מכתימים נויטרופילים בשידור חי, העיתוי והמיקום של הפעלת נויטרופילים יכול ניתן למצוא. פרוטוקול זה הינו אידיאלי עבור חוקרים המבקשים ללמוד שחרור הפעלה או גרגר נויטרופילים. מעבר שלהם פונקציות מיקרוביאלית, נויטרופילים יתקבלו בברכה עכשיו כתאים immunomodulatory מעורב במגוון רחב של מחלות תגובות מערכת החיסון (מולדת ולא אדפטיבית)1,2. הנויטרופילים הם נוכח רקמות דלקתיות ביותר, במספרים גבוהים ברקמות נגוע, גידולים דלקתיות3, במהלך IBS, קרוהן התלקחויות4, ו באזורים של דלקת שאינן זיהומיות כגון synovia של דלקת מפרקים שגרונית ( חולי RA)5. נויטרופילים להכיל ארבע כיתות של גרגרי הקבועים מראש בשם azurophil (α), ספציפי (β1), גרגרי השלישון (β2) והפרשה שלפוחית (γ)6. על ההעברה לאתר דלקתיות, נויטרופילים מגויס להיות מופעל, ברצף להפריש גרגר תוכן (מורכבת אדהזיה, תרכובות מיקרוביאלית ומולקולות immunomodulatory), אשר מקדם נוסף גיוס ותורמת זיהום רזולוציה (אלא גם כדי נזק לרקמות מארח)7. בעוד נויטרופילים נחשבים היבט חשוב של מולדת חסינות, לצאת לשם עם ריאגנטים זיהוי כמה זמין ללמוד אותן, אפילו פחות כי ניתן להשתמש כדי להעריך את מצב ההפעלה של נויטרופילים לחיות.
שיטות הנוכחי של גילוי נויטרופילים להסתמך על נוגדנים חד-שבטיים שנוצר כנגד אנטיגנים חשוף תא-השטח, כגון Ly - 6 G2 או חלבונים ספציפי המאוחסן בגרגרים נויטרופילים בתנאים הבזליים (למשל, myeloperoxidase לקטופרין). היתרונות של נוגדנים חד-שבטיים כוללים שלהם הנחשב חזק, רגישות, רב-תכליתיות בתנאים assay שונים. עם זאת, ישנם מספר חסרונות באמצעות נוגדנים חד-שבטיים ו- anti-Ly - 6G בפרט. חסרונות אלה כוללים יחודיות, כמו Ly - 6G הוא נוכח במרבית התאים מיאלואידית במח העצם ועל כל גרנולוציטים כולל אאוזינופילים; לפיכך, פיענוח נויטרופילים של אאוזינופילים עם סמן זה דורש יותר מתחמי מתקרב8. עוד חליפין תכופים עם נוגדנים חד-שבטיים הוא בהיקף ירידה לפרטים מארח לעיתים קרובות מוגבל, מקשה על מחקרים השוואה עם מיני בעלי חיים אחד או יותר. החיסרון השלישי של שיטות זיהוי נוגדנים, במיוחד כאשר באמצעות תאים חיים או ויוו, הוא הפוטנציאל שלהם כדי לשבש את תפקוד התא או להוביל ההפעלה התא. לדוגמה, הממשל של אנטי-Ly - 6G לעכברים בדרך כלל חלה על דלדול נויטרופילים, נויטרופניה ארעי9. זה בנוסף הוכח כי הזרקת נוגדנים עשוי לעורר פונקציה antitumor נויטרופילים10. לבסוף, זיהוי נוגדנים של נויטרופילים אינו חושף את מצב ההפעלה של התא.
זיהינו פפטיד חומצה אמינו 40 בשם MUB40, אשר יכול לשמש במספר מבחני תווית נויטרופילים בתנאים במבחנה או ויוו , כמו גם assay את מצב ההפעלה של נויטרופילים בשידור חי11. MUB40 נגזרת70MUB12, תחום של לקטובצילוס reuteri פני השטח מחייב ריר החלבון במקור תיאר את יכולתו לקשור ריר13,14. MUB40 אינטראקציה עם לקטופרין glycosylated הקיים בריכוזים גבוהים בגרגרים נויטרופילים ספציפיים ושלישוניות. יכול להיות חשופים MUB40 גרגירים אלה הצעדים permeabilization סטנדרטי, נוכח histopathology או תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) פרוטוקולים עבור צביעת חזקים של נויטרופילים קבוע. כאשר נויטרופילים לחיות נשמרים במצב מוחלש, פפטיד40 MUB הוא נשלל מן התכנים גרגר, התאים אינו מכתים חיובית עם הסמן. בעת ההפעלה, MUB40 ניתן לאגד לקטופרין חשוף, להוביל מכתים חזקים עם פפטיד. לפיכך, MUB40 יכול לשמש כדי לקבוע את מצב ההפעלה של נויטרופילים מטוהרים, שהופך אותו סמן אטרקטיבי כדי לעקוב אחר תהליך זיהומיות. היכולת לאגד לחיות נויטרופילים הופעל גם מאפשר MUB40 לשמש ככלי, לזהות אזורים דלקתיים נויטרופילים במודלים חיים של בעלי חיים (למשל, מודל דלקת פרקים15העכבר). הפרוטוקולים בפירוט כתב היד הזה איך fluorescently הנקרא MUB40 יכול לשמש כדי לחשוף נויטרופילים ב היסטולוגיה רקמות וכיצד assay את ההפעלה של נויטרופילים מטוהרים חיים במבחנה.

<table><tbody><tr><td>MUB40-Cy5</td><td>Benoit Marteyn</td><td>benoit.marteyn@pasteur.fr</td><td>פפטיד MUB40 פלואורסצנטי (זמין עם פלואורופורים מצומדים אחרים)</td></tr><tr><td>RI-MUB40-Cy5</td><td>Benoit Marteyn</td><td>benoit.marteyn@pasteur.fr</td><td>פפטיד MUB40 פלואורסצנטי רטרו-אינוורסו. מסונתז עם חומצות אמינו D ועמיד בפני פרוטאזות (זמין עם פלואורופורים מצומדים אחרים)</td></tr> <tr><td>פרפורמלדהיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>16005</td><td>מקבע להיסטולוגיה</td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S7903</td><td>תמיסה המשמשת להסרת עודפי PFA</td></tr><tr><td>תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT)</td> <td>Sakura Finetek USA</td><td>4583</td><td>משמש להקפאת רקמות לפני חתך</td></tr> <tr>קריוסטט<td>2-מתילבוטן</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M32631</td><td>משמש להקפאת רקמות לפני חתך קריוסטט</td></tr><tr><td>אתנול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>1.00974</td><td>משמש לאמבטיית קרח יבש להקפאת רקמות</td></tr><tr><td>Leica Cryostat</td><td>Leica Biosystems</td><td>CM1520</td><td>משמש לחיתוך רקמות</td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופיה מזכוכית</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-518-101</td><td></td></tr><tr><td>כיסוי מחליק</td><td>מעבדות תור</td><td>CG15CH</td><td>כיסוי דיוק גבוה</td></tr><tr><td>עט דקו&nbsp;</td><td>Z377821 סיגמא-אולדריץ'</td><td></td><td>משמש למניעת אובדן נוזלים במהלך צביעת רקמות</td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td>משמש לחדירת תאים לצביעה IF</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10236276001</td><td>כתמי DNA&nbsp;</td></tr><tr><td>אלקסה פלואור 488 פלואידין&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>A12379</td><td>קושר אקטין</td></tr><tr><td>להאריך זהב אנטי-דהייה Mountant</td><td>Fisher Scientific</td><td>P36930</td><td>מאריך את אות IF ועמידות בפני פוטוהלבנה</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי</td><td></td><td>שונים</td><td>שונים המשמשים להדמיית שקופיות IF</td></tr><tr><td>ארון אנוקסי</td><td>שונים</td><td></td><td>שונים המשמשים לטיהור נויטרופילים חיים מומתים</td></tr><tr><td>נתרן כלוריד NaCL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td>רכיב מאגר כביסה</td></tr><tr><td>MACS BSA buffer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td>רכיב מאגר כביסה</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4937</td><td>שיפוע לטיהור נויטרופילים</td></tr><tr><td>CD235a גליקופורין מיקרו-חרוזים מגנטיים</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-050-501</td><td>משמש להסרת RBCs מזהמים</td></tr><tr><td>עמודות LS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>משמש להסרת RBCs מנויטרופילים</td></tr><tr><td>RPMI-1640 ללא פנול אדום</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>R8755</td><td>משמש לבדיקות נויטרופילים</td></tr></tbody></table>

פפטיד40 mub לשימוש באיתור האירועים דלקת נויטרופילים בתיווך

The MUB40 Peptide for Use in Detecting Neutrophil-Mediated Inflammation Events

כאן, אנו מספקים פרוטוקול הכרוכות של MUB40, פפטיד מסונתזת את היכולת לאגד לקטופרין glycosylated המאוחסן בריכוזים גבוהים בגרגרים שלישוני וספציפית של נויטרופילים. זה פרטי פרוטוקול איך MUB40 מצומדת ישירות אל fluorophore יכול לשמש כתם נויטרופילים ברקמות קבוע/permeabilized וכן איך ניתן להשתמש ב- live-תא הדמיה כדי assay הפעלה נויטרופילים, פרור ולהשתחרר. שיטות איתור נויטרופילים מוגבלות תלויי מין נוגדנים חד-שבטיים, אשר אינם תמיד מתאים עבור יישומים מסוימים. MUB40 אינו לחדור את קרום התא, ולכן נכללו לקטופרין המאוחסן בשאינם-מופעל/הלא-permeabilized נויטרופילים. MUB40 יש ערך מוסף של הכרה לקטופרין ממגוון המארחת רחב, שימושי במיוחד עבור השוואת תוצאות מחקרים שכללו מספר מודלים מחקר, צמצום מספר ריאגנטים כפולים, ופישוט פרוטוקולים דרך מכתים צעד אחר צעד.

תוצאות של MUB40-רקמות מוכתם משקופיות histopathology בדרך כלל לחשוף תאים בודדים פזורים ברחבי הרקמה. MUB40 כתמי לקטופרין, שהוא נוכח בגרגרים נויטרופילים ממודר. לכן, בדרך כלל ראיתי להכתים punctate או במספר תחומים נפרדים גדולים של האות מגיעים בודדים נויטרופילים (איור 1). זה עוזר להוספת סמן התא השני כגון דאפי לעזור לשפה משותפת האות40 MUB עם התא מוכתם. המספר הכולל של תאים שזוהו תלוי המספר של נויטרופילים נוכח שדה הראיה ואת יכול להשתנו...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לזהות הנוכחות של נויטרופילים בסעיפים היסטולוגיה קבוע/permeabilized ולהעריך את מצב ההפעלה נויטרופילים מטוהרים בשידור חי. בפרט, פפטיד40 MUB מאגד לקטופרין נוכח בגרגרים נויטרופילים ספציפיים ושלישוניות. חשיפה של התכנים גרגר דרך permeabilization או הפעלה נויטרופילים מאפשר הסימון של נויטרופילים.

פפטיד40 MUB לשימוש באיתור האירועים דלקת נויטרופילים בתיווך

Here, we provide a protocol involving the use of MUB40, a synthesized peptide with the ability to bind glycosylated lactoferrin stored at high ...

MUB40 הוא סמן נויטרופילים חדשני, אשר נקשר לקטופרין ומאפשר זיהוי ספציפי בדגימה של רקמת יונקים אנושית וכל נבדק עד כה. תיוג נויטרופילים באמצעות MUB40 הוא קל, מהיר וספי. זה עכשיו בשימוש נרחב במעבדה שלנו ואת המשמעות של טכניקה זו להרחיב לקראת אבחון של מחלות דלקתיות.כדי להתחיל, הכינו פתרונות 1, 2 ו-3 על פי פרוטוקול הטקסט, והצבו אותם בקבינט אנוקסי בן לילה. לאחר מכן, צנטריפוגה הצינורות של דם שנאסף ב 650 גרם במשך 20 דקות כדי להפריד את התאים משבר הפלזמה. מבלי להפריע לדם המופרד, להעביר את הצינורות לארון אנוקסי ולהעביר את שברי הפלזמה לצינור חרוט 50 מיליליטר.לאחר מכן להסיר את הצינור של פלזמה מן הארון אנוקסי צנטריפוגה זה ב 2900 גרם במשך 20 דקות. דואג לא לשבש את טסיות הדם גלולה, להעביר את הצינור לארון אנוקסי פיפטה טסיות פלזמה עניים לתוך צינור טרי 50 מיליליטר. באמצעות צינורות איסוף הדם, לשלב את תאי הדם האדומים בצינור חרוט 50 מיליליטר.לאחר מכן, להוסיף 0.9% פתרון נתרן כלורי עד נפח הכולל מגיע 44 מיליליטר, ולהוסיף שישה מיליליטר של 6%dextran. הופכים את הצינור 10 עד 20 פעמים כדי לערבב בעדינות את תערובת הדם והדקסטרן, ולאפשר לצינור להזעים לפחות 30 דקות. בעוד מעים צינור, להכין שיפוע פרקול על ידי הוספת 4.2 מיליליטר של פתרון פרקול ל 5.8 מיליליטר של פלזמה, ולהפוך את הצינור לערבב.לאחר מכן, לאסוף את נויטרופילים המכילים את החלק העליון של dextran, דואג לא פיפטה תאי דם אדומים. הדקו את מכסה הבורג, הסירו את צינור הדקסטרן מהארון האנוקסי, וצנטריפוגו את הצינור ב-300 גרם למשך 10 דקות. דואג לא להפריע לתאים גלולה, למקם את הצינור בחזרה בארון אנוקסי.לאחר מכן, להסיר את הנוזל על ידי צינורות. בעדינות resuspend גלולה במיליליטר אחד של פלזמה. הוסף באיטיות את התאים המתווסתים לראש הפתרון של Percoll.הסר בזהירות את צינור הפתרון של Percoll מהארון האנוקסי וצנטריפוג אותו ב 800 גרם במשך 20 דקות כדי להפריד PBMCs מנויטרופילים. לאחר מכן, הכינו 14 מיליליטר של פתרון חיץ כביסה בהתאם לפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, מניחים את צינור פרקול בארון האנוקסי.השתמש פיפטה כדי להסיר את פרקול ו PBMCs ולתלות מחדש את גלולת המכיל נויטרופילים במיליליטר אחד של פתרון חיץ כביסה. לאחר מכן, הוסיפו 200 מיקרוליטרים של חרוזים מגנטיים לתאים המתווסכים מחדש. מערבבים בעדינות ומדגרים את התאים ואת חרוזים לפחות 15 דקות.לאחר מכן, לשטוף עמוד הפרדה פעמיים, עם שני מיליליטר של חיץ כביסה. בעוד מחזיק חדש, צינור חרוט 15 מיליליטר מתחת לעמודה, לאט pipette תערובת תאי הדם האדומים נויטרופילים דרך העמוד. הזרימה דרך מהעמוד צריך להיות מעונן ולאבד את צבעו האדום, המאשר את ההפרדה המוחלטת של נויטרופילים מתאי הדם האדומים הנותרים.הוסף שני מיליליטר של חיץ כביסה לראש העמוד ולאסוף את הזרימה דרך באותו צינור. עד סוף שטיפה זו, הזרימה דרך צריך להיות ברור. מערבבים בעדינות את צינור האיסוף כדי להבטיח שהנויטרופילים מופצים באופן שווה.ואז אסף 10 מיקרוליטרים של הזרימה דרך מספירת תאים. לאחר מכן, להסיר את הצינור נויטרופילים מן הארון אנוקסי צנטריפוגה הצינור ב 300 גרם במשך 20 דקות. מניחים את נויטרופילים מעים בחזרה לתוך הארון אנוקסי ולהסיר את חיץ הכביסה באמצעות צינורות.לאחר מכן, תן שוב את גלולת הפלזמה. מוסיפים מיקרוליטר אחד של RI-MUB40-Cy5 למיליליטר אחד של מדיום RPMI-1640, ללא אדום פנול, ומערבבים באמצעות צינורות. לאחר מכן, להוסיף microliter אחד של פתרון FMLP ו pipette לערבב.מעבירים את התערובת לתבשיל מיקרוסקופיה בתחתית הזכוכית. לאחר מכן מוסיפים נפח מתאים של תאים מטוהרים לצלחת. לבסוף, מניחים את המנה במיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך ומתחילים ברכישת תמונות.בפרוטוקול זה, MUB40 שימש על תאים חיים כדי לזהות הפרשת נויטרופילים על סימולציה עם FMLP. הדינמיקה של שחרור תוכן הגרנול, כולל לקטופרין, עשויה להיות חזותית לאורך זמן, כאן במגנטה. MUB40 ניתן להשתמש בנוסף על נויטרופילים קבועים.כאן, חרוזים פלואורסצנטיים phagocytizing בסדרה מתוזמן. התוכן של גרנול נויטרופילים מסומן כאן בכחול. הנויטרופילים הראו מעט מאוד כתמי תאים בנקודות זמן מוקדמות ובהדרגה, תיוג RI-MUB40 גדל עם הזמן, הן על קרום הפלזמה והן על פני השטח של חרוזים.MUB40 עשוי לשמש גם על רקמות דלקתיות קבועות כדי לזהות נויטרופילים במיוחד, כפי שמוצג בדמויות הטקסט. אנו מתארים כאן את הליך טיהור נויטרופילים, מיושם באופן שגרתי במעבדה שלנו. כל שיטה אחרת מתאימה, תיוג MUB40-Cy5 עדיין יעבוד.נויטרופילים עשויים להיות מסומנים במיוחד עם MUB40 לאחר טיהור, או ישירות ברקמה מודלקת מחולים או מודלים של בעלי חיים. מספר נגזרות MUB40 תוכננו להרחיב את השימוש בו. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקר בתחום הדלקת, לחקור גיוס נויטרופילים והפעלה במחלות דלקתיות.

the-mub40-peptide-for-use-detecting-neutrophil-mediated-inflammation

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

סרטון זה מדגים בדיקת דה-גרנולציה של גרגירים אזורופיליים בנויטרופילים של עכברים, המערבת גירוי של נויטרופילים לשחרר גרגירים אזורופיליים המכילים מיאלופוקסידז. התגובה האנזימטית שלאחר מכן משמשת לכימות רמות myeloperoxidase, ומספקת תובנה לגבי הפעלת נויטרופילים.

בדיקה לניטור דה-גרנולציה של גרגירים אזורופיליים בנויטרופילים לאחר ההפעלה

אנו מתארים שיטת הדמיה לא פולשנית להבחנה שלבים דלקתיים. משלוח מערכתי של לומינול מגלה תחומים של דלקת חריפה תלויות על פעילות MPO בנויטרופילים. לעומת זאת, הזרקה של lucigenin מאפשרת הדמיה של דלקת כרונית תלויה בפעילות phox במקרופאגים.

בשיטת ההדמיה vivo להבחין דלקת אקוטית וכרונית

ליפידים ידועים לשחק תפקיד חשוב פונקציות הסלולר. כאן, אנו מתארים שיטה כדי לקבוע את הרכב השומנים של נויטרופילים, עם דגש על רמת הכולסטרול, על ידי שימוש בשני HPTLC ו HPLC כדי להשיג הבנה טובה יותר של המנגנונים של היווצרות מלכודת תאי נויטרופילים.

שיטות לחקר ליפידים שינויים נויטרופילים ואת הגיבוש העוקב של נויטרופילים תאיים מלכוד

כאן, אנו מציגים שלוש שיטות להערכת הגירה נויטרופילים והסתננות הן בvivo והן בתוך מבחנה. שיטות אלה ניתן להשתמש כדי לגלות מבטיח therapeutics פילוח הגירה נויטרופילים.

מזהה הגירה הסתננות של נויטרופילים בעכברים

הפרוטוקולים המתוארים בזאת מספקים מדריך כדי לדמיין ולכמת את הפעילות של פרוטאזות נויטרופילים בליחה אנושית. היישומים של ניתוח כזה משתרעים מההערכה של טיפולים אנטי דלקתיים, לאימות סמנים ביולוגיים, הקרנת תרופות ומחקרים קליניים גדולים.

ניטור נויטרופילים אלסטאז וקטפסין G פעילות בדגימות כיח אנושי

מוצג כאן פרוטוקול לאינדוקציה וניתוח של מלכודות חוץ-תאיות נויטרופיליות במבחנה (NETs). כימות של דנ"א, קתליצידין (LL37) ופעילות אנזים הניב נתונים המראים את השונות בהרכב ובמורפולוגיה של NETs המושרים על ידי גירויים מיקרוביאליים וכימיים בתנאים מבוקרים דומים.

ניתוח מורפולוגי וקומפוזיציוני של מלכודות נויטרופיליות חוץ-תאיות המושרות על ידי גירויים מיקרוביאליים וכימיים

אנו מציגים פרוטוקול לטכניקת בדיקה אימונוסורבית המקושרת לאנזים סנדוויץ' שונה כדי למדוד כמותית שני מרכיבים של שרידי מלכודת חוץ-תאיים של נויטרופילים, מיילאופרוקסידז מצומד-DNA וקומפלקסים של דנ"א מצומד אלסטאז נויטרופילים, הנגזרים מנויטרופילים פעילים.

כימות קומפלקסים של Myeloperoxidase-DNA ו-Neutrophil Elastase-DNA ממלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים באמצעות כריך ELISA שעבר שינוי

פרוטוקול זה כולל סדרה של בדיקות פונקציונליות נויטרופילים שישמשו כשיטת סינון לכיסוי פונקציות ממסלולי איתות שונים. הפרוטוקול כולל הערכה ראשונית ופשוטה של כדאיות התא, טוהר, ייצור מיני חמצן תגובתי, נדידה בזמן אמת, פגוציטוזה, והצעה ראשונית של מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים.

סדרה של טכניקות סינון לסקירה מהירה של פונקציית נויטרופיל

פרוטוקול זה מתאר בדיקת סמנים ביולוגיים סינתטיים בשתן סינתטי בתיווך CRISPR-Cas, המאפשרת אבחון סרטן נקודתי באמצעות ניתוח ex vivo של פעילויות פרוטאז הקשורות לגידול.

בדיקת סמנים ביולוגיים סינתטיים בשתן סינתטי בתיווך CRISPR-Cas לאבחון נייד

פרוטוקול מוגדר זה מתאר גישת מיקרוסקופיה בתפוקה גבוהה בזמן אמת כדי להמחיש ולכמת שחרור מלכודת נויטרופילים חוץ-תאית אנושית (NET) במבחנה. השיטה הניתנת לשחזור מאפשרת לחקור את המאפיינים והקינטיקה של שחרור NET בעת גירוי עם משפרי NETosis מובהקים ומאפשרת הערכה של הפרמקולוגיה של אנטגוניסטים של NETosis.

כימות מיקרוסקופי בזמן אמת בתפוקה גבוהה של שחרור מלכודת נויטרופילים חוץ-תאית אנושית והערכת הפרמקולוגיה של אנטגוניסטים

נויטרופילים בצפיפות נמוכה (LDN) גדלים באופן משמעותי במספר מחלות. LDN מבודדים בדרך כלל באמצעות מיון תאים. אנו מציגים שיטה מעשית להשגת LDN טהור ובר קיימא. לאחר צנטריפוגה של שיפוע צפיפות של דם היקפי, התאים מודגרים עם מיקרו-חרוזים מגנטיים, ולאחר מכן LDN מופרדים באמצעות עמודות מגנטיות.

שיטת מיקרו-חרוזים מגנטיים מהירה לטיהור יעיל של נויטרופילים בצפיפות נמוכה

למדו את פרוטוקול MUB40 לזיהוי נויטרופילים בדגימות חיות וקבועות באמצעות קישור ללקטופרין. השיטה מאפשרת הדמיה בזמן אמת של הפרשת גרנולות ומסייעת בחקר מחלות דלקתיות.

פפטיד₄₀ MUB לשימוש באיתור האירועים דלקת נויטרופילים בתיווך

גלה סרטונים נוספים