Name: אינדוקציה של אנדותל התמיינות בתאים לב בתנאים בסרום נמוך (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: למדו פרוטוקול יעיל להבדלה אנדותליאלית של תאי קדם לב CPCs בתנאי סרום נמוך. השיטה מאפשרת חקר מנגנוני התחדשות לבבית ופיתוח טיפולים תאיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים תודה ורה לורנץ את תמיכתה מועיל במהלך הניסויים, והעובדים מהמתקן Flow Cytometry מן המחלקה וההתערבות (DBM), האוניברסיטה אוניברסיטת בית החולים באזל. עבודה זו נתמכה על ידי השהייה בעל המסלול לתוכנית של אוניברסיטת בזל (Michika מוצ'יזוקי). גבריאלה מ Kuster נתמך על ידי מענק של קרן המדע הלאומית השוויצרית (310030_156953 מספר גרנט).

השימוש של עכברים תא בידוד מטרה לפי המדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה ועם חוק ההגנה שוויצרי, אושרה על-ידי השלטונות הקנטונים שוויצרי.
הערה: את ניתוקה של Sca-1+/CD31– SP-CPCs מהלב עכבר נעשה בעיקרו של דבר כפי שתואר לעיל34 עם מספר שינויים. החומרים והשירותים ריאגנטים בשימוש, ראה טבלה של חומרים. עבור כל הניסויים, הלב SP-CPCs מבודד מן העכברים היו מוגבר, passaged, שימוש באופן קו דמוי תא. פסוקים 7-20 השתמשו במחקר זה.
1. רקמות הכנה
הערה: כל ניסויים שימוש בעכברים צריך להתבצע על פי הנחיות תקנות. פרוטוקול זה משתמש ארבעה עכברים. צלחות תרבות כי הם 100 מ מ קוטר מתוארים P100, צלחות תרבות המהווים 60 מ מ קוטר מתוארים P60 בחלקים הבאים של הפרוטוקול.
<ol><li>להזריק כל עכבר עם 200 מ"ג/ק"ג של פנטוברביטל intraperitoneally (i.p.) ולחכות עד זה הוא מורדם לחלוטין על-ידי בדיקת תגובתה שאורך צובט.</li>
	<li>נגב את החזה עם 70% אתנול. חותכים את העור ואת בית החזה קיר עם מספריים כדי לחשוף את חלל בית החזה.</li>
	<li>הרם את הלב עם מלקחיים, לחתוך אותו בבסיס באמצעות מספריים. לשים את הלב P100 25 מ ל (5 מ"ל עבור P60) של קרות באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) (שלוש עד חמש לבבות לכל P100) או לבבות אחד או שניים לכל P60.</li>
	<li>משאבת הלב עם מלקחיים כדי להוציא את הדם החללים (איור 1 א').</li>
	<li>לשים את הלב P100 25 מ ל (5 מ"ל עבור P60) ל- PBS קר לרחצה. הסר את אטריה בעזרת מספריים קטנות. לחתוך את הלב לתוך שתי חתיכות האורך ולשטוף אותם שוב ב- PBS קר כקרח (25 מ ל/P100, 5 מ ל/P60).</li>
	<li>להעביר את החתיכות P100 חדש עם 25 מ ל (5 מ"ל עבור P60) של PBS קר. לחתוך את החלקים לחלקים קטנים יותר בעזרת מספריים קטנות (איור 1B). להוסיף טיפה של 1 מ"ג/מ"ל collagenase B מדולל של האנק מאוזנת תמיסת מלח (HBSS), מינצ את חתיכות קטנות ביסודיות עם סכין גילוח סטרילי (איור 1C).</li>
</ol>2. מערכת העיכול
<ol><li>להוסיף 10 מ ל (2.5 mL עבור P60) של הפתרון B collagenase 1 מ"ג/מ"ל למנה מהשלב 1.6.</li>
	<li>לשים את הפתרון collagenase B המכיל את השברים הלב טחון מוטה (כ-30 מעלות) P100 (או P60) בחממה של 37 ° C (איור 1D).</li>
	<li>דגירה החלקים הלב טחון לתקופה מקסימלית של 30 דקות; homogenize על ידי שוב ושוב הכנסתם פיפטה פסטר כל 10 דקות במהלך הדגירה (איור 1E). הערה: חשוב לא תעלה על 30 דקות של דגירה סה עבור שלב 1.3.</li>
</ol>3. סינון
<ol><li>להוסיף 10 מ ל (5 מ"ל עבור P60) של HBSS קר בתוספת 2% FBS ליצירות לב טחון הומוגני. הערה: HBSS בתוספת 2% FBS המרווה פעילות collagenase B.</li>
	<li>לסנן את החתיכות הלב דרך מסנן 100 מיקרומטר להסיר את רקמת מעוכל צנטריפוגה ב x 470 גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT) (איור 1F, מסננים צהוב).</li>
	<li>למחוק את תגובת שיקוע resuspend בגדר ב 5 מ ל (3 מ"ל של P60) של תאי הדם האדומים פירוק מאגר ו דגירה בגדר במשך חמש דקות עם רועדת פה ושם על קרח.</li>
	<li>להוסיף 10 מ ל (5 מ"ל עבור P60) ל- PBS (להפסיק את תגובת פירוק) ולסנן את הדגימה דרך מסנן 40 µm כדי לא לכלול תאים גדולים יותר, כולל שיורית cardiomyocytes (איור 1F, מסננים כחול).</li>
	<li>Centrifuge את הצינור ב x 470 גרם במשך 5 דקות ב RT (ללא בלימה). למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב 1 מ"ל של DMEM כולל 10% FBS.</li>
	<li>לספור את התאים aliquot עם hemocytometer. Resuspend התאים עם DMEM כולל 10% FBS, מכוון ריכוז התא האחרון של עונה 1 פרק 106 תאים/מ ל.... הערה: בערך 5 x 106 תאים cardiomyocyte, כדוריות דם אדומות-מדולדל יכול להיות המשוער העכבר.</li>
	<li>להפיץ את התאים לתוך שני צינורות (איור 2): שפופרת A, להוסיף 1.5 mL עבור Hoechst 33342 מכתים עם verapamil; הרכבת התחתית B, להוסיף 18.5 מ עבור צביעת Hoechst 33342 והמשך כתם ולמיין תאי SP לב (שלבים 4.1 ו- 4.2) על ידי cytometry זרימה.</li>
</ol>4. מיון תאי הלב SP מאת Cytometry זרימה
הערה: Verapamil מעכב Hoechst בזרימת על ידי חסימת multidrug ההתנגדות פעילות טרנספורטר (MDR) ABC. Hoechst 33342 הוא צבע DNA מחייב כי ניתן להשתמש בתאים חיים כדי לזהות את מחזור התא כמו זה קשור עם תוכן ה-DNA. תאים Hoechst-33342-הבלטת ממד מופיעים בחלק Hoechst נמוכה בשני ערוצים פליטה (450 nm, כחול Hoechst; 650 nm, Hoechst אדום), בצד של Hoechst תמך "האוכלוסייה העיקרית", נותן להם השם "לצד האוכלוסייה שלהם". SP התאים מועשרים בתאים בעלי תכונות קדמון, הצג ביטוי גבוהה של מובילי ABC multidrug עמידים (כגון MDR1 ו ABCG2). Hoechst 33342 נכתב כ/כפי Hoechst בחלקים הבאים של הפרוטוקול. חשוב להגן על חומרים רגישים לאור תוצאות אידיאלי.
<ol><li>
צביעת עם Hoechst נוכחות, היעדר verapamil
	<ol>
<li>להוסיף הפתרון תא verapamil (עם ריכוז סופי של 83.3 מיקרומטר) ו Hoechst (עם ריכוז הסופי של 5 µg/106 תאים). שפופרת A, השתמש Verapamil Hoechst; הרכבת התחתית B, השתמש Hoechst בלבד. דגירה באמבט מים (ב 37 ° C) במשך 90 דקות ולחזור הצינורות כל 20 דקות (איור 1 ג'י).</li>
		<li>Centrifuge הצינורות ב x 470 גרם במשך 5 דקות ב RT. להשליך תגובת שיקוע, resuspend כל גלולה ב- HBSS (1 x 106 תאים/mL).</li>
		<li>. קח mL 1.5 aliquot stainings יחיד ובקרה שלילי הרכבת התחתית B (איור 2): (i) fluorescein isothiocyanate (FITC)-מצומדת אנטי-Sca-1; (ii) allophycocyanin (APC)-מצומדת anti-CD31; (iii) תאים nonstained (בקרה שלילית). הערה: Isotype פקדים משמשים כאן עבור הגדרת פרוטוקול בידוד.</li>
		<li>צנטריפוגה צינורות A ו- B , את aliquots מכתים בודד ושלילית שליטה ב x 470 גרם במשך 5 דקות ב RT לכביסת Hoechst, verapamil.</li>
		<li>למחוק את תגובת שיקוע resuspend כדורי של שפופרת A וכן (iii) הפקד שלילי ב 250 µL של HBSS, לשמור אותם על קרח בחושך עד מיון.</li>
		<li>Resuspend בגדר של הרכבת התחתית B 200 µL של HBSS, בגדר של (i, ii) את aliquots מכתים יחיד ב- 100 µL של HBSS. הוסף FITC מצומדת אנטי-Sca-1 (0.6 µg/107 תאים) מצומדת APC אנטי-CD31 (0.25 µg/107 תאים). דגירה כדורי במשך 30 דקות על קרח ומנערים אותם מפעם לפעם בחושך.</li>
		<li>להוסיף 2 מ של HBSS הצינורות. Centrifuge הצינורות ב x 470 גרם במשך 5 דקות ב- RT.</li>
		<li>למחוק את תגובת שיקוע, resuspend כל החבילות עם 1 מ"ל של HBSS, צנטריפוגה כמו לעיל. למחוק את supernatants. Resuspend בגדר של aliquots מכתים יחיד ב- 200 µL של HBSS. Resuspend בגדר של הרכבת התחתית B ב- HBSS (20 x 106 תאים/mL).</li>
		<li>שומרים את הדגימות על קרח, מוגן מפני אור עד מיון.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
מיון עם cytometry זרימה
	<ol>
<li>להכין סטרילי mL 1.5 מיון צינורות עם 500 µL של HBSS כולל 2% FBS.</li>
		<li>כתם התאים עם 7-aminoactinomycin D (7-מ) (0.15 µg/106 תאים) על קרח למשך 10 דקות כדי לא לכלול תאים מתים.</li>
		<li>למיין את SP הלב באמצעות ההגדרות הבאות: לרגש Hoechst באמצעות עירור 350 nm (UV), לאסוף את פליטת קרינה פלואורסצנטית עם 450/50 ננומטר הלהקה לעבור סינון (Hoechst כחול) ועם 670/30 ננומטר הלהקה לעבור סינון (Hoechst אדום) ולהשתמש בגודל החרירים של 100 מיקרומטר ואת הלחץ 15 psi.</li>
		<li>לניתוח, להקליט 5 x 10 אירועים5 על הדגימות המיון ואירועים5 עונה 1 פרק 10 עבור שליטה שלילי, verapamil שליטה, מכתים בודדת דגימות. הערה: הלב SP הוא כ- 0.5% - 2% (איור 1 H) אבל עשוי להשתנות בין המעבדות מבודד. /CD31 Sca-1+– שבר הוא סביב 1% - 11% של SP לב מוחלט (איור 1I) אבל עשויים להשתנות בין המעבדות מבודד. Sca-1+/CD31– SP-CPCs נכתבות כמו SP-CPCs בחלקים הבאים של הפרוטוקול.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. ראשי תרבות של SP מבודד-CPCs
הערה: שלושה סוגים שונים של מדיה שימשו פרוטוקול זה. הם מכונים בינוני 1 (לפי נוזדה. et al.) 8, 2 בינוני, ו 3 בינוני והם המתוארות בטבלה של חומרים לגבי הרכב שלהם.
<ol><li>לחמם בינוני 1 ל 37 ° C לפני השימוש ולהרגע לצנטריפוגה על 4 מעלות צלזיוס. Centrifuge צינורות המיון ב 4 ° C ו- x 470 גרם במשך 6 דקות, resuspend תאי 1 בינוני.</li>
	<li>לשים את התאים על מאכל P60 חדיר גז עם 4 מ ל 1 בינוני. לשנות את המדיום בכל בתלת-ממד עד התאים הגיעו למפגש 70% - 80%. הערה: שלב 5.2 עשויה להימשך בסביבות 2-3 שבועות.</li>
</ol>6. הרחבת ובידול של SP-CPCs
<ol><li>
תרבית תאים
	<ol>
<li>תרבות 3 x 105 SP-CPCs 8 מ ל 1 בינוני בבקבוקון T75.</li>
		<li>דגירה SP-CPCs ב 37 ° C עם 5% CO2 עד 70% - 80% הנהרות, שינוי המדיום d כל 2-3. הערה: המספר התא צריך להיות שונה לפי סוג CPCs בשימוש זמן ההכפלה, גודל התא.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
SP-CPC הצמיחה ואת הכדאיות תחת ריכוזים שונים בסרום
	<ol>
<li>תרבות SP-CPCs במשך 2-3 d ב- T75 מבחנות עם 8 מ ל 1 בינוני. בזהירות תשאף המדיום ולשטוף בעדינות עם 5 מיליליטר (37 ° C) HBSS חמות.</li>
		<li>לטיפול תאי עם 5 מ של טריפסין-EDTA עבור 5 דקות בחממה תא, הוסף 5 מ של בינוני 1 להפסיק את הפעילות טריפסין, ולהעביר התליה תא לרכבת התחתית 15 מ"ל.</li>
		<li>Centrifuge התאים ב x 470 גרם במשך 5 דקות ב- RT.</li>
		<li>Resuspend התאים בינוני 1 או 2 בינוניים (שושלת היוחסין אינדוקציה בינוני), צלחת 2.5 10x5 SP-CPCs על P60 מנות עם 3 מ"ל של מדיום המכילים ריכוזים שונים בסרום.</li>
		<li>לאסוף את המדיום המנה של צעד 6.2.4 עבור האוסף של תאים מתים לתוך צינור 15 מ"ל לאחר 2 ד' של culturing בינוני 1 או 2 בינוניים.</li>
		<li>Trypsinize תאים חסיד כמו שלב 6.2.2 ולאסוף התליה תא לתוך הצינור 15 מ"ל של צעד 6.2.5. Centrifuge התאים ב x 840 גרם במשך 5 דקות ב- RT.</li>
		<li>וארוקן את תגובת שיקוע והוסף 1 מ"ל של בינוני 1 או 2 בינוניים לספירת תאים. כתם SP-CPCs עם trypan blue (0.4%) ו- count trypan blue-חיוביות (המלח) ותאים trypan blue-שלילי (מעשית). הערה: הכדאיות תא (שלב 6.2.7) ניתנת כמספר trypan-כחול התא שלילי ביחס המספר בתא סכום.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
אינדוקציה של בידול אנדותל
	<ol>
<li>Precoat צלחת תרבות (6-טוב) עם µg/mL 10 laminin (LN) או fibronectin (FN).<ol>
<li>להפוך את פתרון מצע המכיל 10 µg/mL של LN או FN עם F12 בינוני (או PBS). להוסיף 2 מ"ל של המצע פתרון טוב לכל. לשמור על הלוח למשך 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.</li>
			<li>האחות הפתרון מהצלחת ולהוסיף 2 מ של PBS מכל קידוח עד השימוש בו.</li>
		</ol>
</li>
		<li>האחות המדיום מתאי מהשלב 6.1.2 לשטוף אותם בעדינות עם 5 מיליליטר (37 ° C) HBSS חמות, להתייחס אליהם עם 5 מ של טריפסין-EDTA עבור 5 דקות בחממה תא, הוסף 5 מ של בינוני 1 להפסיק את הפעילות טריפסין, להעביר התליה תא צינור 15 מ"ל.</li>
		<li>Centrifuge התאים ב x 470 גרם במשך 5 דקות ב RT. לשאוב תגובת שיקוע והוסף בינוני 2 לספירת תאים.</li>
		<li>4 תאי זרע 8 x 10 טוב על צלחת מצופה עם 3 מ"ל של 2 בינוני ולשמור אותו ב 37 מעלות צלזיוס במשך 20-24 ח' שינוי המדיום עד 3 מ"ל של 3 בינוני. הערה: אנו ממליצים על שימוש בינוני המכילים ריכוז נמוך סרום — וללא תוספי מזון — עבור ה 20-24 הראשון. המלצנו באמצעות < הנהרות תא 60% (כלומר, המספר הנייד של שלב 6.3.4 יש יותאם בהתאם גודל התא וקצב גדילה).</li>
		<li>התרבות התאים עבור 21 d ושנה המדיום בכל בתלת-ממד.</li>
		<li>לוודא הטבע אנדותל של תאים על-ידי מכתימה אותם עם סמן אנדותל כגון Willebrand פון פקטור (vWF), מיקרוסקופיה פלורסצנטיות ביצוע.<ol>
<li>לשטוף את התאים עם 1 מ"ל של PBS ולתקן את התאים ב- 3.7% פורמלדהיד למשך 2 דקות ב- RT.</li>
			<li>Permeabilize התאים עם 0.1% X טריטון ddH2O (או PBS) במשך 30 דקות, לחסום את זה עם נסיוב עז 10% 1 h RT.</li>
			<li>דגירה התאים עם אנטי-פון Willebrand גורם נוגדנים (1: 100) במשך 48 שעות ב 4 ° C</li>
			<li>לשטוף את התאים 3 x עם 1 מ"ל ל- PBS, 10 דקות בכל פעם. תקופת דגירה אותם עם אלקסה עבור חיל הים 546 עז ארנב אנטי משני נוגדנים (שבערך) של h 1 ב RT בחושך.</li>
			<li>תשטוף שוב 3 x, למשך 10 דקות כל אחד, עם 1 מ"ל ל- PBS. כתם גרעינים תא עם 4'6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (דאפי; שבערך) עבור 5 דקות ב RT בחושך.</li>
			<li>לשטוף את התאים 3 x, למשך 5 דקות כל אחד, עם 1 מ"ל ל- PBS. הר התאים ואחסן אותם ב 4 ° C הערה: התנאים culturing (המצע, בינוני, ריאגנטים משלימה, וריכוז FBS) של שלבים 6.1 ו- 6.3 מתוארים באיור3.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
צינור היווצרות assay
	<ol>
<li>מטריצה קרום המרתף (למשל, Matrigel, המכונה מעתה ואילך מטריקס) להכין צלחת.<ol>
<li>הפשרת המטריצה ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.</li>
			<li>המעיל צלחת 96-ובכן עם 100 µL המטריקס על קרח. הערה: חשוב להימנע בועות במטריקס. לוחיות הרישוי חייב להיות מצופה בקרח כדי למנוע את jellification של המטריקס.</li>
			<li>לשמור על הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.</li>
		</ol>
</li>
		<li>האחות המדיום מתאי (לאחר סיום שלב 6.3.5) לשטוף את התאים עם 5 מיליליטר (37 ° C) HBSS חמות ובעדינות לטפל בהם עם טריפסין-EDTA בשביל 5 דקות בחממה התא. להוסיף 3 בינוני להפסיק את הפעילות טריפסין ולהעביר התליה תא ל צינור 15 מ"ל.</li>
		<li>Centrifuge התאים ב x 470 גרם במשך 5 דקות ב RT. לשאוב תגובת שיקוע, להוסיף 1 מ"ל של 3 בינוני, ו pipet בעדינות.</li>
		<li>לסנן את התאים עם מסננת תא מיקרומטר 35, אם התאים נצברות.</li>
		<li>לספור את התאים, זרע 2 x 103 כדי 4 x 103 תאים µL 100 של 3 בינוני בכל מטריצה מצופים היטב. לקחת את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס בחממה תא עבור 16 h.</li>
		<li>צלם תמונה עם מיקרוסקופ שדה בהיר בהגדלה X 2. הערה: במקרה של trypsinization לא שלם, להאריך את זמן החשיפה כדי טריפסין-EDTA למקסימום של 7-8 דקות.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Beltrami, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+cardiac+stem+cells+are+multipotent+and+support+myocardial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration.</a> Cell. 114 (6), 763-776 (2003).</li>
<li>Hierlihy, A. M., Seale, P., Lobe, C. G., Rudnicki, M. A., Megeney, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+post-natal+heart+contains+a+myocardial+stem+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">The post-natal heart contains a myocardial stem cell population.</a> FEBS Letters. 530 (1-3), 239-243 (2002).</li>
<li>Sandstedt, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Left+atrium+of+the+human+adult+heart+contains+a+population+of+side+population+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Research+in+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Left atrium of the human adult heart contains a population of side population cells.</a> Basic Research in Cardiology. 107 (2), 255(2012).</li>
<li>Bolli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+stem+cells+in+patients+with+ischaemic+cardiomyopathy+%28SCIPIO%29%3A+initial+results+of+a+randomised+phase+1+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial.</a> Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).</li>
<li>Makkar, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracoronary+cardiosphere-derived+cells+for+heart+regeneration+after+myocardial+infarction+%28CADUCEUS%29%3A+a+prospective%2C+randomised+phase+1+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial.</a> Lancet. 379 (9819), 895-904 (2012).</li>
<li>Wu, S. M., Chien, K. R., Mummery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+and+fates+of+cardiovascular+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Origins and fates of cardiovascular progenitor cells.</a> Cell. 132 (4), 537-543 (2008).</li>
<li>Smits, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cardiomyocyte+progenitor+cells+differentiate+into+functional+mature+cardiomyocytes%3A+an+in+vitro+model+for+studying+human+cardiac+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Human cardiomyocyte progenitor cells differentiate into functional mature cardiomyocytes: an in vitro model for studying human cardiac physiology and pathophysiology.</a> Nature Protocols. 4 (2), 232-243 (2009).</li>
<li>Noseda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDGFRalpha+demarcates+the+cardiogenic+clonogenic+Sca1%2B+stem%2Fprogenitor+cell+in+adult+murine+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">PDGFRalpha demarcates the cardiogenic clonogenic Sca1+ stem/progenitor cell in adult murine myocardium.</a> Nature Communications. 6, 6930(2015).</li>
<li>Linke, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+in+the+dog+heart+are+self-renewing%2C+clonogenic%2C+and+multipotent+and+regenerate+infarcted+myocardium%2C+improving+cardiac+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proceeding+of+the+National+Acadademy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Stem cells in the dog heart are self-renewing, clonogenic, and multipotent and regenerate infarcted myocardium, improving cardiac function.</a> Proceeding of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 102 (25), 8966-8971 (2005).</li>
<li>El-Mounayri, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum-free+differentiation+of+functional+human+coronary-like+vascular+smooth+muscle+cells+from+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Serum-free differentiation of functional human coronary-like vascular smooth muscle cells from embryonic stem cells.</a> Cardiovascular Research. 98 (1), 125-135 (2013).</li>
<li>Ellison, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+c-kit%28pos%29+cardiac+stem+cells+are+necessary+and+sufficient+for+functional+cardiac+regeneration+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Adult c-kit(pos) cardiac stem cells are necessary and sufficient for functional cardiac regeneration and repair.</a> Cell. 154 (4), 827-842 (2013).</li>
<li>Oh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+progenitor+cells+from+adult+myocardium%3A+homing%2C+differentiation%2C+and+fusion+after+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Proceeding+of+the+National+Acadademy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cardiac progenitor cells from adult myocardium: homing, differentiation, and fusion after infarction.</a> Proceeding of the National Acadademy of Sciences of the United States of America. 100 (21), 12313-12318 (2003).</li>
<li>Martin, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+expression+of+the+ATP-binding+cassette+transporter%2C+Abcg2%2C+identifies+cardiac+SP+cells+in+the+developing+and+adult+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Persistent expression of the ATP-binding cassette transporter, Abcg2, identifies cardiac SP cells in the developing and adult heart.</a> Developmental Biology. 265 (1), 262-275 (2004).</li>
<li>Pfister, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD31-+but+Not+CD31%2B+cardiac+side+population+cells+exhibit+functional+cardiomyogenic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">CD31- but Not CD31+ cardiac side population cells exhibit functional cardiomyogenic differentiation.</a> Circulation Research. 97 (1), 52-61 (2005).</li>
<li>Pelekanos, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+transcriptome+and+immunophenotype+analysis+of+renal+and+cardiac+MSC-like+populations+supports+strong+congruence+with+bone+marrow+MSC+despite+maintenance+of+distinct+identities%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Comprehensive transcriptome and immunophenotype analysis of renal and cardiac MSC-like populations supports strong congruence with bone marrow MSC despite maintenance of distinct identities.</a> Stem Cell Research. 8 (1), 58-73 (2012).</li>
<li>Laugwitz, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+isl1%2B+cardioblasts+enter+fully+differentiated+cardiomyocyte+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Postnatal isl1+ cardioblasts enter fully differentiated cardiomyocyte lineages.</a> Nature. 433 (7026), 647-653 (2005).</li>
<li>Bu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+ISL1+heart+progenitors+generate+diverse+multipotent+cardiovascular+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human ISL1 heart progenitors generate diverse multipotent cardiovascular cell lineages.</a> Nature. 460 (7251), 113-117 (2009).</li>
<li>Smith, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+resident+endogenous+c-Kit%2B+cardiac+stem+cells+from+the+adult+mouse+and+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of resident endogenous c-Kit+ cardiac stem cells from the adult mouse and rat heart.</a> Nature Protocols. 9 (7), 1662-1681 (2014).</li>
<li>Matsuura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+cardiac+Sca-1-positive+cells+differentiate+into+beating+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Adult cardiac Sca-1-positive cells differentiate into beating cardiomyocytes.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (12), 11384-11391 (2004).</li>
<li>Liang, S. X., Tan, T. Y., Gaudry, L., Chong, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+migration+of+Sca1%2B%2FCD31-+cardiac+side+population+cells+in+a+murine+myocardial+ischemic+model%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Differentiation and migration of Sca1+/CD31- cardiac side population cells in a murine myocardial ischemic model.</a> International Journal of Cardiology. 138 (1), 40-49 (2010).</li>
<li>Vicinanza, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+cardiac+stem+cells+are+multipotent+and+robustly+myogenic%3A+c-kit+expression+is+necessary+but+not+sufficient+for+their+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Adult cardiac stem cells are multipotent and robustly myogenic: c-kit expression is necessary but not sufficient for their identification.</a> Cell Death and Differentiation. 24 (12), 2101-2116 (2017).</li>
<li>Galli, S. J., Tsai, M., Wershil, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+c-kit+receptor%2C+stem+cell+factor%2C+and+mast+cells.+What+each+is+teaching+us+about+the+others%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">The c-kit receptor, stem cell factor, and mast cells. What each is teaching us about the others.</a> American Journal of Pathology. 142 (4), 965-974 (1993).</li>
<li>Konig, A., Corbacioglu, S., Ballmaier, M., Welte, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downregulation+of+c-kit+expression+in+human+endothelial+cells+by+inflammatory+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Downregulation of c-kit expression in human endothelial cells by inflammatory stimuli.</a> Blood. 90 (1), 148-155 (1997).</li>
<li>Ogawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+function+of+c-kit+in+hemopoietic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Expression and function of c-kit in hemopoietic progenitor cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 174 (1), 63-71 (1991).</li>
<li>Bradfute, S. B., Graubert, T. A., Goodell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+Sca-1+in+hematopoietic+stem%2Fprogenitor+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Roles of Sca-1 in hematopoietic stem/progenitor cell function.</a> Experimental Hematology. 33 (7), 836-843 (2005).</li>
<li>Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+functional+properties+of+murine+hematopoietic+stem+cells+that+are+replicating+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 183 (4), 1797-1806 (1996).</li>
<li>Pfister, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+ATP-binding+cassette+transporter+Abcg2+in+the+phenotype+and+function+of+cardiac+side+population+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Role of the ATP-binding cassette transporter Abcg2 in the phenotype and function of cardiac side population cells.</a> Circulation Research. 103 (8), 825-835 (2008).</li>
<li>Messina, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+expansion+of+adult+cardiac+stem+cells+from+human+and+murine+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart.</a> Circulation Research. 95 (9), 911-921 (2004).</li>
<li>Davis, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+the+cardiosphere+method+to+culture+cardiac+progenitor+cells+from+myocardial+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Validation of the cardiosphere method to culture cardiac progenitor cells from myocardial tissue.</a> PLoS One. 4 (9), e7195(2009).</li>
<li>Carr, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiosphere-derived+cells+improve+function+in+the+infarcted+rat+heart+for+at+least+16+weeks--an+MRI+study%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cardiosphere-derived cells improve function in the infarcted rat heart for at least 16 weeks--an MRI study.</a> PLoS One. 6 (10), e25669(2011).</li>
<li>Martens, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhesus+monkey+cardiosphere-derived+cells+for+myocardial+restoration%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Rhesus monkey cardiosphere-derived cells for myocardial restoration.</a> Cytotherapy. 13 (7), 864-872 (2011).</li>
<li>Cheng, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relative+roles+of+CD90+and+c-kit+to+the+regenerative+efficacy+of+cardiosphere-derived+cells+in+humans+and+in+a+mouse+model+of+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Heart+Association%22%5BJournal%5D)">Relative roles of CD90 and c-kit to the regenerative efficacy of cardiosphere-derived cells in humans and in a mouse model of myocardial infarction.</a> Journal of the American Heart Association. 3 (5), e001260(2014).</li>
<li>Mochizuki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polo-Like+Kinase+2+is+Dynamically+Regulated+to+Coordinate+Proliferation+and+Early+Lineage+Specification+Downstream+of+Yes-Associated+Protein+1+in+Cardiac+Progenitor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Heart+Association%22%5BJournal%5D)">Polo-Like Kinase 2 is Dynamically Regulated to Coordinate Proliferation and Early Lineage Specification Downstream of Yes-Associated Protein 1 in Cardiac Progenitor Cells.</a> Journal of the American Heart Association. 6 (10), (2017).</li>
<li>Pfister, O., Oikonomopoulos, A., Sereti, K. I., Liao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+resident+cardiac+progenitor+cells+by+Hoechst+33342+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of resident cardiac progenitor cells by Hoechst 33342 staining.</a> Methods in Molecular Biology. 660, 53-63 (2010).</li>
<li>Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+factors%2C+matrices%2C+and+forces+combine+and+control+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells.</a> Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).</li>
<li>Plaisance, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocyte+Lineage+Specification+in+Adult+Human+Cardiac+Precursor+Cells+Via+Modulation+of+Enhancer-Associated+Long+Noncoding+RNA+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22JACC%3A+Basic+to+Translational+Science%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocyte Lineage Specification in Adult Human Cardiac Precursor Cells Via Modulation of Enhancer-Associated Long Noncoding RNA Expression.</a> JACC: Basic to Translational Science. 1 (6), 472-493 (2016).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

היתרונות של פרוטוקול זה:
פרוטוקול זה מספק טכניקה בידול אנדותל של CPCs. מצאנו כי ריכוז בסרום נמוכה בעלת צפיפות נמוכה תא יכול לשפר את היעילות של בידול אנדותל, לפיה LN נוכחו להיות מצע מתאים יותר מאשר FN בתנאים אלה. . היינו שני סוגים שונים של CPCs: עכברוש CPCs, אשר היו בשימוש של התא, כמו קו באופן, ועכבר SP-CPCs, אשר היו מבודדים והתרחבה. ראוי לציין, הפרוטוקול הייתה ישימה על שני הסוגים של זרם CPCs. טכניקות לאפשר המדענים לבודד ולהרחיב את CPCs הראשית של עכברים מהונדסים מן המחלה פרה מודלים, כמו גם מן בני<...

מחקרים שנעשו לאחרונה לתמוך את קיומו של תושב ובתאים הלב (CPCs) של הלב יונקים בוגרים1,2,3, CPCs יכול להיות מקור שימושי עבור טיפול בתאי לאחר פציעה לב4, 5. בנוסף, CPCs המורחב עשוי לספק מודל פורה והתרופות הקרנה, החקירה של מנגנוני המחלה כאשר מבודדים מחולים עם cardiomyopathies נדירים, או ממחלת בהתאמה מודלים6,7.
CPCs מבודד בלב למבוגרים בעלי גזע/קדמון תא מאפיינים1,2,3,8 כפי שהם multipotent, clonogenic, יש יכולת התחדשות עצמית. עם זאת, ישנן אוכלוסיות שונות (sub) רבים של CPCs מפגין סמן משטח שונה פרופילים, כולל, למשל, c-kit, Sca-1 ואחרים, או שאוחזרו באמצעות טכניקות שונות בידוד (טבלה 1). מספר פרוטוקולים תרבות ובידול כבר הוקמה1,2,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17,18. פרוטוקולים אלה משתנים בעיקר ביחס גורם גדילה והתוכן סרום, אשר מותאמים בהתאם לצורך culturing, אשר יכול להוביל הבדלי תוצאות ותוצאות, לרבות יעילות בידול.
טכניקות בידוד המבוסס על סמן:
CPCs ניתן לבודד המבוסס על סמן משטח מסוים ביטוי1,2,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18. מחקרים קודמים מצביעים כי c-kit, Sca-1 ייתכן הסמנים הכי טוב כדי לבודד תושב CPCs1,11,14,19,20. כי אף אחד סמנים אלה הוא באמת ספציפי CPCs, שילובים של סמנים שונים בדרך כלל מוחלים. לדוגמה, בעוד CPCs אקספרס רמות נמוכות של c-kit21, c-kit מתבטאת גם על ידי סוגי תאים אחרים, כולל תאי פיטום22, תאי אנדותל23של תאי גזע hematopoietic/קדמון24. בעיה נוספת היא העובדה כי לא כל הסמנים מבוטאים על-פני כל המינים. זהו המקרה Sca-1, אשר מבטא את העכבר אך לא אנושי25. לכן, באמצעות פרוטוקולים שאינן תלויות סמני בידוד עשוי להיות יתרון על רקע ניסויים קליניים ומחקרים באמצעות דגימות אנושי.
סמן תלויית בידוד טכניקות:
ישנן מספר טכניקות העיקריים של עלות לקליק בידוד, אשר אינם תלויים בראש ובראשונה ביטוי סמן משטח, אך אשר יכול להיות מעודן על-ידי בחירת ברציפות subfractions סמן-חיובית מסוימת. כנדרש (ראה גם לוח 1). (1) הטכניקה האוכלוסייה (SP) צד במקור מלווה בקרב אוכלוסיה פרימיטיבית של תאי גזע hematopoietic מבוסס על היכולת בזרימת לצבוע דנ א Hoechst 3334226 ב- ATP-איגוד קלטת (ABC) מובילי27. תאי SP לב מבודדת על ידי קבוצות שונות ודיווח לבטא מגוון של סמנים עם כמה הבדלים משניים בין דוחות2,8,13,14. (2) יחידה המושבה יוצרי תאי פיברובלסט (CFU-Fs) במקור הוגדרו בהתבסס על תא סטרומה mesenchymal (MSC)-כמו פנוטיפ. MSCs מבודד מתורבתים על מנות לזירוז הקמת המושבה. כגון המושבה יוצרי MSC דמוי CFU-Fs ניתן לבודד מהלב למבוגרים, והם מסוגלים להתמיין שושלות לב15. (3) Cardiosphere נגזר תאים (CDC) הם תאים בודדים נגזר אשכולות של התאים גדלו של ביופסיות רקמות או explants28,29,30,31. זה הוצג לאחרונה זה בעיקר את CD105+/CD90–/c-kit– תא שבר מוצגים cardiomyogenic, פוטנציאל הרגנרציה32.
כאן, אנו באמצעות SP-CPCs מבודד מן העכברים, מספקים פרוטוקול אינדוקציה יעיל של השושלת אנדותל מבוסס על מחקר קודם CPCs חולדה, עכבר SP-CPCs33. הפרוטוקול מכיל עיבודים ספציפית לתרבות, טכניקה הרחבה לגבי צפיפות התאים, התוכן סרום של המדיום, ואת המצע. זה יכול לחול לא רק על העכבר SP-CPCs אך לסוגים שונים של CPCs למטרה לזירוז מתג גורל מ הגברה ל CPC אנדותל שבוצעו, יהיה זה על רקע השתלת תאים אלה או השימוש בהם ללימודי מכניסטית במבחנה .

<table><tbody><tr><td><מדיום תרבית חזק></חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מדיום דולבקו השונה של איסקוב (IMDM)</td><td>ThermoFisher</td><td>#12440</td><td></td></tr><tr><td>מדיום הנשר השונה של דולבקו (DMEM)/תערובת חומרים מזינים F12 חזיר</td><td>מרק</td><td>#D8437</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין (P/S)</td><td>ThermoFisher</td><td>#15140122</td><td></td></tr><tr><td>בקר עוברי סרום (FBS)</td><td>היקלון</td><td>#SH30071</td><td>3.5% (0.1% להשראת שושלת)</td></tr><tr><td>L-גלוטמין&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>#25030</td><td>ריכוז סופי 2 מ"מ</td></tr><tr><td>גלוטתיון</td><td>Merck</td><td>#G6013</td><td></td></tr><tr><td>גורם גדילה אפידרמלי אנושי רקומביננטי (EGF)</td><td>Peprotech</td><td>#AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>גורם גדילה פיברובלסטי בסיסי רקומביננטי (FGF)</td><td>Peprotech</td><td>#AF-100-18B</td><td></td></tr><tr><td>B27 תוסף</td><td>תזונה ThermoFisher</td><td>#17504044</td><td></td></tr><tr><td>קרדיוטרופין 1&nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>#250-25</td><td></td></tr><tr><td>Thrombin</td><td>Diagontech AG, שוויץ</td><td>#100-125</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-)</td><td>ThermoFisher</td><td>#14170</td><td></td></tr><tr><td>0.05 % Trypsin-EDTA</td><td>ThermoFisher</td><td>#25300</td><td></td></tr><tr><td>T75 בקבוק</td><td>Sarstedt</td><td>#83.3911</td><td></td></tr><tr><td><התמיינות אנדותל חזקה>&nbsp; &nbsp; </חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מדיום גידול תאי אנדותל (EGM)-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>#CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>Ham's F-12K (Kaighn's) Medium</td><td>ThermoFisher</td><td>#21127</td><td></td></tr><tr><td>Laminin&nbsp;</td><td>מרק</td><td>#L2020</td><td></td></tr><tr><td>פיברונקטין&nbsp;</td><td>Merck</td><td>#F4759</td><td>דילול ב-ddH2O</td></tr><tr><td>6 Well Plate</td><td>Falcon</td><td>#353046</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת פורמלדהיד</td><td>Merck</td><td>#F1635</td><td>דילויט 1:10 ב-PBS (3.7% ריכוז סופי)</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merck</td><td>#93420</td><td>0.1% ב-ddH2O</td></tr><tr><td>סרום עיזים רגיל (10%)</td><td>ThermoFisher</td><td>#50062Z</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד פון ווילברנד פקטור</td><td>Abcam</td><td>#ab6994</td><td>1:100 ב-10% סרום עיזים</td></tr><tr><td>עיזים אנטי-ארנב IgG, Alexa Fluor 546</td><td>ThermoFisher</td><td>#A11010</td><td>1:500 בסרום עיזים 10%</td></tr><tr><td>4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול, דיהידרוכלוריד (DAPI)</td><td>ThermoFisher</td><td>#62247</td><td>1:500 ב ddH2O&nbsp;</td></tr><tr><td>SlowFade Antifade Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>#S2828</td><td></td></tr><tr><td>BX63 מיקרוסקופ שדה רחב</td><td>אולימפוס</td><td></td><td></td></tr><tr><td><חזק>היווצרות צינור</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 באר צלחת</td><td>פלקון</td><td>#353072</td><td></td></tr><tr><td>5 מ"ל צינור תחתון עגול עם מכסה מסננת</td><td>Falcon</td><td>#352235</td><td></td></tr><tr><td>גורם גדילה מטריג'ל מופחת</td><td>Corning</td><td>#354230</td><td></td></tr><tr><td>IX50 מיקרוסקופ שדה רחב</td><td>אולימפוס</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sca-1+/CD31- בידוד אוכלוסיית צד לבבי34&nbsp; </חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><חזק>ריאגנטים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פנטוברביטל נטריום 50 מ"ג/מ"ל אד אוסום וטרינר.</td><td>בית מרקחת בבית חולים</td> <td>#9077862</td><td>פתרון עבודה: 200 מ"ג/ק"ג</td></tr><tr><td>מי מלח פוספט חוצץ (PBS) CaCl2(-), MgCl2(-)</td><td>ThermoFisher</td><td>#20012</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS) CaCl2(-), MgCl2(-), פנול אדום (-)</td><td>ThermoFisher</td><td>#14175</td><td>הכן HBSS 500 מ"ל + 2% FBS&nbsp; להרוות פעילות קולגנאז B&nbsp;</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 1 גרם/ליטר של D-גלוקוז, L-גלוטמין, פירובט</td><td>ThermoFisher</td><td>#331885</td><td>הכינו DMEM + 10% FBS&nbsp; + 25 מ"מ HEPES+ P/S עבור Hoechst stanining</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין&nbsp; (נ.ב)</td><td>ThermoFisher</td><td>#15140122</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>ThermoFisher</td><td>#15630080</td><td>ריכוז סופי 25 מ"מ</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>#SH30071</td><td></td></tr><tr><td>RBC LysisBuffer (10X)</td><td>BioLegend</td><td>#420301/100 מ"ל</td><td>לדלל ל-1X ב-ddH2O ולסנן דרך 0.2 ומיקרו; m filter</td></tr><tr><td>Collagenase B</td><td>Merck</td><td>#11088807001</td><td>ריכוז סופי של 1 מ"ג/מ"ל ב-HBSS, מסונן דרך 0.2 ומיקרו; m filter</td></tr><tr><td>bisBenzimide H33342 Trihydrochloride (Hoechst)</td><td>Merck</td><td>#B2261</td><td>הכן 1 מ"ג/מ"ל ב-ddH2O</td></tr><tr><td>Verapamil-hydrochloride&nbsp;</td><td>מרק</td><td>#V4629</td><td>ריכוז סופי 83.3 ומיקרו; M&nbsp;</td></tr><tr><td>APC Rat Anti-Mouse CD31</td><td>BD Biosciences</td><td>#551262</td><td>0.25 & g/107cells</td></tr><tr><td>FITC Rat Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1)</td><td>BD Biosciences</td><td>#557405</td><td>0.6 &micro; גרם/107תאים</td></tr><tr><td>7-אמינואקטינומיצין D (7-ADD)</td><td>ThermoFisher</td><td>#A1310</td><td>0.15 ומיקרו; g/106cells</td></tr><tr><td>APC חולדה IgG2a k בקרת איזוטיפ</td><td>BD Biosciences</td><td>#553932</td><td>0.25 &micro; g/107cells</td></tr><tr><td>FITC Rat IgG2a k בקרת איזוטיפ</td><td>BD Biosciences</td><td>#554688</td><td>0.6 & מיקרו; g/107תאים</td></tr><tr><td><חזקים>חומר</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מחטים 27G</td><td>Terumo</td><td>#NN-2719R</td><td></td></tr><tr><td>מחטים 18G</td><td>Terumo</td><td>#NN-1838S</td><td></td></tr><tr><td>מזרקים לשימוש חד פעמי 1 מ"ל</td><td>CODAN</td> סטרילי<td>#62.1640</td><td></td></tr><tr><td>Transferpipette 3.5 מ"ל</td><td>Sarstedt</td><td>#86.1171.001</td><td></td></tr><tr><td>תא מסננת 40 ומיקרו; m כחול</td><td>BD Biosciences&nbsp;</td><td>#352340</td><td></td></tr><tr><td>מסננת תאים 100 ומיקרו; m צהוב</td><td>BD Biosciences</td><td>#352360</td><td></td></tr><tr><td>צלחת לומוקס 50</td><td>Sarstedt</td><td>#94.6077.305</td><td></td></tr><tr><td>מנות תרבות P100</td><td>קורנינג</td><td>#353003</td><td></td></tr><tr><td>מנות תרבות P60</td><td>קורנינג</td><td>#353004</td><td></td></tr><tr><td><חזק>עכבר</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><חזק>קו</חזק></td><td><חזק>גיל</חזק></td><td><חזק>רבייה</חזק></td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6NRj / זכר</td><td>12 שבועות</td><td>בבית</td><td></td></tr><tr><td><חזק>שם מוצר</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק></td><td><חזק>מס' קטלוג מס</חזק></td><td></td></tr><tr><td><חזק>ריאגנטים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מדיום דולבקו המותאם של איסקוב (IMDM)</td><td>ThermoFisher</td><td>#12440</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)/תערובת תזונתית F12 חזיר</td><td>Merck</td><td>#D8437</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין&nbsp; (נ.ב)</td><td>ThermoFisher</td><td>#15140122</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>היקלון</td><td>#SH30071</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>#25030</td><td></td></tr><tr><td>Glutathione</td><td>Merck</td><td>#G6013</td><td></td></tr><tr><td>תוסף B27</td><td>ThermoFisher</td><td>#17504044</td><td></td></tr><tr><td>גורם גדילה אפידרמלי אנושי רקומביננטי (EGF)</td><td>Peprotech</td><td>#AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי רקומביננטי (FGF)</td><td>Peprotech</td><td>#AF-100-18B</td><td></td></tr><tr><td>קרדיוטרופין 1&nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>#250-25</td><td></td></tr><tr><td>Thrombin</td><td>Diagontech AG, שוויץ&nbsp;</td><td>#100-125</td><td></td></tr><tr><td>מדיום גידול תאי אנדותל (EGM)-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>#CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>סקירה כללית של קומפוזיציות בינוניות. חלק ממידע זה זהה לזה שסופק לעיל, אך ממוין לפי ההרכב של מדיה 1-3.&nbsp; </חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><חזק>שם מוצר</חזק></td><td><חזק>בינוני 18</td><td>בינוני 2</חזק></td><td><חזק>בינוני 3</חזק></td></tr><tr><td><חזק>ריאגנטים</חזק></td><td><חזק>תרבות</חזק></td><td><חזק>אינדוקציה שושלת</חזק></td><td><חזק>אנדותל diff.</td></tr><tr><td>מדיום דולבקו מעובד של Iscove (IMDM)</td><td>35%</td><td>35%</td><td></td></tr><tr><td>מדיום הנשר השונה של דולבקו (DMEM)/תערובת נוטריאנטים F12 חזיר</td><td>65%</td><td>65%</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין&nbsp; (נ.ב)</td><td>1%</td><td>1%</td><td></td></tr> <tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>3.5%</td><td>&le; 0.1%</td><td></td></tr> <tr><td>L-גלוטמין&nbsp;</td><td>2 מ"מ</td><td>2 מ"</td><td></td></tr>מ <tr><td>גלוטתיון</td><td>0.2 ננומטר</td><td>0.2 ננומטר</td><td></td></tr><tr><td>תוסף B27</td><td>1.3%</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>גורם גדילה אפידרמלי אנושי רקומביננטי (EGF)</td> <td>6.5 ננוגרם/מ"ל</td><td></td><td></td></tr><tr><td>גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי רקומביננטי (FGF)</td><td>13 ננוגרם/מ"ל</td><td></td><td></td></tr><tr><td>קרדיוטרופין 1&nbsp;</td><td>0.65 ננוגרם/מ"ל</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תרומבין</td><td>0.0005 U/mL</td><td></td><td>כל הרכיבים הדרושים הכלולים בערכה</td></tr><tr><td>Endothelial Cell Growth Medium (EGM)-2 BulletKit</td><td></td><td></td><td>כל הרכיבים הדרושים הכלולים בערכה</td></tr></tbody></table>

אינדוקציה של אנדותל התמיינות בתאים לב בתנאים בסרום נמוך

Induction of Endothelial Differentiation in Cardiac Progenitor Cells Under Low Serum Conditions

ובתאים הלב (CPCs) ייתכן טיפולית פוטנציאל התחדשות לב לאחר פציעה. בלב יונקים בוגרים, CPCs מהותי נדיר, אך CPCs המורחב יכול להיות שימושי עבור טיפול בתאי. תנאי הכרחי לשימוש שלהם הוא היכולת להתמיין בצורה מבוקרת שושלות לב שונים באמצעות פרוטוקולי מוגדר ויעיל. בנוסף, על הרחבת במבחנה , CPCs מבודדים מחולים או מחלות פרה מודלים עשויים להציע כלי מחקר פורה לחקירה של מנגנוני המחלה.
מחקרים נוכחיים להשתמש סמנים שונים לזיהוי CPCs. עם זאת, לא כולם באים לידי ביטוי אצל בני אדם, אשר מגביל את השפעת translational מחקרים פרה. פרוטוקולים בידול הרלוונטיים ללא קשר ההבעה טכניקה, סמן בידוד יאפשר הרחבת מתוקננת ואת לקרקע של CPCs לצורך טיפול תא. כאן נתאר כי לקרקע של CPCs תחת ריכוז נמוך סרום שור עוברית (FBS) ותנאי צפיפות נמוכה תא מקלה את הבידול אנדותל של CPCs. באמצעות שתי subpopulations שונות של עכבר, חולדה CPCs, אנו מראים ש-laminin את זה יותר המצע מתאימה יותר fibronectin למטרה זו תחת פרוטוקול הבאים: לאחר culturing במשך 2-3 ימים בינוני כולל תוספי תזונה זה לשמור על multipotency ועם 3.5% FBS, CPCs נזרע על laminin ב < 60% הנהרות ותרבותית ב ללא תוספת בינוני עם ריכוזים נמוכים של FBS (0.1%) 20-24 שעות לפני בידול בידול אנדותל בינוני. מאחר CPCs הם אוכלוסיה הטרוגנית, סרום ריכוזים ושעות הדגירה עשוי צריכים להיות מותאמים בהתאם המאפיינים של subpopulation בהתאמה עלות לקליק. בהתחשב בכך, הטכניקה ניתן להחיל על סוגים אחרים של CPCs כמו גם והוא מספק שיטה שימושית כדי לחקור את הפוטנציאל ואת המנגנונים של בידול, כיצד הן מושפעות על ידי מחלת בעת שימוש CPCs מבודד מן המחלה בהתאמה מודלים.

בידוד SP-CPC העכבר:
במחקר זה, השתמשנו CPCs העכבר מבודד על פי פנוטיפ SP, ואילו תוצאות של עכברוש CPCs ששינה והוסיף מן הדוח הקודם עם הרשאה (איור 8)33.
התפשטות תאים מתחת הצפיפויות גבוהות ונמוכות תא, עם ריכוזים שונים בסרום:
שלנו מחקר קודם הראה כי הביטוי mRNA של סמנים...

פרוטוקול זה מתאר שיטת בידול אנדותל עבור ובתאים הלב. הוא מתמקד במיוחד כיצד סרום ריכוז וצפיפות זורעות תא משפיעים על פוטנציאל התמיינות אנדותל.

Cardiac progenitor cells (CPCs) may have therapeutic potential for cardiac regeneration after injury. In the adult mammalian heart, intrinsic CPCs are ...

ההידול של תאי הצאצאים הלבביים, או CPCs, בעת הגברה דורש מעבר פאזה מהתרבות לשלב מחויב, ופרוטוקול זה משתמש בשושלת אנדותל יעילה ב- CPCs. היתרון העיקרי של הטכניקה הוא שהיא חלה על CPCs מבודדים על סמך מספר טכניקות ומינים שונים. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לשפר את הפוטנציאל הטיפולי של CPCs לטיפול בתאים.זה יכול לשמש גם כדי לחקור את הפוטנציאלים ואת המנגנונים של ההתברות וכיצד אלה מושפעים ממחלות לב. CPCs הם אוכלוסייה לא אנושית של תאים שעשויים להיות שונים בצורה, בגודל ובעוצמה. לכן, יש להתאים את הפרוטוקול בהתאם לתת-תפוקה הספציפית של CPCs המשמשים.לאחר הרדמה של העכבר, לנגב את החזה שלה עם 70% אתנול. באמצעות מספריים, לחתוך את העור ואת קיר בית החזה כדי לחשוף את חלל בית החזה. השתמש מדפים כדי להרים את הלב, ולאחר מכן להשתמש במספריים לחתוך אותו בבסיס.מעבירים את הלב לצלחת תרבות P60 המכילה חמישה מיליליטר של PBS קר, ולאחר מכן להשתמש במטלפים כדי לשאוב את הלב ולפלט את הדם מתוך החללים. מניחים את הלב בצלחת P60 המכילה חמישה מיליליטר של PBS קר ולשטוף אותו. השתמש מספריים קטנים כדי להסיר את האטריה, לחתוך את הלב לשתי חתיכות אורך, ולשטוף אותם חמישה מיליליטר של קרח קר PBS.באמצעות מספריים קטנים, לחתוך את חתיכות הלב לחלקים קטנים יותר. הוסיפו טיפת תוסף מלח מאוזן של האנק המכיל קולגן B בריכוז של מיליגרם אחד למיליליטר, ולהשתמש בסכין גילוח סטרילי כדי לטחון את חתיכות הלב הקטנות ביסודיות. לאחר מכן, מוסיפים 2.5 מיליליטר של תוסף הקולגנס B לצלחת.מניחים את המנה בזווית של 30 מעלות באינקובטור ב-37 מעלות צלזיוס. תן חתיכות לב טחון דגירה לכל היותר 30 דקות תוך העברת אותם שוב ושוב דרך פיפטה פסטר כל 10 דקות במהלך הדגירה. ראשית, הוסיפו חמישה מיליליטר של HBSS קר בתוספת 2%FBS לחתיכות הלב הטחון וההומוגני.באמצעות מסנן 100 מיקרומטר, לסנן את חתיכות הלב כדי להסיר כל רקמה מעוכל. צנטריפוגה ב 470 פעמים G ו בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. השלך את העל-טבעי והשהה מחדש את גלולת הכדור בחמישה מיליליטר של חיץ תותלי דם אדומים.דגירה על קרח במשך חמש דקות עם רעידות מדי פעם. לאחר מכן, להוסיף 10 מיליליטר של PBS ולסנן את המדגם באמצעות מסנן 40 מיקרומטר כדי לא לכלול תאים גדולים יותר כולל שאריות cardiomyocytes. צנטריפוגה ב 470 פעמים G ו בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות ללא הפסקה.לאחר מכן, להשעות מחדש את התאים ב- DMEM בתוספת 10%FBS, מכוון ריכוז התא הסופי של מיליון תאים למיליליטר. פזרו את התאים לשני צינורות להכתמה ומיון, והוסיפו 1.5 מיליליטר של תפתור התא לצינור אחד ו-3.5 מיליליטר לצינור השני. מוסיפים את פתרון Hoechst ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות עם היפוך מדי פעם כדי להבטיח הפצה שווה של הצבע ולמנוע קרישה של התאים.האוכלוסייה הצדדית מופיעה בפינה השמאלית התחתונה הנמוכה של הויצ'אסט מלבד האוכלוסייה הראשית. בעלילה FACS ניתן לזהות אותו בהתבסס על הפקד השלילי שבו verapamil מבקש האוכלוסייה הצדדית להיעלם. מחממים בינוני אחד עד 37 מעלות צלזיוס ומצננים את הצנטריפוגה לארבע מעלות צלזיוס.צנטריפוגה צינורות המיון ב 470 פעמים G וב ארבע מעלות צלזיוס במשך שש דקות. לאחר מכן, השהה מחדש את התאים בתא בינוני אחד. מעבירים את התאים לצלחת P60 חדירה לגז המכילה ארבעה מיליליטר של בינוני אחד.שנה את המדיום כל שלושה ימים עד שהתאים הגיעו להתכנסות בין 70% ל- 80%Culture SP-CPCs למשך יומיים עד שלושה בבקבוקי T75 באמצעות שמונה מיליליטר של בינוני אחד בכל בקבוקון. לאחר מכן, שאפו בזהירות את המדיום ושטוף בעדינות את הבקבוק בחמישה מיליליטר של HBSS חם. לטפל בתאים עם חמישה מיליליטר של טריפסין EDTA במשך חמש דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.לאחר מכן, להוסיף חמישה מיליליטר של בינוני אחד כדי לעצור את פעילות טריפסין, ולהעביר את ההשעיה התא לצינור 15 מיליליטר. צנטריפוגה ב 470 פעמים G במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, השהה מחדש את התאים בתא בינוני אחד או בשניים בינוניים.צלחת התאים על מנות P60, ציפוי 250, 000 SP-CPCs למנה עם שלושה מיליליטר של בינוני המכיל ריכוזי סרום שונים. לאחר יומיים של culturing, לאסוף את המדיום מכל מנה לתוך צינור 15 מיליליטר כדי לאסוף את התאים המתים. טריפסין התאים חסיד כפי שתואר בעבר ולאסוף את ההשעיה התא לתוך הצינור 15 מיליליטר המכיל את המדיום שנאסף.צנטריפוגה ב 840 פעמים G במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן שאף את supernatant ולהוסיף מיליליטר אחד של בינוני אחד או בינוני שתיים לספירת תאים. הכתם את ה- SP-CPCs בכחול טריפאן וספיר את התאים בני קיימא ומתים. ראשית, שאפו את המדיום מהתאים המוכנים, ושטוף אותם בעדינות בחמישה מיליליטר של HBSS חם.לטפל בתאים עם חמישה מיליליטר של טריפסין EDTA במשך חמש דקות באינקובטור התא. לאחר מכן, להוסיף חמישה מיליליטר של בינוני אחד כדי לעצור את פעילות טריפסין. מעבירים את מתלי התא לצינור 15 מיליליטר וצנטריפוגה ב 470 פעמים G במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.שאפו את העל-טבעי והוסיפו שניים בינוניים לספירת תאים. לאחר מכן, זרע 80, 000 תאים לתוך כל באר של צלחת תרבות מצופה מראש שש באר עם שלושה מיליליטר של בינוני שתיים. שמור את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 20 עד 24 שעות, ולאחר מכן לשנות את המדיום בכל באר לשלושה מיליליטר של בינוני שלוש.תרבות הצלחת במשך 21 ימים, שינוי המדיום כל שלושה ימים. לאחר מכן, להכתים את התאים עם סמן אנדותל ולבצע מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לאמת את האופי ה אנדותל של התאים המובחנים. ראשית, שאפו את המדיום מהתאים המוכנים ושטוף אותם בעדינות בחמישה מיליליטר של HBSS חם.לטפל בתאים עם שני מיליליטר של טריפסין EDTA במשך חמש דקות באינקובטור התא, ולאחר מכן להוסיף שלושה מיליליטר של בינוני שלוש כדי לעצור את פעילות טריפסין. מעבירים את מתלי התא לצינור 15 מיליליטר וצנטריפוגה ב 470 פעמים G במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. שאפו את העל-טבעי והוסיפו מיליליטר אחד של מדיום 3, תוך כדי ערבוב עדין.לספור את התאים ואת הזרע בין 2, 000 ו 4, 000 תאים ב 100 microliters של בינוני שלוש לכל מטריצה מצופה היטב של צלחת 96 באר. דגירה הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות. לאחר מכן, השתמש במיקרוסקופ שדה בהיר בהגדלה פעמיים כדי לצלם את התאים.במחקר זה, תנאים מתאימים נחקרים להקלה על מחויבות שושלת אנדותל של תאי לב. כאשר קונפלינציית התא היא ב- 60% או מתחת לה, לא נראה הבדל משמעותי בדגימות שטופלו ב- 3.5%FBS. כאשר תאים ב confluency זו מטופלים עם 0.1%FBS, הם מראים ירידה בהתפשטות התא על למינין בהשוואה פיברונאקטין, אבל לא מראים עלייה במוות התא.לעומת זאת, תאים בקונפלות גבוהה מראים שאין הבדל משמעותי בהתפשטות התאים או במוות התאים בין שני התנאים. שינויים בצורת התא נראים כאינדיקטור לתנאי תרבות מתאימים שבהם דיפרנציאלי אנדותל הולך להיות מוצלח. בתוך שבעה עד 14 ימים במדיום דיפרנציאלי אנדותל, תרבויות מוצלחות נתפסות להכיל תאים גדולים יותר עם מורפולוגיה שונה.באופן מעניין, תאים אלה נעלמו לקראת סוף שלב ההידול ונטה להופיע במספרים נמוכים יותר ובזמן מאוחר יותר מצביעים על תרבויות בצפיפות גבוהה. היווצרות צינור הוא מוצלח באופן עקבי בתאים מצופים בצפיפות נמוכה מובחן על למינין, בעוד הוא נראה בעיקר להיכשל בתאים מצופים בצפיפות גבוהה. בעוד היווצרות הצינור הוא בעיקר לא מוצלח בתאים מתורבתים על fibronectin ללא קשר לצפיפות התא, אלה מובחנים בצפיפות נמוכה לפעמים יוצרים צינורות בסיסיים.ריכוז הסרום וצפיפות התאים כדי לגרום לשושלת אנדותל הם קריטיים, ויש להתאים אותם כדי להבטיח האטה של התפשטות תוך שמירה על הכדאיות. עם אינדוקציה שושלת, CPCs מבני אדם או מודלים מחלה פרה-קלינית עשוי לשמש עבור מחקרים השתלת תאים כדי להעריך את פוטנציאל ההידול in vivo שלהם. פרוטוקול זה יכול לעזור ללמוד או להקים כלי התחדשות לב חדשניים, והוא שימש בעבר לחקר מנגנון מולקולרי של מחויבות שושלת מוקדמת.

induction-endothelial-differentiation-cardiac-progenitor-cells-under

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

הקמנו פרוטוקול לזירוז של cardioblasts ישירה אנושי לתאי גזע עובריים pluripotent נשמר בתנאים מוגדרים עם מולקולות קטנות, המאפשרת גזירת אספקה ​​גדולה של אבות לב האדם תפקודי הלב וכלי הדם cardiomyocytes עבור התיקון.

גזירת יעיל של מבשרי לב cardiomyocytes האדם מן האדם תאים pluripotent גזע עובריים עם אינדוקציה מולקולה קטנה

פרוטוקול זה מתאר אינדוקציה יעילה של אנדותל המוגני ואבות המטופויאטיים רב-פוטנציאליים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים באמצעות ביטוי מאולץ של גורמי שעתוק.

אינדוקציה ישירה של Hemogenic האנדותל ודם על ידי יתר של גורמי שעתוק בתאי גזע pluripotent האדם

כתב יד זה מתאר את היצירה של רקמות לב מהונדסות מוגדרות באמצעות ביטוי סמני פני השטח ומיון תאים. לאחר מכן ניתן להשתמש ברקמות המוגדרות בביו-ריאקטור רב-רקמתי כדי לחקור מנגנונים של טיפול בתאי לב על מנת לספק מערכת מודל פונקציונלית, אך מבוקרת, של הלב האנושי.

בניית רקמות לב Engineered האנושית תחם לחקור מנגנונים של טיפול בתאי לב

ובתאי אנדותל (EPCs) מעורבים באופן מכריע על נאווסקולריזציה של רקמות איסכמי. שיטה זו מתארת ​​את הבידוד של EPCs אדם מדם היקפי, כמו גם זיהוי של פוטנציאל הנדידה שלהם נגד דגימות סרום חולי הכירורגיים לב.

בידוד של ובתאים אנדותל מן הבריאה מתנדבת ופוטנציאל הנדידה שלהם בהשפעת דגימות סרום לאחר ניתוח הלב

כאן, אנו מציגים שיטה יעילה לרתום את הפוטנציאל בידול הלב של מקורות צעיר של גזע mesenchymal האנושי על מנת ליצור תאים פונקציונלית, קבלנות, כמו cardiomyocyte אין ויטרו.

במבחנה הבידול של גזע Mesenchymal אנושי לתוך תאים דמויי Cardiomyocyte תפקודית

המטרה של פרוטוקול זה נועד לבודד ובתאים אנדותל של דם טבורי. חלק מהיישומים כוללות שימוש תאים אלה כמו סמן לזיהוי חולים עם הסיכון למחלות לב, במחלות איסכמי, ובונה יצירת שסתום כלי הדם והלב רקמות מהונדסים.

בידוד של אנדותל ובתאים של דם טבורי אנושי

כאן נתאר שיטת מדרגיים, באמצעות שילוב פשוט של Activin A ו- Id1 בתיווך lentivirus-ביטוי, כדי ליצור אבות לב שדה דמויי הלב הראשון וחדרית דמוי cardiomyocytes מתאי גזע pluripotent אנושי.

הדור של אבות לב שדה דמויי הלב הראשון, דמוי-חדרית Cardiomyocytes מתאי גזע Pluripotent אנושי

מטרת שיטה זו היא לייצר תאים ספציפיים לשדה הלב בחלל החוץ בתוך מבחנה כדי ללמוד את המפרט תא מחולל ותכונות פונקציונלי, וליצור תאי לב מסוימים בחדר לדגמי מחלות לב.

בדור מחוץ לתחום של לב העכבר שדה מסוים בתאי לב

הפרוטוקול הנוכחי מייצר רקמות לב מהונדסות בצורת רשת המכילות תאי לב וכלי דם המופקים מתאי גזע פלורופוטנטיים אנושיים כדי לאפשר חקירה של טיפול השתלת תאים למחלות לב.

הכנת רקמות לב מהונדסות בצורת רשת נגזר תאי iPS אנושיים לתיקון שריר הלב Vivo

מוצג כאן פרוטוקול פשוט להתמיינות מכוונת של תאי אנדותל המוגני מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים תוך כשבוע.

התמיינות מכוונת של תאי אנדותל המוגניים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

למדו פרוטוקול יעיל להבדלה אנדותליאלית של תאי קדם לב CPCs בתנאי סרום נמוך. השיטה מאפשרת חקר מנגנוני התחדשות לבבית ופיתוח טיפולים תאיים.

אינדוקציה של אנדותל התמיינות בתאים לב בתנאים בסרום נמוך

גלה סרטונים נוספים