גבוהות בתוספת מבוך מבחן משולב עם וידאו מעקב תוכנה כדי לחקור את האפקט נוגד חרדה של תוספי תזונה קטוגנית אקסוגני
7 בינואר 2019
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לחקור שינויים ברמת החרדה של מודלים בעלי חיים מכרסם. מוגברות וגם מבוך במבחן (EPM), המשמש יחד עם וידאו מעקב תוכנה, מספק שיטה אמינה לתעד את ההשפעה של טיפולים שונים נוגד חרדה פוטנציאליים בתרחישים מעבדה פרה.
מבוך פלוס מוגבה היא שיטה לתעד את ההשפעה של טיפולים שונים שעלולים להיות אקסיוליטיים על מודלים מכרסמים במעבדה בצורה אנושית יותר בהשוואה לשיטות אחרות. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא המסתמך על נטייתו האינסטינקטיבית של המכרסם הן לחללים חשוכים והן לחללים סגורים, בנוסף לפחד הבלתי מותנה מגבהים והימנעות ממרחבים פתוחים. קולין פארק, משתף פעולה מהמעבדה שלי, יעזור להדגים את ההליך.
מספר ימים לפני הבדיקה, לטפל בבעלי החיים על ידי לקטוף אותם על ידי פלג הגוף העליון שלהם מחזיק אותם לרגע כדי להתאקלם לנסיין. לאחר מכן, למדוד את משקל הגוף של בעלי החיים לפני תחילת כל טיפולים כדי לקבוע את חישוב המינון לטיפול. לאחר מכן, היכרות עם בעלי החיים לשיטת gavage intragastric באמצעות מים על ידי gavage במשך חמישה ימים לפני תוספי קטון.
לצורך חרדה, השתמש במבוך פלוס מוגבה או מנגנון EPM, מנגנון בצורת פלוס עם ארבע זרועות עם שתיים פתוחות ושתיים סגורות. האר את מנגנון EPM באמצעות תאורה עקיפה מהתקרה במקום להאיר אותו ישירות. ודא שכל ארבע הזרועות מוארות באופן דומה.
חבר את מפתח ההתקנה של תוכנת המעקב אחר תנועה ליציאת USB 2.0 והתקן את התוכנה. לאחר מכן, לתקן את המצלמה מעל אזור הניסוי, ולהבטיח שזה יישאר ללא תנועה למשך הניסוי. לבסוף, הגדר ניסוי חדש במערכת התוכנה למעקב אחר תנועה באמצעות מדריך ההוראות.
שים את החיה באזור הניסוי. לאחר מכן, התחל את תהליך רכישת הנתונים על-ידי לחיצה על לחצן 'התחל' בלוח הבקרה של השעה. בחדר הבדיקות אוספים את נתוני ה- EPM בשתי דרכים, באופן ידני ובשימוש בתוכנה.
הצופים העיוורים מופרדים על ידי וילון. המתן עד ל- ene של הקלטת תהליך המעקב או לחץ על לחצן העצור בלוח הבקרה של הזמן. לאחר מכן, הסר את החיה מאזור הניסוי.
לבסוף, כדי לגשת לכלי הניתוח לחץ על לחצן הניתוח בסרגל מסייע הניסויים. בחר גירסאות ניסויים ומרווחי זמן כדי לנתח ולהפיק דוח. התחל בהעברת החולדות בכלוב הביתי שלהן לחדר הניסויים 30 דקות לפני תחילת הניסוי.
מניחים חולדה בצומת של ארבע הזרועות של ה-EPM מול הזרוע הפתוחה מול הניסוי. הפעל את תוכנת מעקב וידאו, כמו גם להקליט באופן ידני את ההתנהגות של החיה במשך חמש דקות. לאחר מכן, אם החיה נופלת מה- EPM, להרים אותו ולמקום אותו בחזרה על אותה נקודה של EPM שבו הוא נפל.
אל תכלול בניתוח את הנתונים ההתנהגותיים של בעל חיים זה. בתום הבדיקה בת חמש הדקות, עצרו את תוכנת המעקב אחר וידאו. מוציאים את החיה מה-EPM, ומ מניחים אותה בחזרה בכלוב הביתי שלה.
לבסוף, לנקות את ה-EPM עם חומר ניקוי חיטוי ואחריו מי ברז. יבש את המנגנון במגבות נייר. לאחר האכלה כרונית, חולדות בקבוצת KSMCT בילו באופן משמעותי יותר זמן בזרועות הפתוחות בהשוואה לקבוצת הביקורת.
קבוצת KS בילתה זמן רב יותר באופן משמעותי במרכז בהשוואה לקבוצת הביקורת. ופחות זמן מושקע בזרועות סגורות בקבוצות LKE, KSS, KSMCT בהשוואה לשליטה. חולדות בקבוצות KSS ו- KSMCT נסעו מרחקים ארוכים יותר באופן משמעותי בזרועות הפתוחות.
בעוד החולדות בקבוצות LKE, KS ו- KSMCT הראו באופן משמעותי פחות מרחק שנסעו בזרועות הסגורות בהשוואה לקבוצת הביקורת. יתר על כן, לאחר שבעה ימים של gavage אוראלי הזמן בילה בזרועות הפתוחות היה גדול יותר בקבוצת KE אבל ירד במרכז עבור KE, KS, ו KSMCT קבוצות. גם מספר הכניסות לזרועות הסגורות היה נמוך משמעותית לאחר שבעה ימי ניהול בקבוצות KE ו-KS.
חשוב מאוד למקם את כל החולדות על הציוד באונור עקבי בצומת הפונה הרחק מהנסיין. הסתערות EPM על מכרסמים היא שיטה מתאימה ורגישה לחקור את ההשפעה של טיפולים שונים המשפיעים על אזורי המוח המעורבים באפקט האקסיוליטי ובמנגנוני הפעולה.
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול להערכת רמות חרדה במודלים של מכרסמים באמצעות מבחן מבוך הפלוס המוגבה (EPM). השיטה, בשילוב עם תוכנה למעקב וידאו, מאפשרת תיעוד מהימן של ההשפעות של טיפולים פוטנציאליים להפגת חרדה (anxiolytic).
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- מדעי ההתנהגות
- פרמקולוגיה
רקע
- מבוך הפלוס המוגבה תוכנן להערכת התנהגות הקשורה לחרדה במכרסמים.
- הוא מנצל את האינסטינקטים הטבעיים של מכרסמים ביחס לחללים פתוחים וסגורים.
- שיטה זו נחשבת להומנית יותר מטכניקות אחרות להערכת חרדה.
- מעקב וידאו משפר את הדיוק של איסוף הנתונים ההתנהגותיים.
מטרת המחקר
- להערכת ההשפעה של טיפולים חרדתיים שונים על רמות חרדה במכרסמים.
- לביסוס פרוטוקול מהימן לביצוע בדיקות EPM.
- לניתוח שינויים התנהגותיים בתגובה לטיפול לאורך זמן.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- טיפול והסגרה של מכרסמים לפני הבדיקה.
- שימוש במערך המבוך הפתוח המוגבה (elevated plus maze) להערכת חרדה.
- שימוש בתוכנה למעקב וידאו לצורך איסוף נתונים.
- ניתוח נתונים התנהגותיים באופן ידני ובאמצעות תוכנה.
תוצאות עיקריות
- חולדות שטופלו ב-KSMCT בילו זמן רב יותר בזרועות הפתוחות בהשוואה לקבוצות הביקורת.
- נצפו הבדלים מובהקים במרחק שעברו בזרועות הפתוחות לעומת הזרועות הסגורות.
- שינויים התנהגותיים נצפו לאחר טיפול כרוני בחומרים שונים.
- בדיקת ה-EPM הוכחה כרגישה לזיהוי השפעות הטיפול על חרדה.
מסקנות
- ה-EPM היא שיטה יעילה למחקר חרדה במודלים של מכרסמים.
- מיקום עקבי של בעלי החיים הוא קריטי לקבלת תוצאות מהימנות.
- מחקרים עתידיים יוכלו לבחון את מנגנוני הפעולה של טיפולים אנקסיוליטיים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך סיכום
מבחן מבוך הפלוס המוגבה (EPM) בשילוב עם מעקב וידאו מספק שיטה רגישה והומנית להערכת השפעות אנקסיוליטיות (חרדתיות) של תוספי קטונים חיצוניים במודלים של מכרסמים. גישה זו תומכת בתיקוף יעדים בשלבים מוקדמים על ידי כימות שינויים התנהגותיים הקשורים לנתיבי חרדה, ובכך מאפשרת הפחתת סיכונים מכניסטית של טיפולים מטבוליים או תרופתיים. השיטה מייצרת נקודות קצה כמותיות וניתנות לשחזור, המשמשות לבסיס קבלת החלטות של המשך או עצירה (go/no-go) במסלולי גילוי פרה-קליניים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות על ידי מדידת הזמן שהועבר בזרועות פתוחות לעומת סגורות כמדד להפחתת חרדה.
- ערך תפעולי: מאפשר איסוף נתונים התנהגותיים אוטומטי ומסווג (blinded) באמצעות מעקב וידאו, כדי להפחית הטיות של הצופה ולהגביר את השחזוריות.
- ערך ניבוי: מזהה השפעות דמויות-אנקסיוליטיות (חסיכת חרדה) של תסמיכי קטונים, מה שמחזק את הביטחון ביעילות של תרכובות המשפיעות על מערכת העצבים המרכזית (CNS).
סריקה ופיתוח בדיקות
- מוכנות הבדיקה: מכשיר EPM סטנדרטי עם תאורה עקבית ומיקום קבוע של בעלי החיים מבטיחים ביצועי בסיס אמינים בכל קבוצות הטיפול.
- פלט כמותי: מעקב וידאו מספק מדדים מדויקים של הזמן שהושל았다 בזרועות הפתוחות/סגורות והמרחק שעבר בעל החיים, מה שמאפשר אפיון של תגובת המינון.
- יכולת הרחבה: הפרוטוקול תומך במשטרי מינון כרוניים (83 ימים) ותת-כרוניים/חריפים (7 ימים) לצורך הערכה התנהגותית אורךית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מודד התנהגות הקשורה לחרדה בחולדות Sprague Dawley, מודל רלוונטי תרגומי לסריקה של הפרעות נוירופסיכיאטריות.
- הסרת סיכונים מכניסטיים: מבחין בין השפעות על חקירה של זרועות פתוחות לבין הימנעות מזרועות סגורות כדי להבהיר בלבול בין השפעות חרדוניות (anxiolytic) להשפעות מרגיעות (sedative).
- המשכיות תרגומית: תומך בהחלטות קידום על ידי קישור התערבויות מבוססות מטבוליטים לפנוטיפים התנהגותיים מדידים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
מבחן ה-EPM משתלב ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות מוקדמות ועד לזיהוי מועמדים מובילים (lead identification), ומספק פנוטיפיקה התנהגותית המשלים בדיקות ביוכימיות ואלקטרופיזיולוגיות בגילוי תרופות נוירופסיכיאטריות.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בהבהרה של מסלולים ביולוגיים על ידי בידוד תפקודי התנהגות הקשורים למעגלי חרדה, באופן בלתי תלוי מהשפעות מוטוריות מבלבלות.
- סריקה: מספקת פנוטיפים סטנדרטיים וניתנים לשחזור של חרדה, החיוניים לסריקה של ספריות תרכובות או התערבויות נוטריצאוטיות.
- אנליטיקה: מייצרת מדדי זמן-בזרוע ומרחק-נסיעה המאפשרים השוואה סטטיסטית בין קבוצות טיפול לקבוצות ביקורת.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין השלמה של מטבוליטים להתנהגות דמוית-חרדה, ובכך מספקת בסיס לתיקוף פרה-קליני המותאם לסמנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה התנהגותית לשימוש חוזר להערכת מועמדים אנקסיוליטיים מגוונים במודלים מטבוליים, פרמקולוגיים וגנטיים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מספק ביטחון חיזואי במעורבות המטרה על ידי הפחתת עמימות מכניסטית בהתנהגות הקשורה לחרדה.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה, שחזוריות ויכולת הרחבה באמצעות מעקב וידאו עיוור והקמה עקבית של המכשיר.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות המשך/עצירה (go/no-go) על ידי זיהוי השפעות אנקסיוליטיות אמיתיות תוך מזעור תוצאות חיוביות שגויות הנובעות משינויים לוקומוטוריים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכונים של תרכובות מבוססות קטונים או תרכובות פעילות במערכת העצבים המרכזית (CNS) על בסיס תוצרי התנהגות מתוקפים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול במכרסמים, בבדיקות התנהגותיות ובתפעול תוכנות למעקב וידאו.
- תלוי במערך EPM, במערכת מעקב תואמת USB ובתנאי תאורה מבוקרים.
- מחייב סטנדרטיזציה חוצת-צוותים של תהליכי אקלמיזציה של בעלי החיים, מינונים ונהלי איסוף נתונים עיוורים.
- חייב להתחשב ברמות חרדה בסיסיות התלויות במין ובזן בעת התאמה למודלים שונים של מכרסמים.
- מוגבל למדידת התנהגות דמוית-חרדה; אינו מעריך משתנים מתערבים קוגניטיביים, מוטוריים או רגשיים ללא בדיקות משלימות.
