Name: עיכוב חלבונים inducible והפיך דומיננטי שלילי (DN) (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: למדו שיטה להפעלה מותנית וחולפת של חלבונים באמצעות עיכוב דומיננטי שלילי הניתן להפיכה. הפרוטוקול מדגים שימוש בתאי NIH3T3 וביטוי חלבון RB לחקר תפקודי חלבונים ביולוגיה תאית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

PCS2 + CB-Myc6 וקטור הייתה מתנת הורביץ מרשל (אוניברסיטת וושינגטון, סיאטל, וושינגטון, ארה ב). התאים היי-OC1 נמסרו באדיבות בידי Fedrico Kalinec (גפן דוד בית ספר לרפואה, אוניברסיטת קליפורניה, לוס אנג'לס, קליפורניה, ארה). תמיכה טכנית סופק על ידי UNMC העכבר הגנום הנדסה הליבה (Gurumurthy רדיו אזרחי, דון פוגע, רולן הקואדרוס) והמתקן קרייטון אוניברסיטת משולב ביו הדמיה (ריצ'רד Hallworth, ג'ון Billheimer). הנדסה הגנום העכבר UNMC נתמכה על ידי פרס פיתוח מוסדיים (מושג) מ- NIH/NIGMS, להעניק מספר P20 GM103471. מתקן משולב הדמיה ביו נתמכה על ידי בית הספר אוניברסיטת קרייטון של רפואה ומענקים GM103427 ו- GM110768 מ NIH/NIGMS. המתקן נבנה עם תמיכה של מענקים של המרכז הארצי עבור משאבים למחקר (RR016469), את NIGMS (GM103427). הקווים עכבר הנוצר במחקר זה היו נשמרים במתקן משאבים בעלי חיים של אוניברסיטת קרייטון, תשתית אשר היה משופר באמצעות מענק על ידי NIH/NCRR G20RR024001. עבודה זו קיבלה בעבר תמיכה באמצעות של NIH/NCRR 5P20RR018788-/ NIH/NIGMS 8P20GM103471 COBRE להעניק (סמית ' ד שלי) NIH/orip ב R21OD019745-01A1 (S.M.R.-ס), של המתעוררים המחקר מענק של הקרן לבריאות שמיעה (ס' טרנג). התוכן של המחקר הזה הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את הנופים הרשמי של מכוני הבריאות הלאומיים.

דור של העכבר CBRb הטרנסגניים כל טיפול בבעלי חיים ואת ניסויים הקשורים המחקר היו אושרה על ידי קרייטון אוניברסיטת מוסדיים חיה טיפול שימוש הוועדה (IACUC), המבוצעת על ידי הנחיות שלהם.
1. הטרנסגניים CB-Myc6-Rb1 לבנות
הערה: השיבוט של CBRb לתוך וקטור pTet_Splice נעשה תהליך רב שלבי (איור 1A ו 1B).
<ol><li>
לבצע השיבוט בשלב הראשון לתוך pCS2 + וקטור CB-Myc6.
	<ol>
<li>כדי ליצור CBRb transgene הבונה, להגביר את קטע cDNA Rb1 1583-bp-ארוך (528 החומצות המתאים לאזור חומצת אמינו 369-896) של החלבון RB1 באמצעות פריימר הבאים את הגדר: לשימוש EcoRI +RB 1243F, GGGGAATTCA TTAAATTCAGCAAGTGATCAACCTTC, XbaI + EcoRV +RB 2826R, להשתמש CCCTCTAGATATCTATTTGGACTCTCCTGGGAGATGTTTACTTCC.</li>
		<li>שיבוט השבר שנוצר (1546 bp) בין האתרים הגבלה EcoR1 , XbaI pCS2 + וקטור CB-Myc6 כמו שתואר לעיל1,12. הערה: הבונה CB-Myc6 1012-bp-ארוך (חומצות אמינו 337) התמזגו למקטע Rb1 גרם חלבון של חומצות אמינו כ 865 (kDa כ 108), אשר הוא מעט קטן יותר החלבון RB1 אנדוגני (~ 110 kDa) (איור 1 ), עם תג6 CB-Myc אמיני, Rb1 ב קצה קרבוקסילי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
לבצע את subcloning בשלב השני לתוך הווקטור אחוי pTet.
	<ol>
<li>כדי להגביר את השבר פיוז'ן CB-RB-Myc6 וכדי לקבל ט-יזם, להגביר את הקלטת, המורכב CB-myc6-Rb1 באמצעות תחל המכיל את EcoRV (XbaI + EcoRV + 2826R רובידיום) ואתרים סאלי : עבור סאלי + FCB, השתמש CCAGTCGACAGGATGTGGTGGTCCTTGATCCTTC.</li>
		<li>Subclone השבר שנוצר (2567 bp) לתוך וקטור pTet-Splice, בין האתרים הגבלת סאלי , EcoRV , כזה שיאפשר את transgene TetO-DN-CB-myc6-Rb1 כולו, כולל את אינטרון SV40 תיקים עשויים לסמן, יכול להיות מבודד דרך מערכת העיכול יחיד עם NotI (איור 1B). הערה: השבר NotI שימש ליצירת התורמים שחיים מהונדס.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. בבדיקת חוץ גופית של Transgene TetO-DN-CB-myc6-Rb1
<ol><li>
Dox-רגולציה: NIH3T3 תא קו הערה: אלא אם נכתב אחרת, כל אמצעי האחסון הותאמו לצלחת 6-. טוב.<ol>
<li>לגדול בעקבות המפרטים של הספק, באמצעות התקשורת תרבות מומלצים התא המכיל 10% סרום שור העובר ב 37 ° C עם 10% CO2תאים NIH3T3.</li>
		<li>Cotransfect התאים עם pTet-Splice, וקטורים pCMV-Tet3G (משלב 1) עבור 24h. בצע את השלבים המוזכרים להלן עבור cotransfection.<ol>
<li>מערבבים 2 – 4 µL של ריאגנט/הבאר השומנים מבוסס תקנים של 1 מ"ל של Dulbecco שלם (ללא סרום) ששינה נשר בינוני (DMEM) עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. לצלחת 12 או 24-ובכן, להשתמש µL 250 או 500 של תרבות התקשורת, בהתאמה, לכוונן את עוצמת ריאגנט תקנים בהתאם.</li>
			<li>להוסיף 2-3 µg של פלסמיד DNA/טוב ריאגנט-DMEM תרביות תאים, תקופת דגירה של 20 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
			<li>להוסיף את תערובת המכילה DNA ו הכימית תרביות תאים ב- DMEM כדי מכל קידוח. לאחר 3 – 4 h של דגירה, להוסיף 1 מ"ל של התקשורת מלאה (כך שאמצעי האחסון סופי 2 מ ל/טוב). לשמור על aliquots של מניות Dox (1 מ"ג/מ"ל) ולהוסיף 2 µL בכל אחד וולס (+ Dox). דגירה התאים ב 37 ° C עם 5% CO2. הערה: דגימות הבקרה צריכה להכיל תאים cotransfected אינו מטופל באמצעות Dox (-Dox), כמו גם תאים NIH3T3 transfected רק עם וקטור pCMV-Tet3G transactivator ו שטופלו Dox למשך 24 שעות. עבור pCMV-Tet3G, ריכוזים של 0.1 – 1 µg/mL Dox צריך להיות מספיק כדי לגרום את הביטוי transgene.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
מבחן של הפיכות של הבונה באמצעות שורת תאים HEK293.
	<ol>
<li>לבדוק את הפיכות של transgene TetO-DN-CB-myc6-Rb1 , תרבות HEK293 תאים במינימום חיוני בינוני (EMEM הנשר) בעקבות המפרטים של הספק, cotransfect עם וקטורים אחוי pTet והן pCMV-Tet3G במשך 24 שעות ביממה, כפי שמתואר מעל (שלב 2.1.2).</li>
		<li>איון transgene, להסיר את התקשורת המכילות Dox לאחר 24 שעות, לשטוף את התאים 2 x x-3 בתמיסת פוספט buffered (PBS), דגירה אותם בתקשורת ללא Dox עבור h 24 נוספים. הערה: על Dox-הסרת, איון transgene וביטוי חלבונים רגיל צריך להתחדש במהלך התקופה הזו 24 שעות ביממה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
כדי להעריך את הפונקציונליות של הבונה TetO-DN-CB-myc6-Rb1 בקידום התפשטות תאים לא מתוכננת, לבצע את ניתוח פונקציונלי באמצעות קו תא היי-OC1, כמתואר להלן.
	<ol>
<li>התרבות התאים היי-OC1 ב- 10% DMEM תחת מתירניות תנאים (33 ° C עם 10% CO2). ללימודים התפשטות תאים, לספור את התאים באמצעות מונה תא ותאים היי-OC1 צלחת 10,000 על צלחת 96-ובכן באמצעי אחסון 200 µL. דגירה התאים בן לילה.</li>
		<li>למחרת, לבצע cotransfection ארעי של וקטורים אחוי pTet ו- pCMV-Tet3G באמצעות ריאגנט השומנים מבוססי תקנים (ראה שלבים 2.1.2). בבאר נפרדים, לבצע at2 תרביות תאים pmR-ZsGreen1-µg באמצעות תקנים מבוססי השומנים הכימית (שלבים 2.1.2) כדי לחשב את שיעור תרביות תאים. השתמש תאים שאינם transfected כפקדים.</li>
		<li>לזהות הנוכחות של זריחה ירוק תחת מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית (עירור = 485 ננומטר, פליטה = 530 ננומטר) עבור transfected תאים 24 שעות לאחר תרביות תאים. להקליט את נוכחות או היעדרות של זריחה ירוק, לחשב את הקצב של תרביות תאים המספר הכולל של תאים GFP-חיוביות (transfected תאים) על פני התאים המסומנת דאפי (כולל תאי). הערה: אנחנו מעריכים שיעור תרביות תאים של ~ 70%.</li>
		<li>כדי לעודד ביטוי transgene, להוסיף 1 µg/mL Dox transfected בתאים תוך שימוש המשנה השני כפקד (-Dox). להשתמש ללא טיפול תאי היי-OC1 פקדים נוספים.</li>
		<li>כדי להעריך את התפשטות תאים, השתמש ערכת התפשטות תאים על פי הפרוטוקול של היצרן.<ol>
<li>בקצרה, 48 שעות לאחר תרביות תאים, להסיר את המדיום תרבות תא ולהוסיף µL 100 1 x צבע מחייב פתרון כל טוב של microplate. תקופת דגירה של h 1-37 מעלות צלזיוס.</li>
			<li>לאחר מכן, למדוד את עוצמת קרינה פלואורסצנטית כל דגימה באמצעות קורא microplate קרינה פלואורסצנטית (עירור = 485 ננומטר, פליטה = 530 ננומטר).</li>
		</ol>
</li>
		<li>עוד יותר להעריך את התפשטות תאים באמצעות immunocytochemistry, צלחת התאים היי-OC1 על זכוכית מכסה בצלחת 12-ובכן, דגירה בין לילה ב 37 º C.<ol>
<li>למחרת, cotransfect עם pTet-Splice, pCMV-Tet3G ולבצע את הטיפול Dox (+ Dox). להשתמש בתאים untransfected כפקדים. תהליך היי-OC1 תאים עבור תיוג Ki-67.</li>
			<li>לתקן את התאים עם 4% paraformaldehyde (PFA) ב- PBS, pH 7.4, 10 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את התאים 3 x עם PBS קר כקרח דגירה התאים דטרגנט ללא יונית 0.25% ב- PBS למשך 10 דקות.</li>
			<li>לשטוף את התאים שוב, 3 x ב- PBS 5 דקות, לחסום שימוש בסרום 10% בתוך תא humidified לשעה בטמפרטורת החדר.</li>
			<li>דגירה התאים µL 500 של נוגדן ראשוני Ki-67 (דילול 1:200) עבור 3 שעות בטמפרטורת החדר או למשך הלילה ב 4 º C.</li>
			<li>לשטוף את התאים 3 x עבור חמש דקות עם PBS. לאחר מכן, דגירה התאים עם הנוגדן משני לשעה בטמפרטורת החדר בחושך.</li>
			<li>להסיר את הפתרון נוגדנים משניים. ולשטוף את התאים 3 x עם PBS למשך 5 דקות כל בחושך.</li>
			<li>Phalloidin סימון, דגירה היי-OC1 בתאים 1:200 phalloidin למשך 30 דקות. להוספת תווית את הגרעינים של תאים, דגירה התאים עם 5 µg/mL דאפי 10 דקות בטמפרטורת החדר. הערה: ודא המספר המשלים לצבוע phalloidin שונה מאשר המספר המשלים נוגדנים משניים.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. הדור של CBRb+/ROSA-CAG-rtTA+ (CBRb) העכברים הטרנסגניים ו Vivo בדיקות של הגישה DN-CBRb
<ol><li>על אישור של ויסות Dox יעיל transgene TetO-DN-CB-myc6-Rb1 , לטהר את מקטע NotI, microinject אותם לתוך עכבר מופרות, אשר מועברים מאוחר יותר לתוך נקבות בהריון מדומים. הערה: הליכים אלה בוצעו במתקן של אוניברסיטת נברסקה רפואי במרכז (UNMC) העכבר הגנום הנדסה הליבה.</li>
	<li>לאחר הלידה, גנוטיפ הגורים באמצעות פריימר להגדיר ספציפית לאזור פיוז'ן CB-Rb1 : עבור CBRb F, השתמש CTGTGGCATTGAATCAGAAATTGTGGCTGG 3′ 5', והשתמש עבור CBRB R, 3′ GTACTTCTGCTATATGTGGCCATTACAACC יונקות. הערה: גודל מוצר ה-PCR מובחנים agarose ג'ל הוא 401 bp (אזור CB 60-bp + 341-bp Rb1 באזור (טבלה 1). עשר שורות מייסד עצמאית אותרו, המבוסס על הנוכחות של transgene TetO-DN-CB-myc6-Rb1 . בחמש שורות אלה, רומא ירש את transgene, אשר אישר העברת germline transgene. אחת השורות הטרנסגניים שימש בסופו של דבר כדי ליצור, לשמור על הקו ולהפיק חיות ניסוי TetO-DN-CB-myc6-Rb1 ללימודי.</li>
	<li>גזע בוגרים עכברים TetO-DN-CB-myc6-Rb1 אל קו משרן טטרציקלין רוזה-חטיבתי-rtTA (מניות #006965) (לחלופין, גזע לקו משרן tTA) ליצירת עכברים DN-CBRb ניסיוני. גנוטיפ הצאצאים של זה צלב שימוש בערכת תחל הבאה: לשימוש rtTA-WT R, GGAGCGGGAGAAATGGATATG; לשימוש rtTA מוטציה R, GCGAGGAGTTTGTCCTCAACC; עבור rtTA משותף, להשתמש AAAGTCGCTCTGAGTTGTTAT. גודל מוצר ה-PCR הם 340 bp (מוטציה), 340 bp ו- 650 bp (heterozygote), 650 bp (פראי-סוג).</li>
	<li>יוצרות עקומת מנה-תגובה של החלבון RB1 בעקבות הטיפול Dox כדי לקבוע את הזמן ואת משך הטיפול Dox צורך להפיק ביטוי transgene. הערה: בניסוי זה, תספיג לרביעיית-PCR שימשו כדי להעריך רקמות ספציפיות transgene ההפעלה וביטוי RB1.</li>
	<li>לבצע פלורסצנטיות בחיי עיר הכלאה (דגים) כדי לאשר את הכניסה גנומית של transgene. הערה: זה בוצע במרכז על החלת גנומיקה של בית החולים לילדים חולים (טורונטו, קנדה). אליסה או המערבי סופג (באמצעות נוגדן ספציפי חלבון) יכול לשמש כדי להעריך transgene ההפעלה, רקמות-ירידה לפרטים ושינויים ברמות של הנקו אנדוגני. עבור הבונה DN-CB-myc6-Rb1 , השתמשנו נוגדן anti-RB1.</li>
</ol>

<ol><li>Li, F. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+MyoD+homodimer+formation+demonstrated+by+a+general+method+of+dominant+negative+mutation+employing+fusion+with+a+lysosomal+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Preferential MyoD homodimer formation demonstrated by a general method of dominant negative mutation employing fusion with a lysosomal protease.</a> Journal of Cell Biology. 135 (4), 1043-1057 (1996).</li>
<li>Tarang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+retinoblastoma+%28rb%291-inducible+dominant-negative+%28DN%29+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Generation of a retinoblastoma (rb)1-inducible dominant-negative (DN) mouse model.</a> Frontiers Cellular Neuroscience. 9 (52), (2015).</li>
<li>Kominami, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+selective+role+of+cathepsins+B+and+D+in+the+lysosomal+degradation+of+endogenous+and+exogenous+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">The selective role of cathepsins B and D in the lysosomal degradation of endogenous and exogenous proteins.</a> FEBS Letters. 287 (1-2), 189-192 (1991).</li>
<li>Cortellino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+ciliogenesis%2C+embryonic+lethality+and+severe+impairment+of+the+sonic+hedgehog+pathway+caused+by+inactivation+of+the+mouse+complex+A+intraflagellar+transport+gene+Ift122%2FWdr10%2C+partially+overlapping+with+the+DNA+repair+gene+Med1%2FMbd4%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Defective ciliogenesis, embryonic lethality and severe impairment of the sonic hedgehog pathway caused by inactivation of the mouse complex A intraflagellar transport gene Ift122/Wdr10, partially overlapping with the DNA repair gene Med1/Mbd4.</a> Developmental Biology. 325 (1), 225-237 (2009).</li>
<li>Ferreira, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+embryonic+lethality+of+H+ferritin+gene+deletion+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Early embryonic lethality of H ferritin gene deletion in mice.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (5), 3021-3024 (2000).</li>
<li>Lee, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+deficient+for+rb+are+nonviable+and+show+defects+in+neurogenesis+and+haematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mice deficient for rb are nonviable and show defects in neurogenesis and haematopoiesis.</a> Nature. 359 (6393), 288-294 (1992).</li>
<li>Turlo, K. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20813881">When cre-mediated recombination in mice does not result in protein loss.</a> Genetics. 186 (3), 959-967 (2010).</li>
<li>Weber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+cell-cycle+reentry+and+cell+death+after+acute+inactivation+of+the+retinoblastoma+gene+product+in+postnatal+cochlear+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15190215">The first knockout mouse model of retinoblastoma.</a> Cell Cycle. 3 (7), 952-959 (2004).</li>
<li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletions+of+retinoblastoma+1+%28Rb1%29+and+its+repressing+target+S+phase+kinase-associated+protein+2+%28Skp2%29+are+synthetic+lethal+in+mouse+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Deletions of retinoblastoma 1 (Rb1) and its repressing target S phase kinase-associated protein 2 (Skp2) are synthetic lethal in mouse embryogenesis.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (19), 10201-10209 (2016).</li>
<li>Yamasaki, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+E2F-1+reduces+tumorigenesis+and+extends+the+lifespan+of+Rb1%28%2B%2F-%29+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Loss of E2F-1 reduces tumorigenesis and extends the lifespan of Rb1(+/-) mice.</a> Nature Genetics. 18 (4), 360-364 (1998).</li>
<li>Li, F. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+a+dominant+negative+retinoblastoma+protein+%28RB%29+inhibiting+satellite+myoblast+differentiation+implies+an+indirect+interaction+between+MyoD+and+RB%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Selection of a dominant negative retinoblastoma protein (RB) inhibiting satellite myoblast differentiation implies an indirect interaction between MyoD and RB.</a> Molecular and Cellular Biology. 20 (14), 5129-5139 (2000).</li>
<li>Pitkanen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+human+retinoblastoma+gene+product+in+mouse+fibroblasts%3A+Effects+on+cell+proliferation+and+susceptibility+to+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Expression of the human retinoblastoma gene product in mouse fibroblasts: Effects on cell proliferation and susceptibility to transformation.</a> Experimental Cell Research. 207 (1), 99-106 (1993).</li>
<li>Chano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromuscular+abundance+of+RB1CC1+contributes+to+the+non-proliferating+enlarged+cell+phenotype+through+both+RB1+maintenance+and+TSC1+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Neuromuscular abundance of RB1CC1 contributes to the non-proliferating enlarged cell phenotype through both RB1 maintenance and TSC1 degradation.</a> International Journal of Molecular Medicine. 18 (3), 425-432 (2006).</li>
<li>Kole, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+therapeutics%3A+Beyond+RNA+interference+and+antisense+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">RNA therapeutics: Beyond RNA interference and antisense oligonucleotides.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 11 (2), 125-140 (2012).</li>
<li>Yamamoto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ons+and+offs+of+inducible+transgenic+technology%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">The ons and offs of inducible transgenic technology: A review.</a> Neurobiology of Disease. 8 (6), 923-932 (2001).</li>
<li>Houdebine, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+animal+models+in+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transgenic animal models in biomedical research.</a> Methods in Molecular Biology. 360, 163-202 (2007).</li>
<li>Brehm, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoblastoma+protein+recruits+histone+deacetylase+to+repress+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Retinoblastoma protein recruits histone deacetylase to repress transcription.</a> Nature. 391 (6667), 597-601 (1998).</li>
<li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E2F-HDAC+complexes+negatively+regulate+the+tumor+suppressor+gene+ARHI+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">E2F-HDAC complexes negatively regulate the tumor suppressor gene ARHI in breast cancer.</a> Oncogene. 25 (2), 230-239 (2006).</li>
<li>Magnaghi-Jaulin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoblastoma+protein+represses+transcription+by+recruiting+a+histone+deacetylase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Retinoblastoma protein represses transcription by recruiting a histone deacetylase.</a> Nature. 391 (6667), 601-605 (1998).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

כדי לעקוף את המגבלות המשויך אסטרטגיות הטרנסגניים מסורתיים, חיפשנו לייצר דגם העכבר שבו פוי אנדוגני יכולה להיות מותנית מומת על ידי overexpressing צורה מוטציה DN של זה בצורה ייתכן. כדי לבטל את הפונקציה של POIs אנדוגני, היו מספר אפשרויות המוצע15,16,17. יש לשנות אסטרטגיה גנטי קודמת של1 על-ידי שילוב Dox תלוית תעתיק למערכת אסטרטגיה פשוטה העסקת פיוז'ן של מגלן פרוטאז lysosomal כדי ליצור פפטיד מוטציה ביטוי אשר משפי...

רוב הגישות מכוון ablations גנים וחלבונים להסתמך על תהליכים קבועים, אשר בדרך כלל להוביל חיסול מוחלט או חיתוך של ג'ין, רצפי RNA או החלבון עניין (פוי). המטרה הכוללת של שיטה זו הוא מהנדס חלבון רקומביננטי לבטל את הפונקציה של אנדוגני, פראי-סוג חלבון. יש וביקרה ואנו בנגיעות של אסטרטגיה אלטרנטיבית1,2, מה שמאפשר עבור אבלציה זמני של נקודת משחק לחץ באמצעות עיכוב DN. שיטה זו פועלת multimeric וגם פפטידים monomeric אך היא המתאימה ביותר עבור חלבונים שפועלים בהרכבה multimeric.
השיטה מורכבת פיוזינג lysosomal פרוטאז CB יחידת משנה של multimeric פוי (CB פיוז'ן מורכבים). פיוז'ן CB תוצאות מורכבות יכול לקיים אינטראקציה עם proteolytically לעכל החלבון אנדוגני או להסיט את המתחם כולו CB-פוי ליזוזום להיות מפורק3. יתר על כן, שילוב של פיוז'ן CB מורכבים עם הטבע inducible של מערכת ההפעלה תעתיק שבשליטת טטרציקלין (TetO) מאפשר ביטוי inducible ומבוקר transgene ב אופנה הפיך2. למרות שימושי בנסיבות רבות, מחיקה מלאה של גנים או חלבונים ויוו יכול לגרום קטלני4,5,6. באופן דומה, מחיקה רקמות ספציפיות, מותנה של כמה גנים או חלבונים באמצעות מערכת Cre/סלומון לא יכול להיות ישירה, כמו, בסופו של דבר, תוביל לאובדן תמידי של אלמנטים קריטיים גנומית7. לפיכך, בהתאם ג'ין או פוי, וגם יהיה יעיל במתן מודל שימושי עבור מחקרים מאוחרים יותר, במיוחד של הגנים או של חלבונים פונקציונליים מחקרים בעכברים כמחנכת ומבוגרים מאוחר.
כדי לעקוף בעיות הקשורות גישות כאלה לספק הוכחה של עקרון על היעילות של השיטה המוצעת, בחרנו לבחון את השיטה המובאת כאן על ידי יצירת גירסה DN מותנה של החלבון 1 רטינובלסטומה (RB1). מספר אפשרויות להיות המוצע8,9,10 לבטל את הפונקציה של אנדוגני RB1; עם זאת, כולן בפני חלק מהמגבלות באותו שנדונו לעיל: germline קבוע מחיקה של RB1 embryonically קטלני, והוא, בקנה אחד עם תפקידו משתיק קול הגידול, קבע RB1 מחיקה מותנה שמוביל מגוון רחב של גידולים11. אף-על-פי גירסת DN RB1 לא נראה להתרחש באופן טבעי, חלופה טובה יותר האסטרטגיות הזמינות כעת צריך לאפשר איון חנותם מבוקרת של RB1 אנדוגני ולספק מנגנון חלופי לשחזור בסופו של דבר שלה פונקציה. בסיס כזה מבנה תוארה לפני למעלה משני עשורים1. עם זאת, בשל מגבלות טכנולוגיות, זה חסרה מנגנון הבקרה transgene ההפעלה, התגובה של רקמות ירידה לפרטים. מחקר זה הוא הראשון כדי לשלב את האלגנטיות דוקסילין (Dox)-תלוי תעתיק המערכת עם הבונה מהונדס מהונדס של חלבונים CB, Rb1 פרוטאז lysosomal. המודל העכבר CBRb המתקבל מאפשר RB1 בתיווך Dox מוסדר באופן זמני תקנה2. היתרון של שימוש כזה מבוסס פרוטאום בגישה ללמוד ג'ין פונקציה היא כי זה יכול להיות מאומץ עבור ג'ין בכל עניין, עם מידע מינימלי על פעילותה.
האסטרטגיה המוצעת DN transgene מציע יתרונות רבים על פני הגישות המסורתיות. ראשית, עיכוב חלבונים DN מוביל רק אבלציה חלקית בפעילות חלבון, וכך לשמר ביטוי אנדוגני שיורית. כזו כ"בלתי רצוי מאוד במצבים איפה חיסול מוחלט של פעילות החלבון מוביל lethality עובריים, במידה רבה להגביל חקירה כלשהי ללמוד ג'ין פונקציית עכבר חי. שנית, הנוכחות של מערכת TetO מאפשרת הפעלת transgene רק בנוכחות אנטיביוטיקה, מה שמאפשר עבור פקד יעיל של הפיכה של הפעילות transgene. לפיכך, על ידי חדל המינהל לאנטיביוטיקה, ניתן לבטל את הפעלתם את המערכת הטרנסגניים, ביטוי RB1 נורמלי הוא למקום. שלישית, יחודיות של הביטוי transgene יכול להשתנות בהתאם האמרגן של הבחירה. בעוד שבחרנו את המקדם רוזה-חטיבתי בכל מקום על הוכחה של עקרון, הצבת את transgene תחת מקדם רקמות ספציפיות סביר להגביל את הביטוי transgene לא רצויים וכדי להקל על מחקרים על היישום טיפולית של transgene הזה מתודולוגיה.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium's Medium, DMEM</td><td>GIBCO-BRL</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium Eagle, MEME&nbsp;</td><td>סיגמא&nbsp;</td><td>M8042</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>סיגמא&nbsp;</td><td>F2442&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ליפופקטמין&nbsp;</td><td>DharmaFECT</td><td>T-2010-03</td><td></td></tr><tr><td>Sal I</td><td>Roche</td><td>11745622</td><td></td></tr><tr><td>EcoRV-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3195S</td><td></td></tr><tr><td>NotI</td><td>Roche</td><td>13090730</td><td></td></tr><tr><td>CaspaTag&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>APT523</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>סיגמא&nbsp;</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>סטאורוספורין</td><td>סיגמה&nbsp;</td>ערכת התפשטות תאי <td>NF S4400</td><td></td></tr><tr><td>CyQuant&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>C35007</td><td></td></tr><tr><td>רטינובלסטומה 1 נוגדן</td><td>Abcam</td><td>Ab6075</td><td></td></tr><tr><td>c-Myc נוגדן</td><td>סיגמא&nbsp;</td><td>M5546</td><td></td></tr><tr><td>ב-אקטין</td><td>סיגמא&nbsp;</td><td>A5316</td><td></td></tr><tr><td>Ki-67&nbsp;</td><td>Thermofisher scientific</td><td>MA5-14520</td><td></td></tr><tr><td>Phallodin</td><td>Thermofisher scientific</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>קורא מיקרופלואורסצנטי</td><td>FLUOstar OPTIMA, BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי&nbsp;</td><td>NikonEclipse80i</td><td></td><td></td></tr><tr><td>קו העכברים TetO-DN-CB-myc6-Rb1 (DN-CBRb) זמין במעבדת ג'קסון בשם JAX#032011.&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

עיכוב חלבונים inducible והפיך דומיננטי שלילי (dn)

Inducible and Reversible Dominant-negative (DN) Protein Inhibition

דומיננטה-שלילי (DN) חלבון עיכוב היא שיטה חזקה לתמרן החלבון פונקציה, ומציע מספר יתרונות על גישות אחרות מבוסס גנום. לדוגמה, למרות chimeric ו- Cre-LoxP אסטרטגיות מיקוד היה בשימוש נרחב, המגבלות מהותי של אסטרטגיות אלו (קרי, פעילות קדם דולפים, ביטוי Cre פסיפס, וכו ') שיש באופן משמעותי מוגבלת שלהם יישום. יתר על כן, מחיקה מלאה של גנים רבים אנדוגני הוא embryonically קטלני, ואי אפשר ללמוד פונקציה ג'ין בחיים לאחר הלידה. לטפל באתגרים אלה, יש שינויים משמעותיים כדי פרוטוקול הנדסה גנטית מוקדמת ואנו בשילוב גרסה מקוצרת (הטרנסגניים) של הגן Rb1 פרוטאז lysosomal procathepsin B (CB), כדי ליצור מודל העכבר DN של Rb1 (CBRb). בשל נוכחותם של פרוטאז lysosomal, החלבון פיוז'ן CB-RB1 שלם ומורכב שמעצבת שלה מנותבות עבור בתיווך פרוטאוזום השפלה. יתר על כן, הנוכחות של יסוד משרן (rtTA) טטרציקלין הבונה הטרנסגניים מאפשר ויסות inducible והפיך החלבון RB1. הנוכחות של מקדם רוזה-חטיבתי בכל מקום במודל עכבר CBRb הופכת כלי שימושי כדי לבצע אבלציה ג'ין Rb1 ארעי והפיך ולספק חוקרים משאב להבנת פעילות שלה כמעט בכל סוג תא איפה בא לידי ביטוי RB1.

באופן כללי, עיצוב מוטציה DN דורש כמות ניכרת של מידע על המבנה והתפקוד של הנקו. לעומת זאת, האסטרטגיה DN המוצג כאן הוא שימושי במיוחד בעת המידע המבני ופונקציונלי עבור הנקו מוגבל. אם הנקו חלבון multimeric, פיוז'ן של יחידת משנה אחת כדי פרוטאז lysosomal דומיננטית יכול לעכב את multimer שהורכבו ו, באופן פוטנציאלי, אחר ליגנדים באמצעות שילוב של proteolysis של subunits אנדוגני הטיית subcellular multimer ל ליזוזום. כדי לאשר שיבוט מוצלח ולבדוק את האפקטיביות של transgene מוסדר Dox ההפעלה, מטוהרים pTet-S...

כאן אנו מציגים פרוטוקול לפתח מערכת inducible דומיננטה-שלילי, שבו כל חלבון יכול להיות מותנה מומת על ידי הפיכה overexpressing גרסה מוטציה דומיננטית-שלילי של זה.

עיכוב חלבונים inducible והפיך דומיננטי שלילי (DN)

Dominant-negative (DN) protein inhibition is a powerful method to manipulate protein function and offers several advantages over other genome-based ...

שיטה זו יכולה לסייע לענות על שאלות מפתח במגוון רחב של תחומים הדורשים אי-הפעלה מותנית וחולפת של גן מעניין על-ידי הבעת יתר של גרסה שלילית דומיננטית שלו. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת רק אבלציה חלקית בפעילות החלבון, ובכך, שמירה על ביטוי אנדוגני שיורית. אמנם, כאן אנו מתארים את חוסר ההפעלה של חלבון RB, אשר פועל בהרכבה רב-מרתית, מתודולוגיה זו יכולה להיות מיושמת גם חלבונים מונומריים.אומש פייקורל, טכנאי המעבדה שלנו וממחברי שותף בכתב היד ידגימו את הנהלים. כדי להתחיל, לגדל תאי NIH3T3, בעקבות מפרטי הספק, ב 37 מעלות צלזיוס עם 5%CO2, באמצעות מדיום תרבות התא המומלץ המכיל 10% סרום חזיר עוברי. כדי להדביק את התאים באמצעות pTet-Splice ו- pCMV-Tet3G וקטורים, תחילה לערבב שניים עד ארבעה microliters של רייגנט transfection מבוססי השומנים לגם, ומיליליטר אחד של DMEM שלם לגם בצינור 15 מיליליטר, ודגירה במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.הוסף שניים עד שלושה מיקרוגרם של דנ"א פלזמה לגם לתערובת DMEM של ריין transfection זה. מערבבים ו מודגרים במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. הוסף מיליליטר אחד של התערובת המכילה DNA ואת reagent transfection ב DMEM לכל באר של צלחת שש באר עם תאי NIH3T3.לאחר שלוש עד ארבע שעות של דגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5%CO2, להוסיף מיליליטר אחד של מדיום שלם. לאחר מכן, להוסיף 2 microliters של מלאי דוקסיציקלין לכל באר ולסמן את הצלחת כמו פלוס דוקסיציקלין. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.כדי להעריך את הפונקציונליות של מבנה TetO-DN-CB-myc6-Rb1 בקידום התפשטות תאים לא מתוכננת, תאי HEI-OC1 תרבותיים ב- DMEM המכילים 10%FBS, בתנאים מתירניים. עבור מחקרים על התפשטות תאים, ספור את תאי HEI-OC1 באמצעות מונה תאים. לוח 10, 000 תאי HEI-OC1 ל באר על צלחת 96 באר ב 200 microliters של נפח כל אחד.דגירה התאים במהלך הלילה ב 33 מעלות צלזיוס עם 5% CO2. כדי לגרום לביטוי טרנסג'נדר, הוסף מיקרוגרם אחד למיליליטר של דוקסיציקלין לתת-קבוצה של תאי HEI-OC1 מנוקד. השתמש בקבוצה המשנית האחרת המסווה כ- minus-doxycycline ותאי HEI-OC1 שאינם מנוקד כפקדים, והדרגר את התאים כ- 33 מעלות צלזיוס עם 10%CO2.כדי להעריך את התפשטות התאים, 48 שעות לאחר ההטמקה, הסר את מדיום תרבות התאים והוסף 100 מיקרוליטרים של פתרון כריכת צבע 1x מערכת התפשטות תאים לכל באר של המיקרו-צלחת. בצע את פרוטוקול היצרן ואת הדגירה במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס. השתמש בקורא מיקרופלסטיק פלואורסצנטי כדי למדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות של כל מדגם.כדי להעריך עוד יותר את התפשטות התא באמצעות אימונוציטוכימיה, צלחת תאי HEI-OC1 על זכוכית כיסוי להציב בכל באר של צלחת 12 באר ב DMEM. דגירה התאים לילה ב 33 מעלות צלזיוס. ביום שלמחרת, cotransfect לתאים בשתי בארות עם pTet-Splice ואת וקטורים pCMV-Tet3G, ולאחר מכן לבצע את הטיפול דוקסיציקלין על אחד גם נעשה עם תאי NIH3T3.השתמש אחד לא מושלם גם כמו פקד. כדי לעבד את התאים לתיוג Ki-67, תקן אותם עם 4%paraformaldehyde ב- PBS במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לשטוף אותם שלוש פעמים עם PBS קר כקרח במשך חמש דקות כל אחד.הוסיפו 0.25% חומר ניקוי לא יוני ב-PBS, והדקירה במשך 10 דקות. חזור על לשטוף שלוש פעמים PBS במשך חמש דקות כל אחד. השתמש בסרום 10%כדי לחסום את התאים.בתא לח למשך שעה בטמפרטורת החדר. מוסיפים 500 מיקרוליטרים של הנוגדן העיקרי של Ki-67 ו דגירה לילה בארבע מעלות צלזיוס. לשטוף את התאים שוב שלוש פעמים PBS במשך חמש דקות כל אחד.מוסיפים מיליליטר אחד של הנוגדן המשני ומדרגים את התאים במשך שעה בטמפרטורת החדר בחושך. לאחר הסרת פתרון הנוגדנים המשני, לשטוף את התאים שוב שלוש פעמים במשך חמש דקות PBS בחושך. כדי לתייג את תאי HEI-OC1 עם פאלודין, דגירה אותם 1:200 פאלודין במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.כדי לתייג את גרעיני התא, דגירה התאים עם חמישה מיקרוגרם למיליליטר של DAPI במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מסירת העכברים הטרנסג'נדרים, גנוטיפ הגורים באמצעות סט פריימר ספציפי לאזור ההיתוך CBRb1 כמתואר בכתב היד. לגדל בוגרים TetO-DN-CB-myc6-Rb1 עכברים כדי ROSA-CAG-rtTA ו tetrecycline inducer קו כדי ליצור עכברים ניסיוניים DN-CBRb, ו genotype צאצאיהם כמתואר בכתב היד.NIH3T3 אינו מבטא חלבון RB1 אנדוגני, כך ביטוי RB1 חזק לראות כאן נובע אינדוקציה מהומר בנוכחות דוק, אבל לא בהיעדרו, המאשר את ההפעלה היעילה של TetO-DN-CB-myc6-Rb1 לערבב RB1 לבנות. לעומת זאת, לתאי HEK293 יש ביטוי RB1 אנדוגני. התוספת של דוקסיציקלין הובילה להפעלת TetO-DN-CB-myc6-Rb1 ורגולציה למטה RB1.ביטוי RB1 חודש 21 שעות לאחר שהדוקסיציקלין הוסר מהמדיה. תאי HEI-OC1 המופקים באותם וקטורים, הציגו עלייה צנועה אך משמעותית במספר התאים בעקבות טיפול דוקסיציקלין בהשוואה לתאים מנוטרלים שאינם מטופלים ב דוקסיציקלין, והתאים הלא סלולים. פלואורסצנט בהכלאה סיטו אישר את החדרת הגנומי של TetO-DN-CB-myc6-RB1 מהמר בעכברים.הייתה עלייה ראשונית בביטוי החלבון הכולל של RB1 ב cochlea של העכברים המהוהרים שטופלו ב דוקסיציקלין במשך שלושה ימים בהשוואה לקבוצת הביקורת. עם זאת, בקבוצות שטופלו בדוקסוסיקלין במשך שבעה ו -10 ימים, נצפתה ירידה משמעותית בביטוי RB1. ללא קשר לרקמה שנותחה, ירידה משמעותית בחלבון RB1 נצפתה בעכברים מהודקים שטופלו בדוקסוסיקלין, אך לא בקבוצת הביקורת, המאשרת את יעילות המבנה TetO-DN-CB-myc6-RB1.בעת ניסיון לבצע הליך זה, חשוב לוודא שכל אחד מרכיבי הקידוד של הטרנסג'ין נמצאים במסגרת זה עם זה. אם אזורי הקידוד של Cathepsin B ו רטינובלסטומה המתוארים בדו"ח זה היו, במקרה, מחוברים מחוץ למסגרת, זה לא היה מניב את חלבון ההיתוך המיועד. לכן, אימות רצף DNA חייב להיעשות לפני הזרקת הטרנסג'ין לעוברים עכבר חד-תאיים.בעקבות הליך זה, מקדם CAG בכל מקום יכול להיות מוחלף עם מקדמים ספציפיים על מנת ללמוד תפקוד גנים באופן ספציפי של התא.

inducible-and-reversible-dominant-negative-dn-protein-inhibition

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

דרך מהירה ופשוטה ליצירת שורות תאים אנושיות עם מושרה וביטוי יתר הפיך cDNA או shRNA בתיווך עקום למטה של ​​הגן של עניין. שיטה זו מאפשרת לחוקרי שורות תאים ואמינים ביותר reproducibly מניפולציות שקשה לשנות בשיטות transfection חולפות או אסטרטגיות קונבנציונליות מציאה / נוקאאוט.

דור של שורות תאים אנושיות יציבות עם טטרציקלין-מושרה (ט ב) shRNA או ביטוי cDNA

השיטה המתוארת כאן משמשת לגרימת מפל האיתות האפופטוטי בשלבים מוגדרים על מנת לנתח את הפעילות של חלבון אפקטור חיידקי אנטי-אפופטוטי. שיטה זו יכולה לשמש גם לביטוי השראה של חלבונים פרו-אפופטוטיים או רעילים, או לניתוח הפרעות עם מסלולי איתות אחרים.

יישום מערכת ביטוי עין מתנהלת לחקר הפרעות של גורמים בקטריאלי ארסיות עם איתות תאיים

אנו מתארים כאן מערכת המשתמשת בבלוק חלבון in vivo ספציפי לאתר, הפיך כדי לעכב ולמוטט מזלגות שכפול ב-Escherichia coli. הקמת בלוק השכפול מוערכת על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי ואלקטרופורזה דו-ממדית של ג'ל אגרוז ניטרלי-ניטרלי משמשת להדמיית חומרי ביניים לשכפול.

התרמת סתימה שכפול לאתרים ספציפיים ב<i&gt; E. coli</i&gt; באמצעות מערכת מפעיל פלורסנט מדכא

פרוטוקול זה משמש ערכה עבור הגדרת מערכת תפקודית ט-על שורות תאים סרטן והשימוש עוקבות, בפרט ללמוד את התפקיד של גידול נגזר התא חלבונים בגיוס ומונוציטים/מקרופאגים כדי microenvironment הגידול.

נוקאאוט מותנה של ביטוי גנים בשורות תאים סרטן ללמוד הגיוס של Monocytes/מקרופאגים כדי Microenvironment הגידול

פרוטוקול זה מתאר את השלבים הדרושים כדי ליצור מערכת מודל שבו שעתוק של גנים אנדוגני עניין יכול להיות מותנה נשלט בעלי חיים או תאים באמצעות מדכא. שבולם משופרת lac ו/או מערכות activator ט .

In vivo היישום של מערכת שליטה מרחוק עבור הביטוי מניפולציה של ג'ין אנדוגני

לפלח epigenome DNA עריכה מייצג גישה טיפולית רב-עוצמה. פרוטוקול זה מתאר את הייצור, טיהור, הריכוז של ה-all-in-one וקטורים lentiviral מסתירים את transgene CRISPR-dCas9-DNMT3A עבור יישומים לעריכת epigenome בתא גזע pluripotent המושרה אנושי (hiPSC)-נגזר נוירונים.

וקטור lentiviral פלטפורמה למסירה יעיל של כלי עריכת Epigenome לתוך האדם המושרה מודלים המחלה נגזר תאי גזע Pluripotent

כאן, אנו מתארים כלי לעריכת גנום המבוסס על ייצוב זמני ומותנה של מקובצים באופן קבוע בין-חללים קצרים פלינדרומיים חוזרים- (CRISPR-) חלבון הקשורים 9 (Cas9) תחת המולקולה הקטנה, Shield-1. השיטה יכולה לשמש לתאים בתרבית ומודלים של בעלי חיים.

ערכת כלים חדשה להערכת פונקציות גנים באמצעות ייצוב מותנה של Cas9

האינטראקציה של שיפוץ כרומטין תלוי ATP עם ליגנד DNA מתוארת באמצעות ספקטרוסקופיה CD. ניתן להשתמש בשינויים הקונפורמציה המושרים על מקדם גנים שניתח על ידי הפסגות שנוצרו כדי להבין את מנגנון הרגולציה התמלולית.

ספקטרוסקופיה של תקליטור לחקר אינטראקציות בין DNA לחלבון

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבחירה חוץ גופית של מדכאי שעתוק מהונדסים (ETR) עם יעילות השתקה גבוהה, ארוכת טווח, יציבה, על המטרה ופעילות נמוכה מחוץ למטרה. תהליך עבודה זה מאפשר לצמצם רפרטואר ראשוני ומורכב של תעודות סל מועמדות לרשימה קצרה, המתאימה להערכה נוספת במסגרות רלוונטיות מבחינה טיפולית.

במבחנה בחירת מדכאי שעתוק מהונדסים להשתקה אפיגנטית ממוקדת

מחקר זה מתאר שיטות עבור T7 בתיווך ביטוי משותף של גנים מרובים מ פלסמיד בודד ב Escherichia coli באמצעות מערכת pMGX פלסמיד.

T7 RNA פולימראז בתיווך Multigene הביטוי מערכת, pMGX

למדו שיטה להפעלה מותנית וחולפת של חלבונים באמצעות עיכוב דומיננטי שלילי הניתן להפיכה. הפרוטוקול מדגים שימוש בתאי NIH3T3 וביטוי חלבון RB לחקר תפקודי חלבונים ביולוגיה תאית.

עיכוב חלבונים inducible והפיך דומיננטי שלילי (DN)

גלה סרטונים נוספים