Name: בידוד, אפיון, התמיינות של תאי גזע הלב מהלב העכבר למבוגרים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 45 s
Description: למדו לבודד, לאפיין ולהבדיל תאי גזע לב מלב עכבר מבוגר. הפרוטוקול משתמש בצנטריפוגה גרדיאנט צפיפות ומיקרוסקופ פלואורסצנטי לטיפול במחלות לב.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת, חלקים, המענקים מכוני הבריאות הלאומיים HL-113281 ו- HL116205 כדי פאראס קומאר מישרה.

דיור, הרדמה, ושל הקרבה של עכברים בוצעו בעקבות הפרוטוקול IACUC המאושרים של המרכז הרפואי של אוניברסיטת נברסקה.
1. חומרים
<ol><li>שחור C57BL/6J לשימוש 10 - עד השבוע ה-12, עכברים זכרים, כל הזמן ללא צורך במיקור חוץ במתקן בעל חיים מוסדיים, עבור בידודו של CSCs. CSCs יכול גם להיות מבודד עכברים אישה שאינה בהריון.</li>
	<li>לעקר את כל הדרוש מכשירי הניתוח, לרבות מספריים כירורגיים, מספריים כירורגיים בסדר, shank מעוקל מלקחיים להב כירורגי, על ידי autoclaving לפני המתת החסד של העכבר.</li>
	<li>להכין CSC מאגרי בידוד במצב סטיריליים ואחסן אותם ב 4 ° C על קרח. מאגרים אלה כוללים polysucrose, סודיום diatrizoate פתרון מותאם צפיפות של 1.077 g/mL, של Dulbecco לא שלם שונה בינוני של הנשר, 1 x של מאוזנת תמיסת מלח (HBSS), ונקניק תא תרבות כיתה 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS). להכין 1% collagenase II מניות פתרון (מסונן, עיקור) הפתרון עובד 0.2% ב- HBSS.</li>
	<li>שומרים שהחומרים תרביות רקמה במצב מעוקר ב אבטחה הקבינט, כולל צלחת פטרי 10 מ מ, צלחת 6-ובכן, צלחת 24-ובכן, T-25, T-75 תרבות מבחנות, צינורות חרוט 15-mL ו- 50-mL פיפטות סרולוגית חד פעמיות עם 40-מיקרומטר ו- 100 -strainers תא מיקרומטר עם מסננים 0.22-מיקרומטר.</li>
	<li>לחטא את 10-µL, 200-µL ועצות 1,000-µL פיפטה על ידי תא לחץ.</li>
	<li>להשתמש ללא אבקת nitrile כפפות ו-70% אתנול כדי לשמור על מצב סטרילי לאורך כל הניסוי.</li>
	<li>משתמשת במלבין 10% כמו חיטוי.</li>
	<li>השתמש זמינים מסחרית CSC תחזוקה בינונית, cardiomyocytes בידול בינוני על התרבות ועל הבידול של CSCs, בהתאמה.</li>
</ol>2. שיטת בידוד תאי גזע לב
<ol><li>המתת חסד גבר בוגר ארבעה עד חמישה (או אישה שאינה בהריון) עכברים באמצעות תא2 CO. לתקן הזרועות של העכבר בכל על קרטון ניתוח נפרד עם סיכות או קלטות דביק.</li>
	<li>תרסיס אתנול 70% על העכבר להיפטר מחיידקים חיצוניים ולשמור על התנאי סטיריליים במהלך קציר של הלב. אעשה חתך עם מספריים באמצע הבטן וחותכים את העור מן הבטן אל החזה בקו ישר. מסירים את העור משני צידי החתך האמצעי כדי לנקות את אזור הבטן של העור, שערות. באמצעות פינצטה ומספריים, חותכים את הסרעפת מתחת קשת הצלעות.</li>
	<li>פתח את חלל בית החזה של העכבר על ידי חיתוך קשת הצלעות בתוך המנוע. לחשוף את הלב ולהסיר את הדם ליד הלב. יש לשטוף את האזור שסביב הלב עם קרה כקרח PBS להיפטר דם באזור הלב.</li>
	<li>לנתח את הלב באמצעות מספריים כירורגיים פינצטה. מקום בלב בצלוחית 100-מ מ המכיל 10 מ"ל של PBS קר כקרח.</li>
	<li>Palpitate הלב באמצעות מלקחיים shank מעוקל ולהסיר את שאריות הדם בתוך הלב.</li>
	<li>להשתמש בלב שלם ניתוקה של CSCs.</li>
	<li>העברת כל ארבע או חמש לבבות כל צינור חרוטי 50-mL המכיל 10 מ"ל של HBSS קר כקרח. לשמור את הצינורית על הקרח עד עיבוד נוסף.</li>
	<li>נגב האחורה של אבטחה הקבינט עם-70% אתנול ליצירת סביבה מעוקר. לעקר את הצינור המכיל הלב וחומרים נדרשים אחרים עם 70% אתנול. למקם את הצינור המכיל הלב אבטחה הקבינט עיבוד נוסף.</li>
	<li>להעביר את הלבבות צלחת פטרי 100-מ מ המכיל 10 מ"ל של HBSS קר כקרח. לשטוף את הלבבות שוב על-ידי palpating כדי להסיר שאריות דם בתוך הלב. לשנות את הפתרון HBSS לשטוף אחרי זה כדי להבטיח הסרה מלאה של הדם.</li>
	<li>חותכים את הלבבות לחתיכות קטנות בעזרת מספריים כירורגיים בסדר או סכין כירורגית בצלוחית 100-מ מ המכיל 5-7 מ של פתרון HBSS. להחזיק כל לב עם זוג מלקחיים ולהשתמש זוג מספריים כירורגיים בסדר או סכין כירורגית כדי לחתוך את הלב לחתיכות 2 כדי 4-מ מ. לשנות את הפתרון HBSS בתדירות גבוהה כדי להבטיח HBSS ודוחף. מינצ הלבבות בפתרון HBSS.</li>
	<li>Centrifuge הרקמה טחון ב 500 x גרם ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דק. להשליך את תגובת שיקוע ולשמור בגדר.</li>
	<li>Resuspend בגדר ב- 5-6 מ"ל של 0.2% collagenase II פתרון צינור חרוטי 50-mL. עוצמת הקול של collagenase פתרון צריך להיות כמעט 1.5 - ל שתיים פי לנפח של בגדר. הערה: למערכת העיכול של רקמות, collagenase 0.2% ו- 2.5 U/mL dispase פתרון יכול להחליף 0.2% collagenase II. השתמש אמצעי כמעט שווה לפתרון dispase collagenase לי פתרון.</li>
	<li>ביסודיות מערבבים בגדר 0.2% collagenase II פתרון על-ידי לזעזע את הצינורית או נדנדה את הצינורית על מטרף ב 75 x g למשך 45-60 דקות ב 37 º C. לנער את הצינור נמרצות על ידי היד לאחר כל 20-30 דקות כדי לשפר את פירוק.</li>
	<li>Triturate את המיקס רקמת lysed באמצעות פיפטה סרולוגית 5 מ ל, עצה 1-mL פיפטה מביצועם הגוש רקמה לתוך התליה תא בודד. הערה: כדי להשיג התאוששות מקסימלית של CSCs, triturate את המיקס פירוק לפחות 5 דקות. אם הרקמה הגושים הם יחסית גדול, חותכים את קצה טיפ 1-mL פיפטה עם מספריים או סכין כירורגית ולהשתמש בו עבור trituration.</li>
	<li>לעצור את פירוק אנזימטי של הרקמה על ידי הוספת זמינים מסחרית CSC תחזוקה בינוני. הוסף כמעט 2-3 x בינוני תחזוקה כמה שיותר נפח הרקמה lysed בשלב 2.14.</li>
	<li>עוברים התליה תא מתעכל מסננת תא 100-מיקרומטר כדי להסיר את כל חתיכות רקמה מעוכל.</li>
	<li>חזור על שלב 2.16 באמצעות מסננת תא 40-מיקרומטר.</li>
	<li>להפריד את התאים באמצעות צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות. לצורך הקמת מכשול ההפרדה של תאים, בעדינות כיסוי של נפח שווה פילטרט של מעל polysucrose, סודיום diatrizoate פתרון. לדוגמה, הוסף תחילה, 20 מ של פתרון diatrizoate polysucrose ו נתרן בצינור חרוט 50-mL ולאחר מכן, להוסיף 20 מ של פילטרט של מהשלב 2.17 על הפתרון diatrizoate polysucrose, נתרן. הערה: Prewarm polysucrose ופתרון diatrizoate נתרן ב 37 מעלות צלזיוס לפני להשתמש עם התאים. הוסף את פילטרט של שלב 2.17 על הפתרון diatrizoate polysucrose, נתרן מאוד לאט ובזהירות כדי למנוע כל ערבוב של שני הפתרונות. זה נחשב צעד מכריע.</li>
	<li>Centrifuge את הצינור המכיל שני פתרונות ב x 500 g למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר באמצעות צנטריפוגה דלי הנדנדה. להגדיר לצנטריפוגה במהירות האצה והאטה נמוך יותר כדי למנוע ערבוב של שני פתרונות עבור הפרדה נכונה CSCs. זהו שלב חשוב בבידוד CSC. לשים את הצינור המכיל את התערובת הדרגתיות לאט מאוד ללא הפרעה בתוך לצנטריפוגה ולהגדיר אותו עבור צנטריפוגה.</li>
	<li>. תוציא את המעיל באפי יחד עם פתרון נוסף מהשכבה העליונה באמצעות פיפטה 1-mL או פיפטה פסטר פלסטיק צינור סטיריליים 15-mL שכבה זו באפי יכיל את CSCs. הערה: יזהרו במהלך pipetting של מעיל באפי לא להוציא השכבה פתרון diatrizoate polysucrose ו נתרן כי זה רעיל CSCs.</li>
	<li>להוסיף אמצעי שווה של CSC תחזוקה בינוני התליה תא מהשלב 2.20 ומערבבים אותו כראוי כדי לנטרל משקעי polysucrose של נתרן diatrizoate פתרון, אם קיים.</li>
	<li>Centrifuge התליה תא לעיל ב x 500 g למשך 5 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע.</li>
	<li>Resuspend בגדר ב 7-10 מ"ל של מדיום DMEM לא שלם, centrifuge זה ב 500 x g למשך 5 דקות ב 4 ° C כדי להיפטר כל שיורית polysucrose, סודיום diatrizoate פתרון.</li>
	<li>לאסוף את צניפה, אשר מכיל את CSCs מטוהרים.</li>
	<li>Resuspend בגדר ב 1 מ"ל של CSC תחזוקה בינוני, לספור את מספר CSC, ולהשתמש בגדר של תרבות. כדי לספור את מספר CSC, השתמש Trypan blue מכתים של hemocytometer. עם ארבעה לבבות עכברים זכרים, התשואה של CSCs הוא ~1.8 מיליון.</li>
	<li>זרע CSCs בצלחת 6-ובכן תרבות מצופה פתרון ג'לטין 0.02% המכיל fibronectin 0.5%. השתמש 2 מ של תחזוקה מלאה בינוני זריעה. דגירה לצלחת תרבות בתוך אינקובטור ב 37 ° C עם 5% CO2.</li>
	<li>החלף את המדיום של תרבות CSCs מלאה CSC תחזוקה בינוני כל יום עד היום השלישי. לאחר מכן, לשנות את המדיום לסירוגין.</li>
	<li>לקבוע את הצמיחה של CSCs על ידי התבוננות אותם תחת מיקרוסקופ.</li>
</ol>3. תרבות מעבר של תאי גזע לב ותחזוקה
<ol><li>תרבות CSCs מבודדים במדיום אחזקה זמינים מסחרית. החלף המדיום תרבות טריים תחזוקה בינוני לסירוגין. כאשר התרבות CSC הגיעה confluency, להעביר את CSCs צלחת חדשה מצופה עם הג'לטין ואת fibronectin, כפי שהוזכר בשלב 2.26. לנתק את CSCs בתרבית על-ידי מאגר דיסוציאציה תא אנזימטיות. בצע הפרוטוקול הסטנדרטי של דיסוציאציה התא לצלחת תרבות. בשלב זה, CSCs נחשבים-מעבר שלב 0 (P0).</li>
	<li>תרבות CSCs P0 בג'לטין חדש וצלחת מצופים fibronectin במדיום תחזוקה CSC מלאה ב- 37 מעלות צלזיוס ב חממה2 CO 5%, מאפשרים להם להיות confluent ולאחר מכן בצע צעד 3.1 להיכנס מעבר 1 (P1) CSCs. חנות P1 CSCs חנקן נוזלי או להשתמש בהם עבור החוויה הקצאות.</li>
	<li>זרע 0.5 מיליון תאים צלחת. ובכן 6 או 1 מיליון תאים T-25 כדי לשמור על התרבות CSC בשלב הראשוני שלה.</li>
	<li>המעבר CSCs כאשר הם הופכים confluent 85%-90%. CSCs יכול להיות מחונן במדיום תחזוקה ועד ארבעה עד שישה שבועות הערה: לשמור על צפיפות זריעה הראשונית של CSCs גבוה יחסית (40% - 50%), כי בזריעה צפיפות נמוכה יותר, CSCs עשויות להשתנות המורפולוגיה שלהם שטוח וארוך.</li>
</ol>4. אפיון של תאי גזע לב
<ol><li>כדי לאפיין את CSCs בתרבית, לצפות בהם תחת ניגוד phage או מיקרוסקופ שדה בהיר. מניחים את הצלחת המכילות CSC על המטרה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי. הגדר את רמת ההגדלה נמוך למדי (10 X) כדי למקד את התאים. השתמש שלב חדות צמצם כדי לבחון את התאים. העלאת מידת ההגדלה ל- 20 X על-ידי שינוי העדשה המטרה תמונה CSCs. גידול המטרה 40 X, תמונה של CSCs. בעוד יומיים, CSCs מופיעים כמעט עגול צורה, אבל הגודל של התא גדל עם הזמן, בשבעה ימים, CSCs מופיעים כמעט גלילי במצב (איור 1 א' - ג' 1).</li>
	<li>לבצע immunostaining של CSCs עם סמנים של pluripotency/stemness (OCT4, SOX2 או Nanog), התפשטות (Ki-67) (איור 2 א - 2D), הלב מוצא/ובתאים (Sca-1, NKX2-5 או GATA4) (איור 3 א - 3 C).<ol>
<li>עבור, immunostaining של CSCs הזרעים CSCs 10,000 לתוך צלחת 24-ובכן תרבות.</li>
		<li>למחרת (אחרי ה' 18-24), לתקן את CSCs µL 300 של 4% paraformaldehyde למשך 10 דקות.</li>
		<li>לשטוף את CSCs עם µL 500 ל- PBS קר כקרח, 3 x עם מרווחי 5-מין.</li>
		<li>Permeabilize את CSCs עם µL 300 של 0.2% טריטון X-100 מדולל ב- PBS למשך 10 דקות.</li>
		<li>לשטוף את CSCs עם µL 500 ל- PBS קר כקרח, 3 x עם מרווחי 5-מין.</li>
		<li>לבצע חסימת CSCs עם µL 300 של BSA 1% מעורבבת עם PBST (PBS + 0.1% Tween 20) או µL 300 של נסיוב עוף רגיל 10% מעורבבת עם PBST לשעה.</li>
		<li>דגירה של CSCs ב µL 200 של נוגדן ראשוני מעורבבת עם חסימת פתרון בן לילה ב 4 º C. לדלל נוגדן ראשוני כמומלץ על ידי גליון הנתונים של נוגדנים או לפי התקינה.</li>
		<li>לשטוף את CSCs עם µL 500 ל- PBS קר כקרח, 3 x עם מרווחי 5-מין.</li>
		<li>דגירה של CSCs ב µL 200 של נוגדנים משניים מעורבבת עם חסימת פתרון (ראה שלב 4.2.6) לשעה בטמפרטורת החדר. לדלל הנוגדן משני כמומלץ על ידי גליון הנתונים של נוגדנים או לפי התקינה.</li>
		<li>לשטוף את CSCs עם µL 500 ל- PBS קר כקרח, 3 x עם מרווחי 5-מין.</li>
		<li>Counterstain את CSCs עם µL 200 של דאפי (1 µg/mL) מדולל ב- PBS במשך 5 דקות.</li>
		<li>לשטוף את CSCs 1 x עם µL 500 ל- PBS קר כקרח. לאחר מכן, מוסיפים 300 µL ל- PBS קר כקרח מכל קידוח.</li>
		<li>לבצע הדמיה באמצעות מיקרוסקופ זריחה. בצע את ההוראות של פלורסנט הדמיה, כגון להימנע אור ישיר על הצלחת. לקחת את הצלחת תרבות מתחת למיקרוסקופ. מקדו את התאים בהגדלות שונות. לבחון את התאים תחת שלב ניגוד ו/או מסננים שונים עירור ולשמור את התמונות.</li>
		<li>לאחסן את הצלחת בחושך ב 4 º C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. התמיינות של תאי גזע הלב לתוך Cardiomyocyte
<ol><li>עבור הבידול של CSCs, זרע 500,000 CSCs בצלחת 6-ובכן עם 2 מ של prewarm (37 מעלות צלזיוס) זמינים מסחרית CSC תחזוקה בינוני.</li>
	<li>דגירה לצלחת המכילה את CSCs ב חממה2 CO ב 37 º C. אפשר את CSCs לצרף להתרבות עד צמיחה תת confluent. אם המדיום לצהוב, להחליף המדיום תרבות טריים תחזוקה בינונית.</li>
	<li>ב- 85% - 90% confluency, להחליף את המדיום תחזוקה 2 מ של prewarm (37 מעלות צלזיוס) cardiomyocytes בידול בינוני. דגירה על צלחת חממה2 CO ב 37 ° C עד 2-3 שבועות.</li>
	<li>לשנות את המדיום בידול ד כל 2-3 להתבונן המורפולוגיה של CSCs תחת מיקרוסקופ בכל פעם במהלך המדיום לשנות על מנת להבטיח את התנאים תרבות טובה.</li>
	<li>לאחר 12 d של CSC תרבות במדיום בידול, התמונה CSCs עבור סמני בידול בעקבות immunostaining סטנדרטי של פרוטוקול (ראה שלבים 4.2.1 - 4.2.14). שמור את התמונות פלורסנט עבור הביטוי של סמנים cardiomyocytes (איור 4A - 4B).</li>
</ol>

<ol><li>Benjamin, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+Disease+and+Stroke+Statistics-2017+Update%3A+A+Report+From+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association.</a> Circulation. 135, e146(2017).</li>
<li>Nguyen, P. K., Rhee, J. W., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+Stem+Cell+Therapy+and+Heart+Failure%2C+2000+to+2016%3A+A+Systematic+Review%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+the+American+Medical+Association+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Adult Stem Cell Therapy and Heart Failure, 2000 to 2016: A Systematic Review.</a> The Journal of the American Medical Association Cardiology. 1, 831-841 (2000).</li>
<li>Emmert, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+efficacy+of+cardiopoietic+stem+cells+in+the+treatment+of+post-infarction+left-ventricular+dysfunction+-+From+cardioprotection+to+functional+repair+in+a+translational+pig+infarction+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Safety and efficacy of cardiopoietic stem cells in the treatment of post-infarction left-ventricular dysfunction - From cardioprotection to functional repair in a translational pig infarction model.</a> Biomaterials. 122, 48-62 (2017).</li>
<li>Silvestre, J. S., Menasche, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Evolution+of+the+Stem+Cell+Theory+for+Heart+Failure%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">The Evolution of the Stem Cell Theory for Heart Failure.</a> EBioMedicine. 2, 1871-1879 (2015).</li>
<li>Terzic, A., Behfar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+therapy+for+heart+failure%3A+Ensuring+regenerative+proficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Stem cell therapy for heart failure: Ensuring regenerative proficiency.</a> Trends in Cardiovascular Medicine. 26, 395-404 (2016).</li>
<li>Yamada, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+therapy+of+heart+failure+in+genetic+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell therapy of heart failure in genetic cardiomyopathy.</a> Stem Cells. 26, 2644-2653 (2008).</li>
<li>Sadek, H. A., Martin, C. M., Latif, S. S., Garry, M. G., Garry, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone-marrow-derived+side+population+cells+for+myocardial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Bone-marrow-derived side population cells for myocardial regeneration.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 2, 173-181 (2009).</li>
<li>Vrtovec, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+intracoronary+CD34%2B+stem+cell+transplantation+in+nonischemic+dilated+cardiomyopathy+patients%3A+5-year+follow-up%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Effects of intracoronary CD34+ stem cell transplantation in nonischemic dilated cardiomyopathy patients: 5-year follow-up.</a> Circulation Research. 112, 165-173 (2013).</li>
<li>Hare, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+allogeneic+vs+autologous+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+delivered+by+transendocardial+injection+in+patients+with+ischemic+cardiomyopathy%3A+the+POSEIDON+randomized+trial%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Comparison of allogeneic vs autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells delivered by transendocardial injection in patients with ischemic cardiomyopathy: the POSEIDON randomized trial.</a> The Journal of American Medical Association. 308, 2369-2379 (2012).</li>
<li>Guijarro, D., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0167527316302285">Intramyocardial transplantation of mesenchymal stromal cells for chonic myocardial ischemia and impaired left ventricular function: Results of the MESAMI 1 pilot trial.</a> International Journal of Cardiology. 209, 258-265 (2016).</li>
<li>Bobi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracoronary+Administration+of+Allogeneic+Adipose+Tissue-Derived+Mesenchymal+Stem+Cells+Improves+Myocardial+Perfusion+But+Not+Left+Ventricle+Function%2C+in+a+Translational+Model+of+Acute+Myocardial+Infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Heart+Association%22%5BJournal%5D)">Intracoronary Administration of Allogeneic Adipose Tissue-Derived Mesenchymal Stem Cells Improves Myocardial Perfusion But Not Left Ventricle Function, in a Translational Model of Acute Myocardial Infarction.</a> Journal of the American Heart Association. 6, (2017).</li>
<li>Suzuki, E., Fujita, D., Takahashi, M., Oba, S., Nishimatsu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue-derived+stem+cells+as+a+therapeutic+tool+for+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue-derived stem cells as a therapeutic tool for cardiovascular disease.</a> World Journal of Cardiology. 7, 454-465 (2015).</li>
<li>Gao, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracoronary+infusion+of+Wharton%27s+jelly-derived+mesenchymal+stem+cells+in+acute+myocardial+infarction%3A+double-blind%2C+randomized+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Medicine%22%5BJournal%5D)">Intracoronary infusion of Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells in acute myocardial infarction: double-blind, randomized controlled trial.</a> BMC Medicine. 13, 162(2015).</li>
<li>Simpson, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+strong+regenerative+ability+of+cardiac+stem+cells+derived+from+neonatal+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">A strong regenerative ability of cardiac stem cells derived from neonatal hearts.</a> Circulation. , S46-S53 (2012).</li>
<li>Kazakov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-kit%28%2B%29+resident+cardiac+stem+cells+improve+left+ventricular+fibrosis+in+pressure+overload%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">C-kit(+) resident cardiac stem cells improve left ventricular fibrosis in pressure overload.</a> Stem Cell Research. 15, 700-711 (2015).</li>
<li>Ong, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross+talk+of+combined+gene+and+cell+therapy+in+ischemic+heart+disease%3A+role+of+exosomal+microRNA+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Cross talk of combined gene and cell therapy in ischemic heart disease: role of exosomal microRNA transfer.</a> Circulation. 130, S60-S69 (2014).</li>
<li>Sahoo, S., Losordo, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+and+cardiac+repair+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Exosomes and cardiac repair after myocardial infarction.</a> Circulation Research. 114, 333-344 (2014).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pretreatment+of+Cardiac+Stem+Cells+With+Exosomes+Derived+From+Mesenchymal+Stem+Cells+Enhances+Myocardial+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Heart+Association%22%5BJournal%5D)">Pretreatment of Cardiac Stem Cells With Exosomes Derived From Mesenchymal Stem Cells Enhances Myocardial Repair.</a> Journal of the American Heart Association. 5, (2016).</li>
<li>Ibrahim, A. G., Cheng, K., Marban, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+as+critical+agents+of+cardiac+regeneration+triggered+by+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Exosomes as critical agents of cardiac regeneration triggered by cell therapy.</a> Stem Cell Reports. 2, 606-619 (2014).</li>
<li>Emanueli, C., Shearn, A. I., Angelini, G. D., Sahoo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+and+exosomal+miRNAs+in+cardiovascular+protection+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Vascular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Exosomes and exosomal miRNAs in cardiovascular protection and repair.</a> Vascular Pharmacology. 71, 24-30 (2015).</li>
<li>Menasche, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+cell+therapy%3A+lessons+from+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Cardiac cell therapy: lessons from clinical trials.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50, 258-265 (2011).</li>
<li>Trounson, A., McDonald, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cell+Therapies+in+Clinical+Trials%3A+Progress+and+Challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Stem Cell Therapies in Clinical Trials: Progress and Challenges.</a> Cell Stem Cell. 17, 11-22 (2015).</li>
<li>Takamiya, M., Haider, K. H., Ashaf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+novel+multipotent+sub-population+of+Sca-1%28%2B%29+cardiac+progenitor+cells+for+myocardial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a novel multipotent sub-population of Sca-1(+) cardiac progenitor cells for myocardial regeneration.</a> PLoS One. 6, e25265(2011).</li>
<li>Cambria, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+cardiac+stem+cell+therapy%3A+advancing+from+first-generation+to+next-generation+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Translational cardiac stem cell therapy: advancing from first-generation to next-generation cell types.</a> NPJ Regenerative Medicine. 2, 17(2017).</li>
<li>Bruyneel, A. A., Sehgal, A., Malandraki-Miller, S., Carr, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cell+Therapy+for+the+Heart%3A+Blind+Alley+or+Magic+Bullet%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Stem Cell Therapy for the Heart: Blind Alley or Magic Bullet?</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 9, 405-418 (2016).</li>
<li>Garbern, J. C., Lee, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+stem+cell+therapy+and+the+promise+of+heart+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Cardiac stem cell therapy and the promise of heart regeneration.</a> Cell Stem Cell. 12, 689-698 (2013).</li>
<li>Oh, H., Ito, H., Sano, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+to+success+in+heart+failure%3A+Cardiac+cell+therapies+in+patients+with+heart+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Challenges to success in heart failure: Cardiac cell therapies in patients with heart diseases.</a> Journal of Cardiology. 68, 361-367 (2016).</li>
<li>Smith, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+resident+endogenous+c-Kit%2B+cardiac+stem+cells+from+the+adult+mouse+and+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of resident endogenous c-Kit+ cardiac stem cells from the adult mouse and rat heart.</a> Nature Protocols. 9, 1662-1681 (2014).</li>
<li>Rutering, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Method+for+Isolation+of+Neonatal+Rat+Cardiomyocytes+with+Increased+Yield+of+C-Kit%2B+Cardiac+Progenitor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Stem+Cell+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Improved Method for Isolation of Neonatal Rat Cardiomyocytes with Increased Yield of C-Kit+ Cardiac Progenitor Cells.</a> Journal of Stem Cell Research and Therapy. 5, 1-8 (2015).</li>
<li>Saravanakumar, M., Devaraj, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+homing+pattern+of+c-kit%2B+Sca-1%2B+CXCR4%2B+resident+cardiac+stem+cells+in+neonatal%2C+postnatal%2C+and+adult+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Pathology%22%5BJournal%5D)">Distribution and homing pattern of c-kit+ Sca-1+ CXCR4+ resident cardiac stem cells in neonatal, postnatal, and adult mouse heart.</a> Cardiovascular Pathology. 22, 257-263 (2013).</li>
<li>Monsanto, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concurrent+Isolation+of+3+Distinct+Cardiac+Stem+Cell+Populations+From+a+Single+Human+Heart+Biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Concurrent Isolation of 3 Distinct Cardiac Stem Cell Populations From a Single Human Heart Biopsy.</a> Circulation Research. 121, 113-124 (2017).</li>
<li>Vidyasekar, P., Shyamsunder, P., Santhakumar, R., Arun, R., Verma, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+protocol+for+the+isolation+and+culture+of+cardiomyocytes+and+progenitor+cells+from+neonatal+mouse+ventricles%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A simplified protocol for the isolation and culture of cardiomyocytes and progenitor cells from neonatal mouse ventricles.</a> European Journal of Cell Biology. 94, 444-452 (2015).</li>
<li>Dergilev, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+cardiac+stem+cell+sheets+detached+by+Versene+solution+and+from+thermoresponsive+dishes+reveals+similar+properties+of+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Cell%22%5BJournal%5D)">Comparison of cardiac stem cell sheets detached by Versene solution and from thermoresponsive dishes reveals similar properties of constructs.</a> Tissue Cell. 49, 64-71 (2017).</li>
<li>Zaruba, M. M., Soonpaa, M., Reuter, S., Field, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyogenic+potential+of+C-kit%28%2B%29-expressing+cells+derived+from+neonatal+and+adult+mouse+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Cardiomyogenic potential of C-kit(+)-expressing cells derived from neonatal and adult mouse hearts.</a> Circulation. 121, 1992-2000 (1992).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+a+Sca-1%2B%2FCD31-+progenitor+cell+lineage+derived+from+mouse+heart+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of a Sca-1+/CD31- progenitor cell lineage derived from mouse heart tissue.</a> BMC Biotechnology. 14, 75(2014).</li>
<li>Smits, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cardiomyocyte+progenitor+cells+differentiate+into+functional+mature+cardiomyocytes%3A+an+in+vitro+model+for+studying+human+cardiac+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Human cardiomyocyte progenitor cells differentiate into functional mature cardiomyocytes: an in vitro model for studying human cardiac physiology and pathophysiology.</a> Nature Protocols. 4, 232-243 (2009).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

להלן השלבים הקריטיים של הפרוטוקול בידוד CSC. 1) תנאי סטיריליים חייבות להישמר לחילוץ של הלבבות של העכברים. כל זיהום במהלך החילוץ הלב עלול לסכן את איכות CSCs. 2) הדם להסירו לחלוטין לפני הא הלב, אשר נעשה על ידי מספר שוטף של כל הלב והלב חלקים עם HBSS פתרון. 3) החלקים הלב חייב להיות lysed לחלוטין להשעיה תא בודד עם פתרון collagenase. 4) חייב להיות prewarmed polysucrose, סודיום diatrizoate הדרגתיות הפתרון עבור הפרדת התאים. 5) חייב להיות prewarmed המדיום לתרבות CSC. 6) הנהרות CSCs במהלך זריעה בקערה תרבות צריך להיות גבוה, כי ב- c...

מחלת לב איסכמית, כולל אוטם שריר הלב (MI), היא הגורם העיקרי למוות ברחבי העולם1. טיפול בתאי גזע, ולשם רגנרציה שריר הלב מת נשאר בגישה הגדולות כדי לשפר את תפקוד הלב MI הלב2,3,4,5. סוגים שונים של תאי גזע שימשו כדי לחדש את שריר הלב מת וכדי לשפר את תפקוד הלב הלב MI. הם יכולים להיות בהרחבה מחולקת6 תאי גזע עובריים ותאי גזע למבוגרים. בתאי גזע בוגרים, סוגים שונים של תאי גזע היו בשימוש, כמו7,תאי תאי מח עצם-derived8, גזע mesenchymal שמקורם במח העצם9,10, רקמת שומן 11,12, ואת הטבור13ו-14,CSCs15. תאי גזע יכולים לקדם התחדשות לב עד אנדוקרינית ו/או paracrine פעולות16,17,18,19,20. עם זאת, מגבלה עיקרית של טיפול בתאי גזע הוא קבלת מספר תאי גזע יכולים להתרבות ו/או להבדיל לכיוון ספציפי השושלת לב21,22. השתלת עצמיים, allogenic של תאי גזע הוא אתגר חשוב טיפול בתאי גזע9. CSCs יכול להיות שיטה טובה יותר עבור התחדשות לב כי הם נגזרים מתוך הלב, הם יכול להיות בקלות רבה יותר מובחן שושלות לב מאשר בתאי גזע ללא דום לב. לכן, זה מקטין את הסיכון של טרטומה. בנוסף, ההשפעות האנדוקריניות, paracrine של CSCs, כגון exosomes ו- miRNAs נגזר על CSCs, יכול להיות יעיל יותר מאשר סוגים אחרים של תאי גזע. לפיכך, CSCs נשאר אפשרות טובה יותר עבור התחדשות לב23,24.
למרות CSCs מועמד טוב יותר עבור התחדשות לב ליבה MI בשל מוצאם הלב, מגבלה עיקרית עם CSCs הוא פחות תשואה בגלל חוסר של שיטת בידוד יעיל. מגבלה נוספת יכולה להיות הבידול לקוי של CSCs כלפי cardiomyocytes שושלת היוחסין2,25,26,27. כדי לעקוף את המגבלות האלה, חשוב לפתח פרוטוקול יעיל בידוד CSC, אפיון של בידול לכיוון הלב השושלת. אין סמן מקובל יחיד עבור CSCs, ספציפי תא-פני המבוסס על סמן בידוד של CSCs מניב פחות CSCs. כאן, אנחנו לתקנן בגישה פשוטה צנטריפוגה מעבר צבע כדי לבודד CSCs מהלב העכבר זה היא חסכונית ותוצאות תשואה מוגברת של CSCs. CSCs מבודדים אלה ניתן לבחור עבור סמני משטח תאים ספציפיים על-ידי תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית לקצר. בנוסף CSCs בידוד, סיפקנו פרוטוקול תרבות CSC, אפיון של בידול כלפי השושלת cardiomyocyte. לפיכך, אנו מציגים שיטה אלגנטית כדי לבודד, לאפיין, תרבות, להבדיל CSCs העכבר למבוגרים לבבות (איור 5).

<table><tbody><tr><td><חזק>עכברים</חזקים></td><td>מעבדת ג'קסון, ארה"ב</td><td>מלאי מס' 000664</td><td></td></tr><tr><td><חזק>נוגדנים: </חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OCT4-Abcam</td><td></td> <td>ab18976 (פוליקלונל ארנב)</td><td>OCT4-נוגדן ראשוני - דילול 1:100, נוגדן משני - דילול 1:200, בתמיסת חסימה</td></tr><tr><td>SOX2</td><td>Abcam</td><td>ab97959 (פוליקלונל ארנב)</td><td>SOX2 - נוגדן ראשוני - דילול 1:100, נוגדן משני - דילול 1:200, בתמיסה חוסמת</td></tr><tr><td>Nanog</td><td>Abcam</td><td>ab80892 (פוליקלונל ארנב)</td> <td>Nanog - נוגדן ראשוני - דילול 1:100, נוגדן משני - דילול 1:200, בתמיסה חוסמת</td></tr><tr><td>Ki67</td><td>Abcam</td><td>ab16667 (פוליקלונל ארנב)</td> <td>Ki67 - נוגדן ראשוני - דילול 1:100, נוגדן משני - דילול 1:200, בתמיסה חוסמת</td></tr><tr><td>Sca I</td><td>Millipore</td><td>AB4336 (פוליקלונל ארנב)</td> <td>Sca I נוגדן ראשוני - דילול 1:100, נוגדן משני - דילול 1:200, בתמיסה חוסמת</td></tr><tr><td>NKX2-5</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-8697 (פוליקלונל עזים)</td> <td>NKX2-5 - נוגדן ראשוני - דילול 1:50, נוגדן משני - דילול 1:200, בתמיסת חסימה</td></tr><tr><td>GATA4</td><td>Abcam</td><td>ab84593 (פוליקלונל ארנב)</td><td>GATA4 - נוגדן ראשוני - דילול 1:100, נוגדן משני - דילול 1:200, בתמיסה חוסמת</td></tr><tr><td>MEF2C</td><td>סנטה קרוז</td><td>sc-13268 (פוליקלונל עזים)</td> <td>MEF2C - נוגדן ראשוני - דילול 1:50, נוגדן משני - דילול 1:200, בתמיסה חוסמת</td></tr><tr><td>טרופונין I</td><td>Millipore</td><td>MAB1691 (חד שבטי עכבר)</td> <td>טרופונין I - נוגדן ראשוני - דילול 1:100, נוגדן משני - דילול 1:200, בתמיסה</td></tr> <tr><td>חוסמתאקטינין</td><td>מיליפור</td><td>MAB1682 (חד שבטי עכבר)</td><td>נוגדן אקטינין-ראשוני - דילול 1:100, נוגדן משני - דילול 1:200, בתמיסה חוסמת</td></tr><tr><td>ANP</td><td>Millipore</td><td>AB5490 (פוליקלונלי עכבר)</td> <td>ANP - נוגדן ראשוני - דילול 1:100, נוגדן משני - דילול 1:200, בתמיסה חוסמת</td></tr><tr><td>אלכס פלואור-488 בדוק אנטי ארנב</td><td>טכנולוגיית חיים</td><td>מס' A21441</td><td></td></tr><tr><td>אלכס פלואור-594 עז נגד ארנב</td><td>טכנולוגיית חיים</td><td>מס' A11012</td><td></td></tr><tr><td>אלכס פלואור-594 ארנב נגד עזים</td><td>טכנולוגיית חיים</td><td>מס' A11078</td><td></td></tr><tr><td>אלכס פלואור-488 בדוק נגד עכבר</td><td>טכנולוגיית חיים</td><td>מס' A21200</td><td></td></tr><tr><td>אלכס פלואור-594 בדוק אנטי עז</td><td>טכנולוגיית חיים</td><td>מס' A21468</td><td></td></tr><tr><td>שם</td><td>חברה</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>מדיום תרבית: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CSC מדיום תחזוקה</td><td>Millipore</td><td>SCM101</td><td>הערה: עבור תרבית CSC, PBS או מדיום DMEM לא שלם שימש לשטיפת התאים</td></tr><tr><td>מדיום התמיינות קרדיומיוציטים</td><td>Millipore</td><td>SCM102</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5546</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</strong</td><td>>Catalog Number</strong</td><td>>Comments</strong</td></tr><tr><td>>מאגר בידוד תאים: </חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פוליסוכרוז ותמיסת נתרן דיאטריזואט (Histopaque1077)</td><td>Sigma</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>2018-03</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז I</td><td>Sigma</td><td>C0130</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת Dispase</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7913</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>LONZA</td><td>S1226</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td><td>Thermoscientific</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td><חזק>ריאגנטים אחרים: </חזק> </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>סרום בדיקה רגיל</td><td>מעבדת וקטור</td><td>S3000</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת DAPI</td><td>Applichem</td><td>A100,0010</td><td>Dapi, ריכוז עבודה-1 ומיקרו; גרם/מ"ל</td></tr><tr><td>טריפן כחול</td><td>Biorad</td><td>145-0013</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין</td><td>סיגמא</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase מגיב דיסוציאציה של תאים</td><td>תרמו פישר</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>פורמלדהיד</td><td>סיגמא</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>טריטון X-100</td><td>אקרוס</td><td>Cas מס' 900-293-1</td><td></td></tr><tr><td>טווין 20</td><td>פישר סינטיפיק</td><td>פריט מס' 160170</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>תרמו מדעי</td><td></td><td></td></tr><tr><td><חזק>שם</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק></td><td><חזק>מספר קטלוגי</חזק></td><td><חזק>הערות</חזק></td></tr><tr><td><חזק>חומרי תרבית רקמות: </חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 מ"מ צלחת פטרי</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צלחת 6 בארות</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צלחת 24 בארות</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T-25 בקבוק</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T-75 בקבוק</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 מ"ל צינור חרוטי</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינור חרוטי</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>40 ומיקרו; מכתים תאים m</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>100 ומיקרו; מכתים תאים m</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>22363549</td><td></td></tr><tr><td>0.22 ומיקרו; m מסנן</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>09-719C</td><td></td></tr><tr><td>10 מ"ל מזרק</td><td>BD</td><td>Ref מס' 309604</td><td></td></tr><tr><td>10 ומיקרו; L, 200 ומיקרו; L, 1000 ומיקרו; L קצות פיפטה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 מ"ל, 10 מ"ל, 25 מ"ל פיפטה מפלסטיק חד פעמי</td><td>תרמו מדעי</td><td></td><td></td></tr><tr><td><חזק>שם</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק></td><td><חזק>מספר קטלוגי</חזק></td><td><חזק>הערות</חזק</td></tr><tr><td>><חזק>מכשירים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מכונת צנטרופוגה</td><td>Thermo Scientific</td><td>LEGEND X1R צנטריפוגה</td><td></td></tr><tr><td>EVOS מיקרוסקופ טכנולוגיית</td><td>חיים מונה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תאים אוטומטי</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>שקופית ספירת תאים</td><td>Biorad</td><td>145-0011</td><td></td></tr><tr><td>Pippte aid</td><td>Thermo Scientific</td><td>S1 מילוי</td><td></td> פיפט</tr><tr><td><חזק>שם</חזק></td><td>< חזק>חברה</חזק</td><td>><חזק>מספר קטלוגי</חזק></td><td><חזק>הערות</חזק</td></tr><tr><td>><חזק>מכשירים כירורגיים: </חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מספריים כירורגיים</td><td>כלי מדעי משובח מספריים</td><td></td><td></td></tr><tr><td>כירורגיים עדינים</td><td>כלי</td><td></td><td></td>מדעי משובח</tr><tr><td>עקומת שוק מלקחיים</td><td>כלי מדעי משובח</td><td></td><td></td></tr><tr><td>להב כירורגי</td> כלי <td></td><td></td><td>מדעי משובח</td></tr></tbody></table>

בידוד, אפיון, התמיינות של תאי גזע הלב מהלב העכבר למבוגרים

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

אוטם שריר הלב (MI) הוא גורם התחלואה והתמותה ברחבי העולם. יעד מרכזי של רפואה רגנרטיבית היא לחדש את שריר הלב מת לאחר MI. למרות מספר אסטרטגיות שימשו להתחדש שריר הלב, טיפול בתאי גזע נשאר בגישה הגדולות כדי לחדש את שריר הלב מת הלב MI. לצבירת ראיות מצביע על הנוכחות של תאי גזע לב תושב (CSCs) בלב למבוגרים, ההשפעות שלהם אנדוקרינית ו/או paracrine על התחדשות לב. עם זאת, בידוד CSC, שלהם אפיון ובידול לכיוון תאי שריר הלב, במיוחד cardiomyocytes, נותר אתגר טכני. במחקר הנוכחי, סיפקנו שיטה פשוטה עבור בידוד, אפיון, הבידול של CSCs מהלב העכבר למבוגרים. כאן, אנו מתארים שיטה הדרגתי של צפיפות בידודו של CSCs, היכן הלב הוא מתעכל על ידי פתרון II collagenase 0.2%. כדי לאפיין את CSCs מבודדים, הערכנו את הביטוי של סמנים CSCs/לב Sca-1, NKX2-5 ו- GATA4, סמנים pluripotency/stemness OCT4, SOX2 ו- Nanog. אנחנו גם לקבוע את הפוטנציאל התפשטות של CSCs מבודדים על ידי culturing אותם בצלחת פטרי והערכה הביטוי של דה מרקר התפשטות Ki-67. להערכת פוטנציאל התמיינות של CSCs, בחרנו CSCs שבע עד עשר דקות ימים תרבותי. נוכל להעביר אותם צלחת חדשה עם מדיום בידול cardiomyocyte. הם מודגרת ב חממה תרבות התא במשך 12 יום, ואילו המדיום בידול משתנה כל שלושה ימים. CSCs הבדיל אקספרס סמנים ייחודיים cardiomyocyte: actinin, טרופונין אני. לפיכך, CSCs מבודדים עם פרוטוקול זה יש stemness וסמנים לב, שיש להם פוטנציאל התפשטות ובידול לכיוון השושלת cardiomyocyte.

במחקר הנוכחי, אנחנו מבודדים CSCs מ- 10 עד 12-בת C57BL/6J עכברים זכרים לבבות. . הנה, הוצגו שיטה פשוטה עבור CSC בידוד ואפיון באמצעות סמנים של pluripotency. אנחנו גם הציג שיטה אלגנטי עבור בידול CSC, אפיון CSCs זה הבדיל לכיוון cardiomyocytes השושלת. הבחנו מורפולוגיה צורת פלך של 2 עד 3-ימים-תרבותי CSCs במיקרוסקופ ניגוד שלב (איור 1A ו 1B). מצאנו את שינוי המבנה של CSCs ב 7 ימים של תרבות תחזוקה בינוני, אשר במהלכו הופכים תאי גזע מאורך (<strong class="...

המטרה הכוללת של מאמר זה היא כדי לתקנן את הפרוטוקול עבור בידוד, אפיון, התמיינות של תאי גזע הלב (CSCs) מהלב העכבר למבוגרים. כאן, אנו מתארים שיטה צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות לבודד CSCs מאתר ושיטות הארוטיות תרבות CSC, התפשטות של בידול לתוך cardiomyocytes.

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...

המטרה הכוללת של מאמר זה, היא לתקנן את הפרוטוקול לבידוד, אפיון ובידול של תאי גזע לבביים, CSCs מלב העכבר הבוגר. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח, בתחום מחלות לב וכלי דם וטיפול אזורי כגון, טיפול בתאי גזע לב ואי ספיקת לב. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שזה חסכוני, עם סיוע גבוה בתקופה קטנה של זמן.התחל ניסוי זה על-ידי הכנת כל החומרים, המכשירים ומאגרי הבידוד הדרושים במצב מעוקר כמתואר בפרוטוקול. לאחר הסרת העור מהבטן של עכבר המתת דם, לחתוך את בית החזה בתוך מכסה המנוע סטרילי כדי לפתוח את חלל בית החזה. לחשוף את הלב ולאחר מכן להסיר את הדם ליד הלב באמצעות מזרק מיליליטר אחד.כדי להסיר כל דם ליד הלב, לשטוף את האזור שמסביב עם PBS קר כקרח. באמצעות מספריים ופינצטה כירורגית כדי לנתח את הלב, למקם אותו בצלחת פטרי 100 מילימטר המכיל 10 מיליליטר קרח קר PBS. השתמש מלקעות שוק מעוקל כדי לדקור את הלב, ולהסיר את הדם שיורית בתוך הלב.מעבירים ארבעה עד חמישה לבבות מבודדים לצלחת פטרי של 100 מיליליטר המכילה 10 מיליליטר של תות תזונה למלח מאוזן של האם קר כקרח. למחוץ את הלבבות שוב כדי לשטוף אותם ולהסיר כל דם שיורית בתוך הלב. כדי להבטיח הסרה מלאה של הדם, לשנות את פתרון HBSS לאחר כל שטיפה.החזק כל לב עם זוג ממטרים ולהשתמש בלהב כירורגי לחתוך כל לב לחתיכות 2 עד 4 מילימטר בצלחת פטרי 100 מילימטר, המכיל חמישה עד שבעה מיליליטר של HBSS. לעתים קרובות לשנות את הפתרון כדי להבטיח הסרת דם מלאה. לבסוף, טחון את הלבבות בפתרון HBSS.צנטריפוגה הלבבות הטחון להציב צינור חרוט 50 מיליליטר ב 500 פעמים G, בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות, ולאחר מכן להשליך את העל טבעי. הוסף חמישה עד שישה מיליליטר, 0.2% פתרון קולגנס II לכדור לעכל את הרקמה. להשעות מחדש את גלולה ביסודיות על ידי נדנדה הצינור על שייקר ב 75 פעמים G, ב 37 מעלות צלזיוס במשך 45 עד 60 דקות.כל 20 עד 30 דקות, ללחוץ את הצינור במרץ ביד כדי לשפר את תזה. טריטוראט תערובת הרקמה lysed באמצעות חמש מיליליטר פיפטה סרולוגית, וקץ פיפטה מיליליטר אחד כדי לנטרל את גוש הרקמה לתוך ההשעיה תא יחיד. כדי לעצור את תיזה אנזימטית של הרקמה, להוסיף פעמיים עד שלוש פעמים מסחרי זמין CSC תחזוקה בינוני כמו נפח של הרקמה lysed.להעביר את ההשעיה תא מתעכל דרך מסננת תא 100 מיקרומטר להציב על צינור חרוט 50 מיליליטר כדי להסיר את כל חתיכות רקמה מעוכל. כדי להפריד את התאים לצנטריפוגה הדרגתית בצפיפות, הוסיפו 37 מעלות צלזיוס, מחוממות מראש, פוליסוקרוז ונתרן diatrizoate פתרון צינור חרוט 50 מיליליטר. לאחר מכן בעדינות ולאט לאט להוסיף נפח שווה של סינון על הפתרון, הימנעות כל ערבוב של שני הפתרונות.זה קריטי כדי להוסיף סינון מעל פתרון polysucrose ונתרן diatrizoate לאט מבלי לערבב על ידי הטיית הצינור ב 45 מעלות ועל הקיר של הצינור. אין להוסיף תוסף פוליזוכרוז ונתרן דיטריזואט מעל סינון. מניחים את הצינור לאט מאוד בצנטריפוגה דלי נדנדה הקפדה לא להפריע את הפתרונות.צנטריפוגה במהירות של פי 500 G למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר שנקבעה במהירות תאוצה והאטה נמוכה יותר, כדי למנוע ערבוב בין שני הפתרונות, ולהפרדה נכונה של תאי גזע הלב. זה קריטי לשים את הפתרון שיפוע בזהירות רבה ללא הפרעה בצנטריפוגה. שים את התאוצה וההאטה של הצנטריפוגה חייב להיות במהירות הנמוכה ביותר, כגון אחד או אפס.השתמש פיפטה מילימטר אחד כדי להעביר את המעיל באפי המכיל את CSCs יחד עם פתרון נוסף מהשכבה העליונה לצינור מעוקר 15 מיליליטר. מוסיפים נפח שווה של מדיום תחזוקה CSC, ומערבבים אותו כראוי כדי לנטרל את פתרון שאריות פוליזוכרוז ונתרן diatrizoate. צנטריפוגה השעיה זו ב 500 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.השלך את העל-טבעי. חזור על הכביסה של CSCs עם פתרון DMEM לא שלם לפחות פעמיים. צנטריפוגה ב 500 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי להיפטר מכל שאריות פוליזוקרוז ונתרן diatrizoate פתרון.לאחר הסרת supernatant, resuspend גלולה המכילה CSCs מטוהרים באמצעי תחזוקה CSC מיליליטר אחד, ולאחר מכן לספור את התאים. זרע את CSCs בצלחת תרבות שש באר מצופה 0.02% ג'לטין פתרון המכיל 0.5% fibronectin, ולהוסיף שני מיליליטר של מדיום תחזוקה מלאה. לגדל את התאים ב 37 מעלות צלזיוס ב 5%CO2.כאשר תרבות CSC מגיעה לקונפלנציה, להעביר את התאים לצלחת מצופה ג'לטין ופיברונקין חדשה כמתואר בפרוטוקול הטקסט. תרבות אלה העבירו P0 CSCs במדיום תחזוקה CSC מלא ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור 5%CO2 עד confluent. חזור על העברת התאים לצלחת חדשה כדי ליצור CSCs P1 אשר ניתן להשתמש בהם לניסויים נוספים.כדי לשמור על תרבות CSC בשלב הראשוני שלה, זרע את התאים עוד יותר כמתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי לאפיין את התאים המתורכלים, מניחים את לוח המכיל CSC על המטרה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי. השתמש בהגדלה פי עשרה כדי למקד את התאים.כדי להתבונן בתאים, השתמש בצמצם ניגודיות פאזה והגדל את ההגדלה ל- 20 פעמים על-ידי שינוי העדשה האובייקטיבית ולאחר מכן תמונה של CSCs. לאחר ביצוע immunostaining, מניחים את צלחת התרבות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. מקד את התאים בהגדלות שונות, והתבונן בתאים תחת ניגודיות פאזה ומסנני העירור השונים ושמור את התמונות.עבור בידול תאים, לגדל את CSCs בצלחת שש באר עם שני מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס, מדיום תחזוקה מחומם מראש CSC. כאשר התאים מגיעים ל-80 עד 95%, החליפו את מדיום התחזוקה בשני מיליליטר, 37 מעלות צלזיוס, אמצעי התברות קרדיומיוציטים מחומם מראש. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, ב 5% CO2 עד שבועיים עד שלושה שבועות.שנה את מדיום ההידול כל יומיים עד שלושה ימים. במהלך השינוי הבינוני, יש להתבונן במורפולוגיה של התא תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח את תנאי התרבות הטובים. לאחר 12 ימים, תדמיין את התאים עבור סמני התבולל בהתאם לפרוטוקול כשל חיסוני סטנדרטי.יומיים עד שלושה CSCs מתורבתים מראים מורפולוגיה בצורת ציר כאשר נצפתה תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה. לאחר שבעה ימים של תרבות, הם מראים שינוי במורפולוגיה להיות מוארך. לאחר כשל חיסוני עבור סמנים של פלוריפוטנטיות, CSCs מציגים ביטויים של OCT4, SOX2 וננוג.יתר על כן, CSCs להתרבות בינוני תרבות, ולהביע את סמן התפשטות Ki67. כדי לאפיין את המקור הלבבי של CSCs, נבדק ביטוי של סמני לב, והתאים הראו להיות חיובי עבור סמני לב Sca-1, NKX2.5, ו GATA4. לאחר culturing במדיום בידול cardiomyocyte במשך 12 ימים, CSCs מובחן להראות ביטוי של סמני קרדיומיוציט ACTININ, ו TROPONIN-I.בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לא לאפשר ערבוב של הפתרון הדרגתי ואת הסינון. חשוב גם להגדיר את התאוצה וההאטה במהירות הנמוכה ביותר. מי שמזהם אותם, מומלץ לבצע את כל תהליך בידוד התא בתוך ארון biosafety.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו הפרדה מבוססת חרוזים מגנטיים או שיטות מיון תאים מבוססות זרימה על מנת לענות על שאלות נוספות כגון, עד כמה ברורה האוכלוסייה ההומוגנית של תאי גזע לבביים? רדיוס סדק בתא גזע לב הוא סמנים גדולים, ויש הבדלים לכיוון קרדיומיוציטים. לאחר התפתחותה, טכניקה זו תסלול את הדרך לחוקרים בתחום מחלות לב וכלי דם אשר לעתים קרובות תשואה גבוהה של תאי גזע לב מלב העכבר אשר יכול להיות חשוב לטיפול רגנרטיבי אי ספיקת לב איסכמי.אל תשכח כי עבודה עם להב כירורגי, אקונומיקה ו- DMSO יכול להיות מסוכן, ואמצעי זהירות כגון שימוש בציוד מגן כוח אדם, PPE, תמיד צריך להילקח בעת ביצוע הליך זה.

isolation-characterization-differentiation-cardiac-stem-cells-from

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כאן אנו מתארים את הבידוד של cardiomyoctyes עכבר המבוגר באמצעות מערכת זלוף Langendorff. תאים וכתוצאה מכך הם Ca2 +, סובלניים, חשמלי שקט ויכולים להיות מתורבת וtransfected עם אדנו או lentiviruses כדי לתפעל ביטוי גנים. הפונקציונליות שלהם יכולה גם להיות מנותחת באמצעות מערכת MMSYS וטכניקות תיקון מהדק.

בידוד, תרבות ואפיון פונקציונלי של Cardiomyoctyes מאוס למבוגרים

ניתן לבודד קרדיומיוציטים בודדים מעכברים פראיים ועכברים מוטנטיים מהלב על מנת לחקור את ההתכווצות שלהם ואת מעברי הסידן שלהם. זה מאפשר לאפיין את התרומה של תפקוד לקוי של התאים לתפקוד לקוי של הלב מכל סיבה שהיא.

בידוד ופיזיולוגי ניתוח של שריר לב העכבר

אנו מתארים שיטה אמינה לבידוד של שריר לב עכבר בוגר. פרוטוקול זה מניב תוצאה עקבית לתרבות של שריר לב בוגר מתפקד ממגוון רחב של עכברים מהונדסים גנטי.

בידוד והתרבות של שריר לב מאוס למבוגרים לתא איתות ו<em&gt; במבחנה</em&gt; לב היפרטרופיה

פרוטוקול זה מתאר שיטה שלב אחר שלב לבידוד הניתן לשחזור ותרבית ארוכת טווח של קרדיומיוציטים של עכברים בוגרים עם תפוקה, טוהר וכדאיות גבוהים.

בידוד, תרבות התמרה של cardiomyocytes עכבר למבוגרים

ברקמת לב אדם מטפחת אוכלוסיות תאי מבשר perivascular מולטיפוטנטיים שעשויה להיות מתאים התחדשות שריר לב. הטכניקה המתוארת כאן מאפשרת בידוד סימולטני וטיהור שתי אוכלוסיות תאי סטרומה מולטיפוטנטיים קשורות כלי דם מקומיים, כלומר CD146 + CD34 - pericytes ו CD34 + CD146 - תאי adventitial, מן שריר הלב האנושי.

בידוד של אוכלוסיות תאי perivascular מולטיפוטנטיים המבשרים מרקמות אדם לב

שיטות הם הפגינו לבידוד של מיוציטים צומת sinoatrial (Sams) מעכברים בוגרים ללימודי electrophysiology צמד תיקון או הדמיה. תאים מבודדים ניתן להשתמש ישירות או יכול להישמר בתרבות להתיר ביטוי של חלבונים של עניין, כגון עיתונאים מקודדים גנטית.

שיטות הבידוד, תרבות האפיון פונקציונלי של myocytes צומת Sinoatrial של עכברים בוגרים

הפרוטוקול הזה משמש כדי לבודד פרפור לב בודד מהלב של העכבר המבוגר באמצעות הגישה העיכול קטע. גישה זו משמשת כדי לבודד את הפרפור הימני או השמאלי, שניתן להשתמש בו כדי לאפיין את פרפור מיציט אלקטרופיזיולוגיה במחקרים הדבקת מהדק.

בידוד של פרפור מיוציטים מעכברים למבוגרים

קבלת אוכלוסייה טהורה של פיברותקיעות חיונית כדי ללמוד את תפקידם בתיקון פצעים פיברוזיס. המתואר כאן היא שיטה מפורטת כדי לבודד את הפיברוכדורים ומיוריסותליות מלבבות העכבר שנפגעו ונפצעו ולאחר מכן אפיון הטוהר והפונקציונליות שלהם על ידי immunofluorescence RTPCR, מיון תאים בסיוע פלואורסצנטית, ו התכווצות ג'ל לקולגן.

בידוד ואפיון של מבוגרים ופיברותקיעות לב ומיופיברופיצוצים

שיטה מתוארת לבידוד בו זמנית של מיוציטים ולא מיוציטים הן מהאטיה והן מחדרי הלב של עכבר בוגר יחיד. פרוטוקול זה מביא לתשואות עקביות של מיוציטים לבביים ברי קיימא מאוד ולא מיוציטים ומפרט תנאי תרבות אופטימליים ספציפיים לתאים עבור פנוטיפים וניתוח במבחנה.

בידוד ותרבות בו זמנית של מיוציטים פרך, מיוציטים חדריים, ולא מיוציטים מלב עכבר בוגר

כאן אנו מציגים פרוטוקול המתאר הכנת גרעיני תאים. לאחר מיקרודיסקציה ודיסוציאציה אנזימטית של רקמת הלב לתאים בודדים, תאי האב הוקפאו, ולאחר מכן בידוד של תאים טהורים בני קיימא, ששימשו לריצוף RNA של גרעין יחיד ובדיקת גרעין יחיד לכרומטין נגיש לטרנספוזאז עם ניתוחי ריצוף בתפוקה גבוהה.

בידוד גרעינים מתאי אב לבביים של עכברים עבור אפיגנום ופרופיל ביטוי גנים ברזולוציה של תא בודד

למדו לבודד, לאפיין ולהבדיל תאי גזע לב מלב עכבר מבוגר. הפרוטוקול משתמש בצנטריפוגה גרדיאנט צפיפות ומיקרוסקופ פלואורסצנטי לטיפול במחלות לב.

בידוד, אפיון, התמיינות של תאי גזע הלב מהלב העכבר למבוגרים

גלה סרטונים נוספים