Name: חיסונים של האלפקות (לאמה pacos) עם חלבונים אנטיגניים וייצור נוגדנים תחום יחיד אנטיגן ספציפי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: למדו שיטה לייצור נוגדנים תחום יחיד באלפקות באמצעות חיסון אנטיגנים ובידוד לימפוציטים. הטכניקה מאפשרת ייצור נוגדנים נגד עד חמש חלבונים שונים מאלפקה אחת ליישומים ביורפואיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מכוני הבריאות הלאומיים (P30GM103486).

<ol><li>Krah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-domain+antibodies+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Immunopharmacology+and+Immunotoxicology%22%5BJournal%5D)">Single-domain antibodies for biomedical applications.</a> Immunopharmacology and Immunotoxicology. 38 (1), 21-28 (2016).</li>
<li>Rothbauer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+and+tracing+antigens+in+live+cells+with+fluorescent+nanobodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Targeting and tracing antigens in live cells with fluorescent nanobodies.</a> Nature Methods. 3 (11), 887-889 (2006).</li>
<li>Maass, D. R., Sepulveda, J., Pernthaner, A., Shoemaker, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpaca+%28Lama+pacos%29+as+a+convenient+source+of+recombinant+camelid+heavy+chain+antibodies+%28VHHs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Alpaca (Lama pacos) as a convenient source of recombinant camelid heavy chain antibodies (VHHs).</a> Journal of Immunological Methods. 324 (1-2), 13-25 (2007).</li>
<li>Pardon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+protocol+for+the+generation+of+Nanobodies+for+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A general protocol for the generation of Nanobodies for structural biology.</a> Nature Protocols. 9 (3), 674-693 (2014).</li>
<li>Hertveldt, K., Belien, T., Volckaert, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+M13+phage+display%3A+M13+phage+display+in+identification+and+characterization+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">General M13 phage display: M13 phage display in identification and characterization of protein-protein interactions.</a> Methods in Molecular Biology. 502, 321-339 (2009).</li>
<li>Kushwaha, R., Schafermeyer, K. R., Downie, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+phage+display+and+affinity+selection+using+recombinant+protein+baits%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A protocol for phage display and affinity selection using recombinant protein baits.</a> Journal of Visualized Experiments. (84), e50685(2014).</li>
<li>Hamers-Casterman, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+antibodies+devoid+of+light+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring antibodies devoid of light chains.</a> Nature. 363 (6428), 446-448 (1993).</li>
<li>Muyldermans, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Camelid+immunoglobulins+and+nanobody+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Immunology+and+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">Camelid immunoglobulins and nanobody technology.</a> Veterinary Immunology and Immunopathology. 128 (1-3), 178-183 (2009).</li>
<li>Muyldermans, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23495938">Nanobodies: natural single-domain antibodies.</a> Annu Rev Biochem. 82, 775-797 (2013).</li>
<li>Muyldermans, S., Cambillau, C., Wyns, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+antigens+by+single-domain+antibody+fragments%3A+the+superfluous+luxury+of+paired+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Recognition of antigens by single-domain antibody fragments: the superfluous luxury of paired domains.</a> Trends in Biochemical Sciences. 26 (4), 230-235 (2001).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanobody-derived+nanobiotechnology+tool+kits+for+diverse+biomedical+and+biotechnology+applications%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Nanobody-derived nanobiotechnology tool kits for diverse biomedical and biotechnology applications.</a> International Journal of Nanomedicine. 11, 3287-3303 (2016).</li>
<li>Van Saun, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+requirements+and+assessing+nutritional+status+in+camelids%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Clinics+of+North+America%3A+Food+Animal+Practice%22%5BJournal%5D)">Nutritional requirements and assessing nutritional status in camelids.</a> Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. 25 (2), 265-279 (2009).</li>
<li>Jones, M., Boileau, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19460638">Camelid herd health.</a> Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. 25 (2), 239-263 (2009).</li>
<li>Daley, L. P., Gagliardo, L. F., Duffy, M. S., Smith, M. C., Appleton, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+monoclonal+antibodies+in+functional+and+comparative+investigations+of+heavy-chain+immunoglobulins+in+new+world+camelids%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Diagnostic+Laboratory+Immunology%22%5BJournal%5D)">Application of monoclonal antibodies in functional and comparative investigations of heavy-chain immunoglobulins in new world camelids.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12 (3), 380-386 (2005).</li>
<li>Romao, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Useful+Nanobodies+by+Phage+Display+of+Immune+Single+Domain+Libraries+Derived+from+Camelid+Heavy+Chain+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Design%22%5BJournal%5D)">Identification of Useful Nanobodies by Phage Display of Immune Single Domain Libraries Derived from Camelid Heavy Chain Antibodies.</a> Current Pharmaceutical Design. 22 (43), 6500-6518 (2016).</li>
<li>Henry, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+TGF-beta-neutralizing+single-domain+antibodies+of+predetermined+epitope+specificity+using+next-generation+DNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Engineering%2C+Design+and+Selection%22%5BJournal%5D)">Isolation of TGF-beta-neutralizing single-domain antibodies of predetermined epitope specificity using next-generation DNA sequencing.</a> Protein Engineering, Design and Selection. 29 (10), 439-443 (2016).</li>
<li>Burg, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+biology.+Structural+basis+for+chemokine+recognition+and+activation+of+a+viral+G+protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural biology. Structural basis for chemokine recognition and activation of a viral G protein-coupled receptor.</a> Science. 347 (6226), 1113-1117 (2015).</li>
<li>Wesolowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+domain+antibodies%3A+promising+experimental+and+therapeutic+tools+in+infection+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Single domain antibodies: promising experimental and therapeutic tools in infection and immunity.</a> Medical Microbiology and Immunology. 198 (3), 157-174 (2009).</li>
<li>Harmsen, M. M., De Haard, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties%2C+production%2C+and+applications+of+camelid+single-domain+antibody+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Properties, production, and applications of camelid single-domain antibody fragments.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 77 (1), 13-22 (2007).</li>
<li>McMahon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+surface+display+platform+for+rapid+discovery+of+conformationally+selective+nanobodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Yeast surface display platform for rapid discovery of conformationally selective nanobodies.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 25 (3), 289-296 (2018).</li>
</ol>

ד"ר Whiteheart, הרש ב אוניברסיטת קנטאקי, פועלים מגרעין המרכז לרפואה מולקולרית מייצרת נוגדנים מחשבים בודדת באלפקה כשירות בתשלום-על.

כאמור, זיקה גבוהה וספציפיות של נוגדנים מחשבים בודדת, בשילוב עם שלהם ביטוי נתיישב ויציבות, להפוך אותם ריאגנטים אידיאלי עבור היישומים במחקר ביו-רפואי, כמו ריאגנטים ביוכימיים קריטיים, כלי אבחון, או סוכני18. עבור יישומים מסחריים, ישנם רכוש הקשור רוחני בעיות כי יש לקחת בחשבון. בנוסף, ניתן לתכנן מחשבים בודדת נוגדנים להכיל סמני ספציפי או תגיות זה יכול לשמש עיתונאים מבחני הסלולר או בכל אבחון. המפתח שימושים אלה הוא היכולת לייצר מחשבים בודדת ספציפי נוגדנים כנגד האנטיגנים של עניין. שיטה מתואר כאן כדי לייצר נוגדנים מחשבים בודדת באמצעות אלפקות, אשר מייצר תגובה חיסונית חזקה נגד מגוון רחב של חלבונים אנטיגניים. לשיקולים הקשורים לטיפול בבעלי חיים ותאימות לתקנות מתוארים. אלה הם המפתח להצלחה בחלק זה של התהליך.
ישנן אסטרטגיות אחרות לייצור נוגדנים מחשבים בודדת אינם מחייבים את החיסונים, אך במקום זאת להשתמש בספריות semisynthetic עם מערכות שונות עבור בחירה ואופטימיזציה איטרטיביים של הזיקות19,20 . עם זאת, היתרון של שימוש בספריות שמקורם מן החי לחסן היא היכולת לבודד אמינה מאוד מועשר, מגוונת, ואהדה גבוהה מחשבים בודדת נוגדנים. בנוסף, לא רק רצף משמעותי וריאציות שנצפו, אבל רוב מוחלט של נוגדנים ספציפיים מחשבים בודדת מבודד היו ייחודיים הוספות ומחיקות, בפרט CDR3.
תחום נוסף, יחיד נוגדנים יכול להיות מיוצר באמצעות תהליך פשוטה הדורשת רק קטן זריקות אנטיגן, ואחרי תהליך זה, החיות שאפשר יהיה להחזיר את העדר. ראוי לציין, החיה ניתן להשתמש בחופשיות לייצור סיבים, אך לא ייכללו לשימוש כמו בשר (שרשרת המזון האנושית) עקב השימוש של בדיקת אנטיגנים, אדג'וונט שאושרו-ה-FDA לייצור נוגדנים מחשבים בודדת. כאשר ההליך הושלם, בעלי החיים צריך להיות במעקב במשך שבוע, בהתחשב וטרינרי בבחינת גמר, יכול להיות חזרה לחווה שלהם הביתה או נחה במשך שישה חודשים לפני סבב נוסף של ייצור נוגדנים מחשבים בודדת.

אלפקות, ועם שאר בני משפחת גמליים, הפכו מקור פופולרי עבור יצירת נוגדנים עבור מחקר ביו1,2,3. גמליים יש מערכת חיסונית ייחודית שהם מייצרים גם נוגדנים נורמליים, כמו גם נוגדנים רק שרשרת כבדה אשר מאפשרים הייצור של נוגדנים מחשבים בודדת קטן הרבה יותר, תוך שמירה על ירידה לפרטים גבוה ואהדה גבוהה. לפיכך, גמליים נוגדנים לספק ריאגנט רב-תכליתי שימושי למגוון רחב של מטרות. שיטה כדי לחסן את האלפקה לייצר נוגדנים מחשבים בודדת למגוון של חלבונים אנטיגניים מתואר כאן. נוגדנים אלה יכול להיות מיוצר גמליים באמצעות תהליך פשוט למדי כי רק מחייב את חיסון באמצעות זריקות קטנות של החלבון היעד (אנטיגן) ו צייר דם4. לאחר מכן, בניית ספרייה, M13 phage התצוגה5 ו panning נגד אנטיגן רקומביננטי6 משמש כדי לבודד לייצר נוגדנים מחשבים בודדת עם התכונות הרצויות. כי התהליך מנצל הכוח של טכנולוגיית התצוגה phage, אנטיגנים חמישה או יותר יכול להיות מנוצל בו זמנית לכל בעל חיים, ובכך להפחית את מספר בעלי החיים בשימוש ומקושרת עלויות.
נוגדנים בתרבית של טיפוסי או immunoglobulins הם מולקולות גדולות בהיקף של שני סוגים של שרשראות (2 שרשראות כבדות ו 2 שרשראות אור), אשר מקושרים זה לזה באמצעות אגרות חוב דיסולפידי. נוגדנים אלה הם גדולים יחסית, מפגין מולקולרית משקל ~ 140-190 kDa עבור המין IgG שופע יותר בני אדם, עכברים, עזים, ארנבות. בשל מבנה יחידת משנה מרובה שלהם, משקל מולקולרי גבוה, ואגרות דיסולפידי immunoglobulins יכול להיות מאתגר למדי לייצר בכמויות גדולות, שהופך את עלות גבוהה. בשנות התשעים, התגלה כי גמליים, הכוללת גמלים, לאמות, אלפקות לבצע, בנוסף בנוגדנים מסוג בתרבית של טיפוסי, צורה הרומן של אימונוגלובולינים פשוטה במבנה, אחזקת שרשראות כבדות רק7. נוגדנים אלה גמליים ייחודי בעל היכולת באותו לאגד חומרים זרים עם זיקה גבוהה במיוחד אבל רק מורכב של שרשרת חלבון אחד8. יתר על כן, גמליים נוגדנים יכולים השפעול ייחתכו למקטע אפילו קטנה יותר יחידה HHV, הנקרא גם נוגדן מחשבים בודדת9. עקב גודלם הקטן, מחשבים בודדת נוגדנים שימושיים עבור מגוון רחב של יישומי המחקר הביו-רפואי, הינם זמינים ממגוון רחב של מקורות אקדמיים ומסחריים1,10. חריג נראה סופג המערבי מאז נוגדנים מחשבים בודדת לעיתים קרובות יותר מכוונות כלפי קונפורמציה תלויים epitopes, אשר בדרך כלל אבודים בתנאים denaturing בשימוש שהכלים המערבי.
מאז הם מורכבים משרשרת מפוליפפטיד יחיד, נוגדנים ספציפיים מחשבים בודדת יכול להיות שנבחרו, בקלות מיוצר בכמויות גדולות כמו חומרים של חיידקים. מחשבים בודדת נוגדנים יכולים גם להיות מהונדסים גנטית להכיל סמני ספציפי או תגיות יכול לשמש בתור "כתב קבוצות" לאבחון מחלות11. קלות זו של מניפולציה בשילוב עם גמישותם של שימוש הופך מחשבים בודדת נוגדנים משאב חשוב עבור חוקרים באוניברסיטאות ובמקומות אחרים.
כמו חלק מכוני הבריאות הלאומיים נתמך הליבה, שיטות קיימות הותאמו לייצר נוגדנים מחשבים בודדת אלפקות3,4. אלפקות יש יתרונות משמעותיים הן מבחינת קלות הטיפול ביחס גמליים בני משפחה גדולה יותר, כמו גם נגישות. אלפקות גדלים נרחב עבור סיבים ובשר, ובכך ניתן להשיג כתמורה החקלאים אלפקה מקומית, ניתן לזהות דרך אתרי האינטרנט שלהם או דרך המדינה מגדלת עמותות. שני גזעים של אלפקות זמינים, סורי, Huacaya. Huacaya נפוצים יותר, שימשו עבור פרוטוקול זה, אך הפרוטוקול היא חלים באופן כללי על גזעים או ישים גם באופן נרחב יותר גמליים אחרים.

<table><tbody><tr><td>GERBU FAMA Adjuvant</td><td>Biotechnik, היידלברג, גרמניה&nbsp;</td><td>3003,6001</td><td></td></tr><tr><td>שפופרת איסוף סרום</td><td>בקטון דיקינסון</td><td>367983</td><td></td></tr><tr><td>צינור איסוף דם</td><td>בקטון דיקינסון</td><td>366643</td><td></td></tr><tr><td>סט איסוף דם</td><td>בקטון דיקינסון</td><td>368652</td><td></td></tr><tr><td>Maxisorp Immuno לוחות</td><td>Nunc</td><td>439454</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן IgG נגד לאמה מצומד HRP&nbsp;</td><td>Bethyl Labs</td><td>A160-100P</td><td></td></tr><tr><td>TMB מגיב כרומוגני פרוקסידאז מצע&nbsp;</td><td>KPL</td><td>50-76-03</td><td></td></tr><tr><td>קורא צלחות</td><td>Spectramax</td><td>M5</td><td>כל קורא בעל יכולת UV/VIS מקובל</td></tr><tr><td>Uni-SepMAXI+ צינור הפרדת ליפוציטים</td><td>Novamed</td><td>U-17</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>QIAמגרסה עמוד</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td></td></tr><tr><td>Superscript IV תעתיק הפוך&nbsp; &nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>18064014</td><td></td></tr><tr><td>פתרון AEBSF</td><td>Biosynth</td><td>A-5440</td><td></td></tr><tr><td>TG1 תצוגת פאג'ים תאים מוכשרים</td><td>Lucigen</td><td>60502</td><td></td></tr></tbody></table>

חיסונים של האלפקות (לאמה pacos) עם חלבונים אנטיגניים וייצור נוגדנים תחום יחיד אנטיגן ספציפי

Immunization of Alpacas (Lama pacos) with Protein Antigens and Production of Antigen-specific Single Domain Antibodies

כתב יד זה, שיטה של חיסון של אלפקה, השימוש בשיטות ביולוגיה מולקולרית כדי לייצר נוגדנים מחשבים בודדת אנטיגן ספציפי תיאר, הפגינו. גמליים, כגון אלפקות, לאמות, הפכו משאב יקר-ערך למחקר ביורפואי מאז שהם מייצרים סוג הרומן של נוגדן שרשרת בלבד כבד אשר יכול לשמש כדי לייצר נוגדנים מחשבים בודדת. בגלל המערכת החיסונית הוא גמיש במיוחד, מחשבים בודדת נוגדנים יכולים להתבצע הרבה חלבונים שונים אנטיגנים, וכל הייצורים החיים אפילו שונים של אנטיגן, עם מידה גבוהה מאוד של ירידה לפרטים. תכונות אלה, בין היתר, להפוך מחשבים בודדת נוגדנים כלי יקר ערך למחקר ביורפואי. שיטה לייצור מחשבים בודדת בנוגדנים אלפקות הוא דיווח. פרוטוקול חיסונים, איסוף דם של בידוד תאי B מתואר. B-התאים משמשים להקמת ספריה immunized, אשר משמש בבחירה של נוגדנים ספציפיים מחשבים בודדת באמצעות גלילה רציפה. נוגדנים בשם תחום אחד ספציפי שהושג באמצעות גלילה רציפה מאושרות על-ידי נפתחים, אליסה, או מבחני ג'ל-shift. הנוגדנים מחשבים בודדת וכתוצאה מכך יכול לשמש לאחר מכן ישירות או כחלק ריאגנט מהונדסים. השימושים של מחשבים בודדת נוגדן ואת חברי ההנהלה של נוגדן מבוססי מחשבים בודדת לשימושים מבניים הביוכימי, הסלולר, ויוו, טיפולית. מחשבים בודדת נוגדנים יכול להיות מיוצר בכמויות גדולות כמו חומרים במערכות ביטוי prokaryotic, מטוהרים, ולא להשתמש ישירות או ניתן לתכנן להכיל סמני ספציפי או תגיות זה יכול לשמש עיתונאים מחקרים סלולר או בכל אבחון.

פרוטוקול המובאת כאן היה מנוצל ליצירת מחשבים בודדת נוגדנים נגד מגוון רחב של חלבונים אנטיגניים. אנטיגנים חמש נוצלו לכל אלפקה. ניטור מערכת החיסון עולה כי הרוב המכריע של אנטיגנים הראו תגובה חזקה בהתחלה שלושה שבועות (איור 1). גלישות ייצור ובנייה ספריה לאחר כ- 6 שבועות נותן האיזון הטוב ביותר עבור בעלי החיים זה יש מספר אנטיגנים מוזרק. שני סיבובים של גלילה רציפה היו לבצע עבור כל אנטיגן, מבודד מושבות מוקרן (איור 2). רצף של מושבות חיובי לזהות מחשבים בודדת מגוונות רצפי נוגדנים אנטיגנים שונים. לקבלת דוגמאות, שלושה ייחודי שיבוטים היו מבודד אנטיגן הפניה מלטוז מחייב חלבון (MBP) (איור 3 א). כפי לעתים קרובות נצפית, הנוגדנים מחשבים בודדת להכיל רצף משמעותי גיוון CDR3 משתנה מאוד אורך (איור 3). תכונות אלה חשובים במיוחד אינטראקציות אנטיגן נוגדן/מחשבים בודדת כפי שניתן לראות את התייחסות מחשבים בודדת נוגדן/CX3CL1 מורכבים17 (איור 3B).
הרוב המכריע של רצפי נוגדן באורך מלא מחשבים בודדת יכולה להיות הביע וטיהרו -1-10 mg/L של תרבות (איור 4A). בגלל המגוון CDR3 באורך, נוגדנים שונים מחשבים בודדת הצג קל משקל מולקולרי. אישור של איגוד ישירה וביצועים ספציפיות היישום היא קריטית. לדוגמה, לאחר שני סיבובים של הבחירה נגד אנטיגן B, פאנל של מחשבים בודדת היו נוגדנים מזוהה (איור 2). מספר רצפים זהים אותרו, הנוגדן מחשבים בודדת והופק מטוהרים. זה היה לאחר מכן נבדק באמצעות משיכה ישירה למטה עם אנטיגן זיקה שרף, הראה למינון חזקים מחייב (איור 4B). חשוב לציין, הנוגדן מחשבים בודדת הראה לא מחייב לשלוט שרף. נתונים אלה מדגימים של אינטראקציה ישירה מחייב, ואחד זה גם מתאים זיקה לכידת בתבניות נפתחים והן מבוססות על אליסה.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58471/58471fig1.jpg"> איור 1 : ניטור המערכת החיסונית נציג של שני אנטיגנים שונים מציג משמעותי ספציפי התגובה החיסונית אנטיגנים שונים של אותה חיה. אנטיגנים רבים מראים תגובה חזקה מוקדם ככל כשלושה שבועות לאחר חיסון, החל הרוב מראה תגובה מקסימלי לאחר שישה שבועות. שישה שבועות גם מאפשר זיקה ההבשלה, זה הזמן המומלץ עבור ייצור בליד ובידוד B-cell. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58471/58471fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58471/58471fig2.jpg"> איור 2 : אישור מבוססי ה-PCR של שיבוטים חיובי. תחל span של MCS של וקטור pMES4, ומייצרת שיבוט nanobody חיובי של אמפליקון ~ 500 bp (המסומנים *). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58471/58471fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58471/58471fig3.jpg"> איור 3 : אנטיגן ספציפי רצפי האר אלפקה מחשבים בודדת נוגדן גיוון. יישור (A) של מחשבים בודדת בחר נוגדן רצפי מבודדת כדי MBP עם 4XT1 נוגדנים מחשבים בודדת של הפניה, עם מסגרת ואזורים שקובעים משלימים את החסר (Kabat) מסומן להלן. (B) המבנה של אלפקה מחשבים בודדת נוגדן 4XT1 קשור CX3CL1 (PDB 4XT1), הדגשת תפקיד קריטי CDR משתנה לולאות באיגוד אנטיגן ספציפי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58471/58471fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58471/58471fig4.jpg"> איור 4 : טיהור ובדיקת נוגדנים מחשבים בודדת. (א) מרחביות עמודים של נוגדנים מחשבים בודדת IMAC מטוהרים, השוואה בין מחשבים בודדת מגוונות נוגדנים. משקל מולקולרי שונה הם בעיקר בשל אורך בדרגות שונות של הלולאה CDR3. רמות שונות של ביטוי גם הן נצפו, עם מיעוט של נוגדנים מחשבים בודדת מראה עניים התשואות של חלבון מטוהרים. (B) אימות של כריכת ישירה זיקה אנטיגן נפתחים. איגוד נוגדנים חזקים למינון מחשבים בודדת הוא ציין שרף מצמידים אנטיגן אבל לא עם שליטה שרף. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58471/58471fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

שיטה לייצור מחשבים בודדת בנוגדנים אלפקות, כולל חיסון, איסוף דם, בידוד תאי B והבחירה מתואר.

In this manuscript, a method for the immunization of alpaca and the use of molecular biology methods to produce antigen-specific single domain antibodies ...

השיטות שאנו מתארים כאן אומצו על ידי NIH COBRE בחסות NIH שלנו, אוניברסיטת קנטאקי חלבון ליבה מתקן כדי לעזור לחוקרים לייצר נוגדנים חד תחום באלפקות. נוגדנים חד-תחומיים הם כלי חשוב המשמש למענה על שאלות מפתח במחקר ביו-רפואי. היתרון העיקרי של הטכניקות שאנו מדגימים הוא שהיא מאפשרת ייצור נוגדנים חד-תחומיים עד חמישה חלבונים נפרדים באלפקה אחת.ההשלכות של טכניקה זו חלות על בריאות האדם וטיפול במחלות, שכן נוגדנים חד-תחומיים אלה יכולים לשמש כטיפולים, כחיסונים וכאביון. המכשול המשמעותי ביותר עבור רוב החוקרים הביו-רפואיים המבוססים הוא טיפול בבעלי חיים גדולים, כגון האלפקה. הדגמה חזותית של טיפול באלפקה, הזרקת אנטיגנים ואיסוף דם, הם קריטיים לייצור מוצלח של נוגדנים חד-תחומיים בגמלים אלה.הדגמת ההליך תהיה ד"ר ג'ף סמיילי, וטרינר אוניברסיטה, גב 'קתי בועז, טכנאי וטרינרי, וגברת ארין ג'ונס, טכנאית חיות מעבדה. טיפול בדם יוכח על ידי ד"ר מרטין צ'או, עמית מחקר. הסיפורים האמיתיים של ההפקה הזו הם עיניים כחולות, ילד גדול, או ידוע בחיבה כגורילה, ופרדי, האלפאקות שלנו בקנטאקי.כדי להתחיל, לרסן את החיה עם עצירה ועופרת. ואז לקצץ את השיער של האלפקה עם קוצץ חשמלי בתבנית ירח חצי סהר לאורך הבסיס של צווארו, מכתף לכתף. בזהירות להחזיק את האלפקה על ידי הראש והצוואר, ולאט לאט להזריק את האנטיגנים תת עורית עם מחט 22 מד לאורך בסיס הצוואר, ליד בלוטות הלימפה קשת.בצע חמש זריקות של כ 200 microliters כל אחד, כחמישה סנטימטרים זה מזה. לאחר מכן, לפקח על החיה במשך כ 20 דקות עבור סימנים של אנפילקסיס. בדוק את אתר ההזרקה לדלקת מקומית באתרי ההזרקה מדי שבוע.כדי למשוך דם, קליפת השיער של האלפקה ולחטא את אתר האוסף עם ספוגיות אלכוהול. לרסן את האלפקה בעדינות, להבטיח כי הצוואר מוחזק זקוף וישר. באמצעות תחזיות הגחון של התהליך הרוחבי של החוליות כציון דרך, occlude את הוריד על ידי הפעלת לחץ רק מתווך לתהליך הגחון.לאחר מכן, הכנס את המחט בזווית של 45 מעלות, מעט מתווך להקרנה, לכיוון מרכז הצוואר. לתפעל את המחט עד שהדם יזרום. ראשית, לדלל 15 מיליליטר של הדם שנאסף עם חמישה מיליליטר של PBS.לאחר מכן, דם פיפטה לתוך צינור הפרדת לימפוציטים כדי לבודד לימפוציטים בדם היקפיים, או PBLs, באמצעות צנטריפוגה שיפוע צפיפות. מוציאים בעדינות את שכבת הפלזמה העליונה, שומרים אותה בצינור נפרד. לאחר מכן, להסיר בעדינות את שכבת PBL, ולהעביר אותו צינור סטרילי 50 מיליליטר.מוסיפים 45 מיליליטר של PBS מקורר מראש ל- PBLs ומסובבים את הצינור במשך 20 דקות במהירות של פי 800 G וארבע מעלות צלזיוס. הסר את supernatant עם פיפטה, משאיר את גלולה המכילה את הלימפוציטים. לשטוף את גלולה פעמיים נוספות עם חמישה מיליליטר של PBS מקורר מראש כדי מוכן PBLs לבידוד RNA.באמצעות פרוטוקול זה, נוגדנים חד-תחומיים נוצרו כנגד מגוון של אנטיגנים חלבוניים. ניטור המערכת החיסונית הצביע על כך שרוב האנטיגנים הראו תגובה חזקה החל משלושה שבועות, כי הזמן האופטימלי להשיג דם הוא שישה שבועות. רצף המושבות החיוביות זיהה רצפי נוגדנים מגוונים חד-תחומיים לאנטיגנים שונים.לדוגמה, שלוש מושבות ייחודיות בודדו לחלבון מחייב אנטיגן מלטוז. בדרך כלל, הנוגדנים החד-תחומיים הכילו מגוון רצפים משמעותי ואורך משתנה מאוד של לולאות מחייבות אנטיגן. תכונות אלה חשובות במיוחד באינטראקציות אנטיגן נוגדנים חד-תחומיות.הליך זה מאפשר ייצור נוגדנים חד-תחומיים עבור עד חמישה אנטיגנים לכל בעל חיים. אוסף דם יחיד, ובניית ספרייה, מנוצל עבור כל בעל חיים. עם בחירה מבוססת תצוגה פאג' מנוצלת לזיהוי נוגדנים ספציפיים לאנטיגן, בעלי שרשרת אחת.בעת ביצוע זריקות אנטיגן ודגימת דם, חשוב לשמור על האלפקה בקבוצה, אשר שומר אותם רגועים יותר. ניתן לעשות זאת באמצעות עצירות והפניות, וקשירתם בסמיכות במהלך ההליכים.

immunization-alpacas-lama-pacos-with-protein-antigens-production

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

זנים מסוימים עכבר מסוגלים לעמוד בפני גיוס של Encephalomyelitis אוטואימונית ניסויית (EAE) עם חלבון המיאלין הבסיסי. המתואר כאן הוא פרוטוקול חיסון פשוט הופך את חוסר התגובה וגורם למחלת שיתוק בכמה כתמים אופייניים EAE עכבר עמידים.

התגברות על חוסר התגובה של ניסיוני אוטואימוניות Encephalomyelitis (EAE) זנים עמידים עכבר ידי העברת המאמצת אתגר אנטיגני

חיסון המניעה והטיפולי לעתים קרובות לא מצליח לעורר תגובה חיסונית חזקה בשל ניקוז שבוע של החיסון לבלוטות הלימפה ומעורבות עניות וכתוצאה מכך של תאים חיסוניים. על ידי הזרקה ישירה של חיסון לבלוטות הלימפה, הזרקת intralymphatic כביכול, יעילות חיסון ניתן לשפר מאוד וניתן להפחית מינוני חיסון.

Intralymphatic חיסוני וחיסון בעכברים

מוצג פרוטוקול אופטימלי ליצירת נוגדנים חד-שבטיים המבוססים על טכנולוגיית ההיברידומה. עכברים חוסנו בחומר חיסוני. תאי הטחול התמזגו על ידי PEG ודחף חשמלי עם תאי מיאלומה אלמותיים. תאי היברידומה המייצרים נוגדנים נבחרו על ידי HAT ובדיקת ELISA ספציפית לאנטיגן.

הדור של Murine חד-שבטיים נוגדנים על ידי Hybridoma טכנולוגיה

מאמר זה מספק נוהל מפורט על ההכנה ועל הערכה של נוגדנים חד-שבטיים כנגד מוצרים טבעיים לשימוש immunoassays שונים. הליך זה כולל חיסונים, תא היתוך, עקיף ELISA תחרותי שיבוט חיובי ההקרנה, ליפידים monoclonal הכנה. המפרט עבור אפיון נוגדנים באמצעות MALDI-תוף-MS וניתוחים אליסה הינם גם מסופקים.

דור של נוגדנים חד-שבטיים כנגד מוצרים טבעיים

המתואר הוא הכנת חלקיקים liposomal antigenic והשימוש שלהם עירור תאי B הפעלה במבחנה וב -vivo. תגובות נוגדנים חזקים ועקביים הוביל את הפיתוח של מודל חדש של אלרגיה לבוטנים. הפרוטוקול עבור יצירת ליפוזומים antigenic ניתן להרחיב אנטיגנים שונים ומודלים חיסונים.

ליפוזומים antigenic לדור של נוגדנים מחלות ספציפיות

הפיתוח של אינטרפרון-גמא ELISpot וזמינותו של שפן PBMCs מאפשרת אפיון T-cell תגובות במודל זה מאוד רלוונטי ללימוד מחלות זיהומיות. לנו יש להחיל וזמינותו כדי למדוד את תא T תגובות המשויכות intradermal משלוח של חיסונים DNA.

אופטימיזציה אינטרפרון-גמא ELISpot Assay מידה תגובות תא T במודל שפן לאחר החיסון

הבדיקה האופסונו-דבקות היא שיטה חלופית למבצע ההרג האופוסונו-פאגוציטי כדי להעריך את הפונקציות האופסיוניות של נוגדנים בפיתוח חיסונים.

Opsono-דבקות Assay כדי להעריך נוגדנים תפקודיים בפיתוח חיסונים נגד אנתרקיס Bacillus ופתוגנים אנקפסולציה אחרים

מאמר זה מתאר ומדגים את ניהול החיסונים התוך-אנלתיים ואת איסוף החלב מארנבים מניקים (Oryctolagus cuniculus) כאמצעי להערכת חסינות הרירית במודל מתאים מבחינה תרגומית של חיסון אימהי.

חיסון תוך-כלי ואוסף חלב במחקרים על חיסון אימהי בארנבים הלבנים של ניו זילנד (Oryctolagus cuniculus)

חלבון הנוגדן הרקומביננטי המתבטא בתאי pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO ובנוגדנים חד-שבטיים המיוצרים בטכנולוגיית היברידימה מסורתית יכול לזהות ולהיקשר לחלבון אמינופפטידאז N (APN) חזירי.

ייצור נוגדנים חד-שבטיים המכוונים לאמינופפטידאז N באפיתל רירית המעי החזירי

כאן, אנו מציגים פרוטוקול חלופי לגרימת אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית בעכברי C57BL/6, תוך שימוש בגליקופרוטאין מיאלין אוליגודנדרוציטים (MOG)35-55 אפיטופ אימונוגני המושהה באדג'ובנט של פרוינד המכיל את תת-המין Mycobacterium avium  paratuberculosis שהומת בחום.

פעילות אדג'ובנטית של Mycobacterium paratuberculosis בשיפור האימונוגניות של אוטואנטיגנים במהלך אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית

למדו שיטה לייצור נוגדנים תחום יחיד באלפקות באמצעות חיסון אנטיגנים ובידוד לימפוציטים. הטכניקה מאפשרת ייצור נוגדנים נגד עד חמש חלבונים שונים מאלפקה אחת ליישומים ביורפואיים.

חיסונים של האלפקות (לאמה pacos) עם חלבונים אנטיגניים וייצור נוגדנים תחום יחיד אנטיגן ספציפי

גלה סרטונים נוספים