Name: בשילוב שינויים Capsid גנטי וכימי של וקטורים המבוסס על אדנו העברה גנטית עבור הגנה ומיקוד (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: חקור שינוי כיפתיים של אדנו באמצעות כימיה פשוטה להבנת אינטראקציות וקטור-מארח. שיטה זו תורמת לפיתוח טיפולי גן, אונקוליזה וחיסונים גנטיים מותאמים אישית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Benko, M., Harrach, B. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-3-662-05597-7_1">Molecular evolution of adenoviruses.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. , 3-35 (2003).</li>
<li>Davison, A. J., Benko, M., Harrach, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+content+and+evolution+of+adenoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetic+Virology%22%5BJournal%5D)">Genetic content and evolution of adenoviruses.</a> Journal of Genetic Virology. 84, 2895-2908 (2003).</li>
<li>Rowe, W. P., Huebner, R. J., Gilmore, L. K., Parrott, R. H., Ward, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+cytopathogenic+agent+from+human+adenoids+undergoing+spontaneous+degeneration+in+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Society+for+Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Isolation of a cytopathogenic agent from human adenoids undergoing spontaneous degeneration in tissue culture.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 84, New York, N.Y. 570-573 (1953).</li>
<li>van Oostrum, J., Burnett, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+composition+of+the+adenovirus+type+2+virion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Molecular composition of the adenovirus type 2 virion.</a> Journal of Virology. 56, 439-448 (1985).</li>
<li>Stewart, P. L., Fuller, S. D., Burnett, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Difference+imaging+of+adenovirus%3A+bridging+the+resolution+gap+between+X-ray+crystallography+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22TheEMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Difference imaging of adenovirus: bridging the resolution gap between X-ray crystallography and electron microscopy.</a> TheEMBO Journal. 12, 2589-2599 (1993).</li>
<li>Stewart, P. L., Burnett, R. M., Cyrklaff, M., Fuller, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+reconstruction+reveals+the+complex+molecular+organization+of+adenovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Image reconstruction reveals the complex molecular organization of adenovirus.</a> Cell. 67, 145-154 (1991).</li>
<li>Meier, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+triggers+macropinocytosis+and+endosomal+leakage+together+with+its+clathrin-mediated+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Adenovirus triggers macropinocytosis and endosomal leakage together with its clathrin-mediated uptake.</a> Journal of Cellular Biology. 158, 1119-1131 (2002).</li>
<li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coagulation+factor+X+shields+adenovirus+type+5+from+attack+by+natural+antibodies+and+complement%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Coagulation factor X shields adenovirus type 5 from attack by natural antibodies and complement.</a> Nature Medicine. 19, 452-457 (2013).</li>
<li>Qiu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+natural+IgM+concentration+on+gene+therapy+with+adenovirus+type+5+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Impact of natural IgM concentration on gene therapy with adenovirus type 5 vectors.</a> Journal of Virology. 89, 3412-3416 (2015).</li>
<li>Alemany, R., Suzuki, K., Curiel, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+clearance+rates+of+adenovirus+type+5+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetic+Virology%22%5BJournal%5D)">Blood clearance rates of adenovirus type 5 in mice.</a> Journal of Genetic Virology. 81, 2605-2609 (2000).</li>
<li>Smith, J. S., Xu, Z., Tian, J., Stevenson, S. C., Byrnes, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+systemically+delivered+adenovirus+vectors+with+Kupffer+cells+in+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Interaction of systemically delivered adenovirus vectors with Kupffer cells in mouse liver.</a> Human Gene Therapy. 19, 547-554 (2008).</li>
<li>Schiedner, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hemodynamic+response+to+intravenous+adenovirus+vector+particles+is+caused+by+systemic+Kupffer+cell-mediated+activation+of+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">A hemodynamic response to intravenous adenovirus vector particles is caused by systemic Kupffer cell-mediated activation of endothelial cells.</a> Human Gene Therapy. 14, 1631-1641 (2003).</li>
<li>Xu, Z., Tian, J., Smith, J. S., Byrnes, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+adenovirus+by+Kupffer+cells+is+mediated+by+scavenger+receptors%2C+natural+antibodies%2C+and+complement%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Clearance of adenovirus by Kupffer cells is mediated by scavenger receptors, natural antibodies, and complement.</a> Journal of Virology. 82, 11705-11713 (2008).</li>
<li>Khare, R., Reddy, V. S., Nemerow, G. R., Barry, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+adenovirus+serotype+5+hexon+regions+that+interact+with+scavenger+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Identification of adenovirus serotype 5 hexon regions that interact with scavenger receptors.</a> Journal of Virology. 86, 2293-2301 (2012).</li>
<li>Piccolo, P., Annunziata, P., Mithbaokar, P., Brunetti-Pierri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SR-A+and+SREC-I+binding+peptides+increase+HDAd-mediated+liver+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">SR-A and SREC-I binding peptides increase HDAd-mediated liver transduction.</a> Gene Therapy. 21, 950-957 (2014).</li>
<li>Plüddemann, A., Neyen, C., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+scavenger+receptors+and+host-derived+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+%28San+Diego%2C+Calif%29%22%5BJournal%5D)">Macrophage scavenger receptors and host-derived ligands.</a> Methods (San Diego, Calif). 43, 207-217 (2007).</li>
<li>Ganesan, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+clearance+of+blood-borne+virus+by+liver+sinusoidal+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogen%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient clearance of blood-borne virus by liver sinusoidal endothelium.</a> PLoS Pathogen. 7, e1002281(2011).</li>
<li>Cichon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Titer+determination+of+Ad5+in+blood%3A+a+cautionary+note%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Titer determination of Ad5 in blood: a cautionary note.</a> Gene Therapy. 10, 1012-1017 (2003).</li>
<li>Carlisle, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+erythrocytes+bind+and+inactivate+type+5+adenovirus+by+presenting+Coxsackie+virus-adenovirus+receptor+and+complement+receptor+1%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human erythrocytes bind and inactivate type 5 adenovirus by presenting Coxsackie virus-adenovirus receptor and complement receptor 1.</a> Blood. 113, 1909-1918 (2009).</li>
<li>Waddington, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+serotype+5+hexon+mediates+liver+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Adenovirus serotype 5 hexon mediates liver gene transfer.</a> Cell. 132, 397-409 (2008).</li>
<li>Kalyuzhniy, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenovirus+serotype+5+hexon+is+critical+for+virus+infection+of+hepatocytes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Adenovirus serotype 5 hexon is critical for virus infection of hepatocytes in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 105, 5483-5488 (2008).</li>
<li>Vigant, F., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1525001616322833">Substitution of hexon hypervariable region 5 of adenovirus serotype 5 abrogates blood factor binding and limits gene transfer to liver. Molecular Therapy.</a> The Journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 1474-1480 (2008).</li>
<li>Jonsson, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coagulation+factors+IX+and+X+enhance+binding+and+infection+of+adenovirus+types+5+and+31+in+human+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Coagulation factors IX and X enhance binding and infection of adenovirus types 5 and 31 in human epithelial cells.</a> Journal of Virology. 83, 3816-3825 (2009).</li>
<li>Bradshaw, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirements+for+receptor+engagement+during+infection+by+adenovirus+complexed+with+blood+coagulation+factor+X%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogen%22%5BJournal%5D)">Requirements for receptor engagement during infection by adenovirus complexed with blood coagulation factor X.</a> PLoS Pathogen. 6, e1001142(2010).</li>
<li>Duffy, M. R., Bradshaw, A. C., Parker, A. L., McVey, J. H., Baker, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cluster+of+basic+amino+acids+in+the+factor+X+serine+protease+mediates+surface+attachment+of+adenovirus%2FFX+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">A cluster of basic amino acids in the factor X serine protease mediates surface attachment of adenovirus/FX complexes.</a> Journal of Virology. 85, 10914-10919 (2011).</li>
<li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coagulation+factor+X+shields+adenovirus+type+5+from+attack+by+natural+antibodies+and+complement%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Coagulation factor X shields adenovirus type 5 from attack by natural antibodies and complement.</a> Nature Medicine. 19, 452-457 (2013).</li>
<li>Prill, J. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modifications+of+adenovirus+hexon+allow+for+either+hepatocyte+detargeting+or+targeting+with+potential+evasion+from+Kupffer+cells.+Molecular+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Modifications of adenovirus hexon allow for either hepatocyte detargeting or targeting with potential evasion from Kupffer cells. Molecular Therapy.</a> The Journal of the American Society of Gene Therapy. 19, 83-92 (2011).</li>
<li>Zaiss, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+Heparan+Sulfate+Is+Required+for+Adeno-Associated+Virus+2+but+Dispensable+for+Adenovirus+5+Liver+Transduction+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte Heparan Sulfate Is Required for Adeno-Associated Virus 2 but Dispensable for Adenovirus 5 Liver Transduction In Vivo.</a> Journal of Virology. 90, 412-420 (2015).</li>
<li>Delgado, C., Francis, G. E., Fisher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+uses+and+properties+of+PEG-linked+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Therapeutic+Drug+Carrier+Systems%22%5BJournal%5D)">The uses and properties of PEG-linked proteins.</a> Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems. 9, 249-304 (1992).</li>
<li>Parveen, S., Sahoo, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomedicine%3A+clinical+applications+of+polyethylene+glycol+conjugated+proteins+and+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Pharmacokinet%22%5BJournal%5D)">Nanomedicine: clinical applications of polyethylene glycol conjugated proteins and drugs.</a> Clin. Pharmacokinet. 45, 965-988 (2006).</li>
<li>O'Riordan, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEGylation+of+adenovirus+with+retention+of+infectivity+and+protection+from+neutralizing+antibody+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">PEGylation of adenovirus with retention of infectivity and protection from neutralizing antibody in vitro and in vivo.</a> Human Gene Therapy. 10, 1349-1358 (1999).</li>
<li>Subr, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coating+of+adenovirus+type+5+with+polymers+containing+quaternary+amines+prevents+binding+to+blood+components%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Coating of adenovirus type 5 with polymers containing quaternary amines prevents binding to blood components.</a> Journal of Controlled Release. 135, 152-158 (2009).</li>
<li>Kreppel, F., Gackowski, J., Schmidt, E., Kochanek, S. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1525001605001012">Combined genetic and chemical capsid modifications enable flexible and efficient de- and retargeting of adenovirus vectors. Molecular Therapy.</a> The Journal of the American Society of Gene Therapy. 12, 107-117 (2005).</li>
<li>Corjon, S., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S152500161632679X">Targeting of adenovirus vectors to the LRP receptor family with the high-affinity ligand RAP via combined genetic and chemical modification of the pIX capsomere.</a> Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 16 (11), 1813-1824 (2008).</li>
<li>Prill, J. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modifications+of+adenovirus+hexon+allow+for+either+hepatocyte+detargeting+or+targeting+with+potential+evasion+from+Kupffer+cells.+Molecular+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Modifications of adenovirus hexon allow for either hepatocyte detargeting or targeting with potential evasion from Kupffer cells. Molecular Therapy.</a> The Journal of the American Society of Gene Therapy. 19, 83-92 (2011).</li>
<li>Krutzke, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substitution+of+blood+coagulation+factor+X-binding+to+Ad5+by+position-specific+PEGylation%3A+Preventing+vector+clearance+and+preserving+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Substitution of blood coagulation factor X-binding to Ad5 by position-specific PEGylation: Preventing vector clearance and preserving infectivity.</a> Journal of Controlled Release. 235, 379-392 (2016).</li>
<li>Prill, J. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traceless+bioresponsive+shielding+of+adenovirus+hexon+with+HPMA+copolymers+maintains+transduction+capacity+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Traceless bioresponsive shielding of adenovirus hexon with HPMA copolymers maintains transduction capacity in vitro and in vivo.</a> PloS One. 9, e82716(2014).</li>
<li>Kratzer, R. F., Kreppel, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production%2C+Purification%2C+and+Titration+of+First-Generation+Adenovirus+Vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Production, Purification, and Titration of First-Generation Adenovirus Vectors.</a> Methods in Molecular Biology. , Clifton, NJ. 377-388 (2017).</li>
<li>Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/elps.1150080203">Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels.</a> ELECTROPHORESIS. 8, 93-99 (1987).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

היעילות שבה cysteines גנטית הציג יכול להיות מבחינה כימית שונה בדרך כלל 80-99%, משתנים מסוימים להשפיע על יעילות זו. קודם כל, זה בעל חשיבות עליונה כי cysteines גנטית הציג אינם עוברים חמצון מוקדמת. בעת היותו מוגן בסביבה תוך צמצום של התאים מפיק, זה חובה לספק סביבה שאינם חמצוני לאחר שחרור חלקיקים וקטור מתאי מפיק ובמהלך שינוי כימי. למטרה זו, הפחתת ריאגנטים יכול לשמש בריכוזים מ 0.1-10 מ מ, יש צורך להשתמש ריאגנטים תוך צמצום שאינן מכילות קבוצות תיול, אשר ברצון להגיב עם תרכובות לפעיל על-maleimide. שנית, בעת שימוש תרכובות maleimide...

Adenoviruses (Ad), בני משפחת Adenoviridae, הם שאינו אפוף וירוסי דנ א של יותר מ-70 סוגים אשר עד כה מזוהה (http://hadvwg.gmu.edu). בהתאם hemaglutination מאפיינים, מבנה הגנום ותוצאות רצף, ניתן לחלק את סוגי 70 לספירה שבעת המינים (האנושית adenoviruses A עד G)1,2. הגנום האנושי מודעה בגודל של 38 kb, כמוס icosahedral nucleocapsid3. בשל שפע שלהם, capsid חלבון קללה, זה בסיס פנטון, סיבים כל מכונים capsid הגדולות חלבונים. שופע והגדול ביותר capsid חלבון קללה, זה יוצר היבטים capsid 20, שכל אחד מהם מורכב של 12 קללה, זה homotrimers4,5. פנטון, הממוקם בקצה כל icosahedral (קודקוד), מורכב pentamers של הבסיס פנטון ומייצג את הבסיס טינה קודקוד הבנוי של glycosylated סיב trimers5,6. ערך מקורי של תא לספירה מורכב בעצם שני שלבים עיקריים. ראשית, הידית סיבים נקשר לקולטן העיקרי. המודעה סוגי זנים A, C, E ו- F, זהו הקולטן coxsackie, אדנו (מכונית). אינטראקציה זו מביא את virion לתוך קרבה מרחבית את פני השטח של התא, ובכך להקל על אינטראקציות בין הסלולר אינטגרינים מוטיב RGD פנטון הבסיס, כתוצאה מכך גרימת תגובות הסלולר. שנית, להוביל לשינויים שלד התא הפנמה של virion ושל התחבורה ביותר אנדוזום7. בעת פירוק חלקי ב אנדוזום, virion הוא שוחרר אל הציטופלסמה und בסופו של דבר עובר את הגרעין לצורך שכפול.
בעוד המודעה יכולה להיות מועברת באופן מקומי (למשל., לקבלת חיסון גנטי), מערכתי משלוח דרך מחזור הדם כנדרש על onco-virotherapy פונה מספר מחסומים. בעוד במחזור הדם, virions מוזרק נתקלים מערכת ההגנה של מערכת החיסון של המחשב המארח, שמוביל נטרול מהיר של הווקטורים מבוסס-וירוס ובעיבוד וקטורים המבוסס על המודעה יעיל מאוד ביישומים מערכתית. יתר על כן, hepatotropism הטבעית של Ad מפריע משלוח מערכתית, חייבות להיפתר לנתב מחדש המודעה שלה התאים היעד החדש.
מקודד Germline נוגדנים IgM הטבעית של מערכת החיסון המולדת במהירות מזהה, לאגד מבנים מאוד חוזרות על פני8,virion9. אלה מכלולי המערכת החיסונית ואז להפעיל את המסלולים קלאסית וקלאסי של מערכת המשלים, שמוביל מהר המשלים בתיווך ניטרול של חלק גדול virions8. שביל השנייה וכתוצאה מכך הסרת העיקריים של Ad virions מתווכת על-ידי מקרופאגים10 , המשויך חריפה ולא הקרדיאלי תופעות לוואי11,12. במקרה של המודעה בפרט, Kupffer תאים המתגוררים הכבד לאגד ולהתחיל phagocytically Ad virions ויה נבלות ספציפי הקולטנים, ובכך לחסל אותם מן הדם13,14,15 . קולטנים ספציפיים נבלות גם זוהו תאי אנדותל sinusoidal הכבד (LSE תאים)16, ונראה LSE תאים גם תורמת וקטורית חיסול17, אלא באיזו מידה עדיין צריך הבהרה. יתר על כן, חלק מסוגי לספירה ווקטורים נגזר שלהם הם ביעילות מבודדות על ידי האדם אריתרוציטים18 שאליו הם לוחצים באמצעות מכונית או הקולטן המשלים CR119. ראוי לציין, מנגנון sequestering זה לא ניתן לחקור במערכת מודל העכבר כמו בניגוד אריתרוציטים אנושי, אריתרוציטים העכבר לא מבטא את המכונית.
נוגדנים ספציפיים נגד לספירה שנוצר על ידי מערכת החיסון מסתגלת לאחר חשיפה לספירה עקב זיהומים הקודם עם המודעה או או לאחר המשלוח הראשון ביישומים מערכתית הרימו מכשול נוסף לשימוש יעיל של וקטורים לספירה, הם צריכים להיות התחמק ב משלוח מערכתית יעילה.
לבסוף, hepatotropism חזק המודעה בסוגים מסוימים (כולל Ad5) קשות מעכבת היישום של המודעה בטיפול מערכתי. זה tropism וכתוצאה מכך hepatocyte התמרה חושית הוא בזיקה גבוהה של virion המודעה כדי דם קרישה פקטור X (FX), מתווכת על ידי האינטראקציה של FX עם Ad קללה, זה חלבון20,21,22. FX מגשרת את virion כדי הפרין סולפאט glycans (HSPGs) על פני hepatocytes20,23,24,25. גורם מכריע עבור אינטראקציה זו נראה במידה מסוימת של N -, O-sulfation של HSPGs תאי כבד24, אשר היא נבדלת HSPGs על סוגי תאים אחרים. בנוסף מסלול זה בתיווך FX, מחקרים שנעשו לאחרונה מראים עוד יותר מסלולים עדיין לא זיהו כי התוצאה ב- Ad התמרה חושית של hepatocytes26,27,28.
לאחרונה, הוכח כי FX לא רק מעורב hepatocyte התמרה חושית של Ad, אך גם על-ידי איגוד, שילדס virion החלקיק וירוס נגד ניטרול על ידי מערכת המשלים26. הפחתה של התמרה חושית hepatocyte על-ידי מניעת איגוד FX, לכן, ליצור תופעת לוואי בלתי רצויות של הגדלת לספירה ניטרול באמצעות מערכת החיסון המולדת.
ידיעה עמוקה של אינטראקציות מורכבות בין וקטורים ואורגניזמים מארח ולכן יש צורך לפתח וקטורים יעיל יותר עבור יישומים מערכתית לעקוף את המכשולים שהוטלו על ידי האורגניזם של המחשב המארח.
אסטרטגיה אחת שבה השתמשו במקור חלבונים טיפולית כבר מותאם לספירה וקטורים לפחות חלקית להתגבר על המחסומים שתואר לעיל. Antigenicity ו- immunogenicity של תרכובות טיפולית חלבון יכול להיות מופחת על ידי צימוד כדי פוליאתילן גליקול (PEG)29,30. לפיכך, המושבים קוולנטיות של פולימרים כגון פג או פולי [N-(2-hydroxypropyl) methacrylamid] (pHPMA) כדי capsid השטח ומגנים הווקטור של אינטראקציות וקטור לא רצויים-המארח. בדרך כלל, פולימר צימוד מטרות חדוה-אמין קבוצות מכל שאריות בצד ליזין המופצים באופן אקראי על פני capsid. וקטור חלקיקים בתמיסה, בשל אופיו הידרופילית משושמים המצורפת, מוקפים פגז מים יציבים זה מפחית את הסיכון של תאים חיסוניים הכרה או השפלה אנזימטיות. יתר על כן, וקטורים PEGylated לספירה הוצגו להתחמק ניטרול באמצעות אנטי-קללה, זה נוגדנים במבחנה , עכברים מראש לחסן ויוו31. בניגוד שינויים גנטיים capsid, צימוד כימי של פולימרים מתבצע לאחר ייצור, טיהור, ומאפשר לא רק לשימוש של מפיק קונבנציונאלי תאים וייצור של מניות וקטור כייל נוגדנים גבוה, אלא גם עבור בו זמנית שינוי של אלפי חומצות אמינו על פני capsid. עם זאת, מכוון amine מיגון מתרחשת באופן אקראי לאורך כל השטח capsid כולו, וכתוצאה מכך heterogeneities גבוהה, לא מאפשר שינוי של capsomers ספציפיים. יתר על כן, moieties פולימר גדול הדרושים עבור השפעות מועילות לפגום וירוס אתריים32.
כדי להתגבר על מגבלות אלה, Kreppel et al. 33 הציג תפיסה geneti-כימית עבור וקטור re - ואני מבטל את המיקוד. Cysteines שהוכנסו גנטית capsid וירוס החשופים הממס ומעמדות כמו סיבים HI-לולאה33, חלבון התשיעי34, קללה, זה35,36. אמנם יכול להיות מיוצר לא-טבעי, ציסטאין מניבי וקטורים Ad-titers גבוהה בתאים נורמליים הפקה. חשוב, החדרת cysteines capsomers מסוימים, עמדות שונות בתוך capsomer יחיד מאפשר שינויים ספציפי מאוד של תיול moieties קבוצה ראקטיבית. גישה geneti-כימית זו הוכח כדי להתגבר על מכשולים רבים בעיצוב וקטור לספירה. השילוב של מבוסס-אמין PEGylation detargeting, המבוסס על תיול זיווג transferrin על הידית סיבים ש-HI-לולאה הוכח כדי בהצלחה ייעד מחדש ששינה לספירה וקטורים חשוכת-הרכב התאים33. מאז קללה, זה מעורב אינטראקציות בלתי רצויה ביותר (נטרול נוגדנים, הגורם דם FX), המבוסס על תיול שינוי אסטרטגיות הוחלו גם על קללה, זה. צימוד moieties פג קטן כדי HVR5 של קללה, זה מנע חלקיקי וקטור לספירה מגלי SKOV-3 תאים בנוכחות FX, ואילו moieties פג גדול גדל hepatocyte-התמרה חושית-14,-35. המודעה וקטור חלקיקים נשיאת מוטציות בהידית סיבים עיכוב רכב מחייב וב -HVR7 מעכבים קשירה של FX (ו cysteines ברינג שנוספו ב- HVR1 עבור מיקום ספציפי PEGylation) הראו להם להתחמק נוגדן, המשלים-בתיווך ניטרול, כמו גם נבלות קולטן בתיווך ספיגת ללא הפסד של infectivity. מעניין, למרות חוסר המגן FX טבעי, PEGylation שוב שיפור התמרה חושית של hepatocytes כפונקציה של גודל פג36. עם זאת, זה הוצג כי מיגון קוולנטיות יש השפעה על תהליכים תאיים לסחר בבני אדם. Prill et al. לעומת בלתי הפיכות נגד bioresponsive מגינים על סמך pHPMA והפגינו כי גם את מצב תשלום מיגון ולא שותף פולימר הייתה השפעה על כניסת התא אך השפיעה חלקיקים סחר את הגרעין. העסקת מגן bioresponsive עם pHPMA הטעון חיובית פולימרים שיתוף המותר עבור חלקיקים סחר את הגרעין, שמירה על חיסכון התמרה חושית גבוהה של המודעה המומנט במבחנה , ויוו37.
לסיכום, נתונים אלה מציינים כי, אפילו תחת ההנחה כי כל וקטור-מארח-האינטראקציות היו ידועים ונחשבים, שינויים משטח capsid מופרז חיוניים להתגבר על המכשולים הקשורים עם משלוח וקטור מערכתית.
כאן אנו מספקים פרוטוקול כדי לבצע שינויים כימיים בייעודי לאתר של capsids וקטור אדנו מיגון ו/או retargeting של חלקיקים וקטור אדנו ווירוסים oncolytic המבוסס על אדנו. הרעיון של טכנולוגיה זו מחולקת לרמות באיור1. היא מאפשרת מיגון של אזורים מסוימים capsid של אינטראקציות בלתי רצויות על ידי קוולנטיות מצורף של פולימרים סינתטיים. באותו, הוא גם מספק אמצעי כדי לצרף ליגנדים ולשלב הגנה ומיקוד. באמצעות כימיה פשוטה, ניסויים תהיה אפשרות לשינוי covalently משטח וקטור אדנו עם מגוון רחב של מולקולות כולל פפטידים/חלבונים, פחמימות, שומנים, ומולקולות קטנות אחרות. יתר על כן, הפרוטוקול מספק קונספט כללי שינוי כימי של וקטורים נגזר וירוס פעילים ביולוגית תחזוקה של שלמות הביולוגי שלהם פעילות.

<table><tbody><tr><td><חזק>טיהור וקטור ושינוי כימי</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ארגון גז</td><td>אוויר נוזלי</td><td>סוחר</td><td></td>גז מקומי</tr><tr><td>חנקן נוזלי</td><td>אוויר נוזלי</td><td>סוחר</td><td></td>גז מקומי</tr><tr><td>500 מ"ל צינורות צנטריפוגה</td><td>קורנינג</td><td>431123</td><td></td></tr><tr><td>סטריקאפ אקספרס פלוס 0.22 ומיקרו; m</td><td>Millipore</td><td>SCGPU02RE</td><td></td></tr><tr><td>Tris(2-carboxyethyl) פוספין (TCEP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4706-10g</td><td></td></tr><tr><td>2 מ"ל (3 מ"ל) Norm Ject (מזרקים)</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4020.000V0</td><td></td></tr><tr><td>מחטים עדינות לשימוש חד פעמי (צהוב 0.9 x 40 מ"מ)</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4710009040</td><td></td></tr><tr><td>צזיום כלוריד 99.999% איכות גבוהה</td><td>במיוחד Roth</td><td>8627.1</td><td></td></tr><tr><td>חרוזי סיליקה ג'ל</td><td>Applichem</td><td>A4569.2500</td><td></td></tr><tr><td>מתוקסיפוליאתילן גליקול מלימיד - 750 (PEG mal-750)</td> <td>איריס ביוטק</td><td></td><td>חנות בחרוזי סיליקה ג'ל ב -80 מעלות; C</td></tr><tr><td>13.2 מ"ל צינורות אולטרה-צנטריפוגה שקופים במיוחד</td><td>בקמן קולטר</td><td>344059</td><td>פתוחים רק במכסה המנוע</td></tr> אי <tr><td>הכללה בגודל PD-10 עמודת כרומטוגרפיה</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01</td><td>חנות ב 4 מעלות; C</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>AppliChem</td><td>A1069.1000</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Ultrapure AppliChem</td><td>A1112,0500</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>AppliChem</td><td>A1123.1000</td><td></td></tr><tr><td>שם</td><td>חברה</td><td>מספר קטלוגי</td><td>Comments</td></tr><tr><td> חומר לתרבית תאים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>PAN ביוטק</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>PAN ביוטק</td><td>P04-03590</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין/EDTA</td><td>PAN ביוטק</td><td>P10-0231SP</td><td></td></tr><tr><td>FBS טוב</td><td>PAN ביוטק</td><td>P40-37500</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>PAN ביוטק</td><td>P06-07100</td><td></td></tr><tr><td>טיפים לסינון ביוספרה (גדלים שונים)</td>פיפטות סרולוגיות של <td>Sarstedt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(גדלים שונים)</td>צינורות תגובה <td>של Sarstedt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(גדלים שונים)</td><td>לוחות Sarstedt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TC 15 ס"מ</td><td>Sarstedt</td><td>83.3903</td><td></td></tr><tr><td>שם</td><td>חברה</td><td>מספר קטלוגי</ חזק></td><td><חזק>הערות</חזק></td></tr><tr><td><חזק>חומר לפרוטוקול צביעת כסף</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>J.T.Baker</td><td>8045</td><td></td></tr><tr><td>אתנול מוחלט</td><td>AppliChem</td><td>1613,2500PE</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אצטית</td><td>AppliChem</td><td>A0820,2500PE</td><td></td></tr><tr><td>פורמלדהיד 37%</td><td>AppliChem</td><td>A0877,0250</td><td></td></tr><tr><td>אתנול מוחלט</td><td>AppliChem</td><td>A1613,2500PE</td><td></td></tr><tr><td>נתרן תיוסולפט</td><td>AppliChem</td><td>1,418,791,210</td><td></td></tr><tr><td>כסף חנקתי</td><td>AppliChem</td><td>A3944.0025</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פחמתי</td><td>AppliChem</td><td>A3900,0500</td><td></td></tr><tr><td><חזק>שם</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק><</td><td>חזק>מספר קטלוגי</חזק></td><td><חזק>הערות</strong</td></tr><tr><td>>Special Lab Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Desiccator</td><td>Nalgene</td><td>5311-0250</td><td></td></tr><tr><td>Megafuge 40</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>רוטר עבור Megafuge TX750 + מתאם ו-Llids עבור 500 מ"ל צינורות</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אמבט</td> <td>מים</td> אולטרה-צנטריפוגה קונבנציונלית <td></td><td></td></tr><tr><td>למשל Optima XPN-80</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מתאים Ultrazentrifuge Rotor למשל SW41</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH -Meter</td> מעמד <td>קונבנציונאלי</td><td></td><td></td></tr><tr><td>עם מהדקים</td> מנורת צוואר אווז <td>קונבנציונלית</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>קונבנציונלית</td><td></td><td></td></tr><tr><td>רוטור עילי</td> בלוק <td>תרמי קונבנציונאלי</td><td></td><td></td></tr> פוטומטר <tr><td></td><td>קונבנציונאלי</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(OD 260)</td> <td>קונבנציונאלי</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

בשילוב שינויים capsid גנטי וכימי של וקטורים המבוסס על אדנו העברה גנטית עבור הגנה ומיקוד

Combined Genetic and Chemical Capsid Modifications of Adenovirus-Based Gene Transfer Vectors for Shielding and Targeting

אדנו וקטורים הם כלי חזק virotherapy חיסון, oncolytic גנטית. עם זאת, הם נוטים אינטראקציות מרובות וקטור רצויה-מארח, במיוחד לאחר הלידה ויוו . זה קונצנזוס כי המגבלות שהוטלו על ידי אינטראקציות וקטור רצויה-המארח יכול רק להתגבר אם מתבצעים שינויים מוגדר של המשטח וקטור. שינויים אלה כוללים מיגון של החלקיקים של אינטראקציות בלתי רצויים פילוח לפי המבוא של ליגנדים חדש. המטרה של פרוטוקול המובאת כאן היא לאפשר לקורא להפיק ממוגן, אם רצונך בכך, retargeted וקטורים העברת גנים אדנו אנושי או וירוסים oncolytic. הפרוטוקול יאפשר לחוקרים לשנות את פני השטח של capsids וקטור אדנו על-ידי מצורף כימי מסוים של פולימרים סינתטיים, פחמימות, שומנים או אחרים moieties ביולוגי או כימי. היא מתארת את טכנולוגיה חדשנית של שינויים capsid גנטי וכימי משולב, אשר הוכחו כדי להקל על ההבנה, התגברות על מחסומים עבור משלוח ויוו אדנו וקטורים. תיאור מפורט של תגובות של צעדים חיוניים לביצוע תגובות כימיות ספציפיות עם וירוסים פעילים ביולוגית או וירוס-derived וקטורים מסופק. הטכנולוגיה שמתואר הפרוטוקול מבוסס על המבוא גנטי של ציסטאין (נעדר באופן טבעי) שאריות לתוך החשופים הממס לולאות של אדנו-derived וקטורים. אלה שאריות ציסטאין לספק כימיים תגובתיות ספציפי, זה יכול, לאחר הייצור של הווקטורים כדי titers גבוהה, תנוצל ספציפי מאוד ויעיל צימוד כימי קוולנטיות של מולקולות מתוך מגוון רחב של מחלקות חומר כדי וקטור חלקיקי. חשוב לציין, פרוטוקול זה ניתן בקלות להתאים לבצע מגוון רחב של שונות (שאינה תיול מבוססת) שינויים כימיים של וקטור אדנו capsids. בסופו של דבר, זה סביר וקטורים העברה הזה שאינו אפוף ג'ין מבוסס-וירוס אחר ממה אדנו ניתן לשנות מן הבסיס של פרוטוקול זה.

איור 2 מציג דוגמאות אפקט ציטופתי (CPE) על תאים (HEK 293) 293 המציין ייצור וקטור מוצלחת. תאים צריך להראות מורפולוגיה (איור 2C) 40-48 שעות לאחר חיסון עם וקטור וירוס. Timepoint הנכון עבור קציר חיונית לא לאבד חלקיקי וירוס על ידי פירוק התא, מונע חמצון של קבוצות תיול הציג גנטית. אם וקטור חלקיקים המשתחררים לתוך האמצעי על ידי פירוק התא, תיולים גנטית הציג כמעט מיד להיות מחומצן, וזה יהפוך להיות קשה לטהר ולשנות אותם מבחינה כימית.
<p cla...

הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר לחוקרים במיוחד לשנות capsids אדנו-אתרים נבחרים על-ידי כימיה פשוטה. אדנו מסוככים את המומנט חלקיקים וקטורים העברת גנים retargeted יכול להיווצר ו החרקי המארח יכול להילמד.

בשילוב שינויים Capsid גנטי וכימי של וקטורים המבוסס על אדנו העברה גנטית עבור הגנה ומיקוד

Adenovirus vectors are potent tools for genetic vaccination and oncolytic virotherapy. However, they are prone to multiple undesired vector-host ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הריפוי הגנטי, אונקוליזה וחיסון גנטי. זה מקל על הבנה ותווסת של וקטור מארח אינטראקציות של וקטורים העברת גנים אדנווירוס, הסוג הווקטור הנפוץ ביותר בניסויים קליניים מעודכן. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי adenovirus מתהפך ניתן לשנות באופן ספציפי באופן מוגדר מאוד בעמדות נבחרות במידה משתנה באמצעות כימיה פשוטה.ההשלכות של טכניקה זו משתרעת לכיוון הטיפול מכיוון שלא ניתן לנתח רק את השינוי המארח הווקטורי אלא גם לווסת אותו בצורה מכוונת מטופל. למרות ששיטה זו מספקת תובנה לגבי אינטראקציות מארח וקטוריות ספציפיות, היא עשויה לשמש גם לתיוג ומעקב אחר חלקיקי וירוסים באורגניזמים חיים, כגון עכברים. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו ייאבקו בשילוב הייחודי של וירולוגיה וכימיה אורגנית הדורשת ידע מעשי משני תחומים.הדגמה מיוחדת של טכניקה זו היא קריטית משום שכאן שיטות מכימיה אורגנית פוגשות שיטות של ביולוגיה של התא וווירולוגיה, כולל טריקי טיפול ספציפיים לתחום. כדי להתחיל בהליך זה, הכן את כל המאגרים כמפורט בפרוטוקול הטקסט. שקל מיליליטר אחד מכל מאגר הדרגתי כדי לבדוק את צפיפותו.לאחר עיקור כל המאגרים, לפצל את המאגרים המכילים TCEP עם גז ארגון במשך כ 30 שניות כדי למנוע חמצון של TCEP. אחסן את הבקבוקונים המכילים את מויטי הצימוד המוצק בצינורות גדולים יותר, כל אחד מלא כרית של בחנורי ג'ל סיליקה, כדי למנוע הצטברות של מים מרוכזים בעת הפשרת הבקבוקונים. שים את הצינורות האלה לתוך מעביד.מוציאים את האוויר בדשן ומחליפים אותו בגז ארגון. ואז לסגור כל צינור בחוזקה ולהעביר אותו לתוך מיכל גדול יותר עם בחנוזי ג'ל סיליקה. ברגע שכל הצינורות הועברו, סגור את המיכל.לאחסן את המיכל ב 80 מעלות צלזיוס עד מוכן לשימוש. כאשר מוכנים להפשיר, מניחים את המיכל לתוך שכבה של חסידות סיליקה ב desiccator. אפשר למיכל להתחמם לאט לטמפרטורת החדר ולאחר מכן לפתוח את המיכל.כאשר התאים מגיעים להשפעה הציטופתית האופטימלית, אוספים אותם על ידי גירוד הצלחות והעברת העל-טבעי לצינורות צנטריפוגה. לסובב את ההשעיה התא ב 400 פעמים G במשך 10 דקות. לאחר מכן, להשעות מחדש את גלולת התא בארבעה מיליליטר של מאגר Ad המכיל 10 מילימולר TCEP ולהעביר את הפתרון וכתוצאה מכך צינור סטרילי 50 מיליליטר.להקפיא את הפתרון בחנקן נוזלי, ולאחר מכן להפשיר אותו באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס. חזור על מחזור הפשרת ההקפאה הזה שלוש פעמים כדי להציל את הווקטור. צנטריפוגה ב 5000 G וארבע מעלות צלזיוס במשך עשר דקות.בעוד צנטריפוגה להגדיר שני צינורות אולטרה צנטריפוגה להתחיל להכין שני שיפוע צעד שווה צסיום כלוריד. הוסף שלושה מיליליטר של השלב התחתון לכל אחד מהצינורות האלה. סמן את רמת השלב התחתון על הצינור לפני טעינת השלב העליון.ואז בזהירות לערום חמישה מיליליטר של השלב העליון אל השלב התחתון, צינורות אותו לאט מאוד לאורך קירות הצינור. כאשר מעברי הצבע מוכנים וצנטריפוגה הושלמה לטעון את העל-טבעי מהדגימה באופן שווה על פני שני מעברי צבע. מלא את השטח הנותר בכל צינור הדרגתי עם מאגר מודעות המכיל TCEP עשרה מילימולרים הקפד למלא את הצינורות כל הדרך לפסגה.התאימו את המשקל של הצינורות הנגדיים להפרש משקל אפסי. ולשנות צנטריפוגה עבור 176000 פעמים G ו 4 מעלות צלזיוס במשך שעתיים. לאחר מכן, השתמש מהדק כדי לתקן צינורות צנטריפוגה אולטרה אחד לעמוד.הקפד להשאיר את האזור סביב רמת הפאזה התחתונה מסומן כנגיש. מניחים את מנורת צוואר האווז מעל הצינור. סביב הסימן, בגבול שבין השלבים התחתונים והתחתונים, צריכה להיות רצועה נפרדת גלויה.לנקב את הצינור עם מחט, ולזמוף את הרצועה הווקטורית לתוך מזרק כדי לאסוף את הווקטור. העבר virons וקטור שנאספו לצינור 15 מיליליטר ולחשב את כמות מצע צימוד הדרוש כמפורט בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, להעביר את הפתרון הווקטורי לצינור בגודל המתאים.ואת הכמות המחושבת של פתרון מלאי תרכובות צימוד. מערבבים בעדינות לפי סיבוב תקורה במשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, התאם את הנפח הכולל של הפתרון הווקטורי לשישה מיליליטר על-ידי הוספת מאגר מודעות.לטהר את הווקטור מן moiety צימוד לא מושתק באמצעות שלב איגוד צסיום כלוריד השני כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. לנקב את הצינור עם מחט ולזמוף את הרצועה הווקטורית לתוך מזרק. העבר את הווקטורים שנאספו לצינור 15 מיליליטר.אם השילוב בין שני צינורות ההדרגתיים קטן מ- 2.5 מיליליטר, כוונן את עוצמת הקול ל- 2.5 מיליליטר על-ידי הוספת מאגר מודעות. טען את הווירון המשולב לעמודת Pd משודרגת שווה ומחק את הזרימה. לאחר מכן הוסף שלושה מיליליטר של מאגר מודעות לעמודה ואסוף את הזרימה.הוסף 333 microliters של גליצרול לזרימה שנאסף דרך כדי לקבל את הריכוז הסופי של עשרה אחוזים. מחלקים אותם לאליקוטים מתאימים. הקפד לכלול aliquot של 20 microliters לנחישות הדוקה יותר על ידי מדידת OD 260.יש לאחסן את הפתרון הווקטורי ב-80 מעלות צלזיוס עד שהוא מוכן לשימוש. תוצאות מייצגות של ההשפעות על 293 תאים מצביעות על כך שהייצור הווקטורי הצליח. תאים צריכים להראות מורפולוגיה 40-48 שעות לאחר שחוסנו עם וקטור הנגיף.כסף מוכתם SDS פאג משמש לאחר מכן כדי להעריך יעילות צימוד. וקטורים עם ציסטאינס שהוכנסו לבסיס הפנטון capsomere הן עם משון שונה ללא שינוי מנוהלים. להקות Hexon מציגות שינוי המציין שינוי מוצלח של מעל 90 אחוז מהמונומרים לכל קפסיד.בעת ניסיון הליך זה חשוב להבטיח סביבה מצמצמת עבור חלקיקים וקטוריים לא מודרניים. לאחר השינוי, אווירה רגילה מתאימה. חישובים תיעודיים מדויקים צריכים להבטיח שינוי כמותי של כל החלקיקים הווקטוריים.הפיתוח של טכניקה זו מסייע במחקר בתחום הריפוי הגנטי כדי לחקור עוד יותר אסטרטגיות בטוחות ו לקויות לאספקה וקטורית. בעקבות הליך זה ניתן לבצע שיטות אחרות כמו צימוד ליגנדים לפילוח או צבעים פלואורסצנטיים לתיוג על מנת לענות על שאלות נוספות כמו שימוש לקולטן והפצה ביולוגית. אנא הקפד לציית לתקנות המקומיות של GMO ובטיחות בעבודה.

combined-genetic-chemical-capsid-modifications-adenovirus-based-gene

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנחנו מדגימים את הטכניקה הבסיסית מולקולרי מהנדס ולהתפתח סינתטיים Adeno הקשורים נגיפיים (AAV) טיפול וקטורים גנים באמצעות DNA המשפחה גרירת רגליים. יתר על כן, אנו מספקים הנחיות כלליות ודוגמאות נציג לבחירת וניתוח של capsids chimeric בודדים בעלי תכונות משופרות על תאים היעד בתרבות או בעכברים.

הנדסה האבולוציה של הנגיף Adeno הקשורים סינתטי (AAV) בריפוי גנטי באמצעות וקטור משפחת ה-DNA של גרירת רגליים

ב-15 השנים האחרונות, וקטורים שמקורם באדנווירוס כלבים מסוג 2 (CAV2) הוכיחו את יעילותם בהתמרת תאים במבחנה וב-vivo ונמצאים בשימוש נרחב לחיסון וריפוי גנטי. כאן, אנו מתארים הליך לבנייה, ייצור וטיהור של וקטורי CAV2, מה שמוליד תרחיפים נגיפיים בעלי טיטר גבוה.

ייצור וטיהור של וקטורים שמקורם באדנווירוס כלבים מסוג 2 שאינם משוכפלים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצור וקטור הוכחה של עיקרון סוג אדנווירוס דו הערכי 5 (Ad5) Ad5 / H5-HVR1-קוואס-HVR5-6 על ידי ניצול אסטרטגית Antigen capsid על-ההתאגדות. וקטור זה הודגם להפגין כושר איכותי, היכולת להימלט סרה Ad5 חיובית במבחנה, וantigenicity כמו גם חיסונית לאנטיגנים המשולבים.

ניצול capsid על-התאגדות האסטרטגיה Antigen לפיתוח גישות Adenovirus סרוטיפ 5-וקטורי חיסון

מוצג פרוטוקול ליצירת וקטורים אדנו-ויראליים בעלי קיבולת גבוהה החסרים את כל רצפי הקידוד הוויראליים. שיבוט של טרנסגנים הכלולים בגנום הווקטור מבוסס על אנדונוקלאזות ביות. הגברת הנגיף בתאי יצרן הגדלים כתאים נצמדים ובתרחיף מסתמכת על וירוס עוזר המספק גנים נגיפיים בטרנס.

ייצור שיבוט וקנה מידה גדולה של וקטורי adenoviral בקיבולת גבוהה המבוססים על סוג Adenovirus האדם 5

כאן, אנו מתארים אסטרטגיית לשחזור ויעילה כדי לייצר כייל נוגדנים, בקרת איכות קבוצות של וקטורים adeno-הקשורים וירוס. היא מאפשרת למשתמש לקבל הכנה וקטור עם כייל גבוה (≥1 x 1013 וקטור הגנום/mL) ואת טוהר גבוהה, מוכן לשימוש במבחנה או ויוו .

הפקה, טיהור, ובקרת איכות על Adeno-הקשורים וקטורים מבוסס-וירוס

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצור אדנווירוס באמצעות מערכת pAdEasy. הטכנולוגיה כוללת שילוב מחדש של pAdTrack ו pAdEasy-1 פלסמידים, האריזה וההגברה אדנווירוס, טיהור של חלקיקים אדנו-ויראליים מן מדיום lysate ותרבות התא, titration ויראלי, ואת הבדיקה הפונקציונלית של אדנווירוס.

שיטה יעילה לייצור אדנווירוס

יצירת ספריית תצוגה פפטידית AAV ותיקוף לאחר מכן באמצעות ברקוד של מועמדים עם תכונות חדשות ליצירת AAV מהדור הבא.

בידוד וקטורי ריפוי גנטי מהדור הבא באמצעות הנדסה, ברקוד וסינון של גרסאות קפסיד הקשורות לנגיף אדנו (AAV)

כתב יד זה מתאר פרוטוקול מפורט ליצירה וטיהור של וקטורים נגיפיים הקשורים לאדנו באמצעות שיטת כרומטוגרפיית זיקה אופטימלית מבוססת הפרין. הוא מציג גישה פשוטה, ניתנת להרחבה וחסכונית, ומבטל את הצורך באולטרה-צנטריפוגה. הווקטורים המתקבלים מפגינים טוהר גבוה ופעילות ביולוגית, מה שמוכיח את ערכם במחקרים פרה-קליניים.

בידוד של וקטורים נגיפיים הקשורים לאדנו באמצעות פרוטוקול כרומטוגרפיית זיקה הפרין חד-שלבי וחצי אוטומטי

פרוטוקול זה נועד להציג שיטה לייצור וטיהור ביומימטיקה של וזיקולה חוץ-תאית שמקורם בתאי גזע מזנכימיים (MSC) לטיפול גנטי. הננווסיקולה מוגבלת לשכבות ליפידים שמקורן ב-MSC ומכילה AAVs רקומביננטיים הנושאים את הגן המעניין בלומן. ננו-ווסיקולה זו מספקת וקטור משופר להעברת גנים ב-in vivo .

פיתוח ננוביסיקולות עטופות בממברנה של תאי גזע מזנכימיים לשיפור העברת הגנים

וידאו זה מדגים את נוהל המבדילים תאים דנדריטים מיאלואידית ממח העצם העכבר. בידוד של השוקה העכבר הירך, ועיבוד של מח העצם הם הפגינו. תמונות הוכחת מורפולוגיה תא לפני ואחרי בידול, דמויות המתארות פנוטיפ התא IL-12 בייצור התבגרות הבאות באמצעות CPG מוצגים.

התרבות של תאים דנדריטים מיאלואידית מ מבשרי מח עצם

חקור שינוי כיפתיים של אדנו באמצעות כימיה פשוטה להבנת אינטראקציות וקטור-מארח. שיטה זו תורמת לפיתוח טיפולי גן, אונקוליזה וחיסונים גנטיים מותאמים אישית.

בשילוב שינויים Capsid גנטי וכימי של וקטורים המבוסס על אדנו העברה גנטית עבור הגנה ומיקוד

גלה סרטונים נוספים