טכניקות Phenotyping בקנה מידה מיקרון של חבילות וסקולריים תירס מבוסס על צילום רנטגן טומוגרפיה Microcomputed
9 באוקטובר 2018
אנו מספקים שיטה כדי לשפר את הניגודיות הקליטה רנטגן רקמת תירס מתאים סריקת טומוגרפיה microcomputed רגיל. על סמך CT תמונות, אנחנו מציגים את ערכה של זרימות עבודה של עיבוד תמונה עבור חומרים תירס שונים ביעילות לחלץ פנוטיפים מיקרוסקופיים של וסקולריים צרורות של תירס.
שיטה זו יכולה להיות לענות על שאלות מהירות בטכניקות פנוטיפים בקנה מידה מיקרון המתוכנן לבנות. כגון חלקיקי סריקת מיקרו-CT, ושיטת הניתוח הפנוטיפית לחבילות כלי דם תירס. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא לספק דרכים חדשות ויעילות לחקור תכונות פנוטיפיות של צרור כלי דם תירס על ידי הכנת מדגם, סריקת CT, וניתוח של פרוטוקולים.
ההשלכות של טכניקה זו מרחיבות את היישומים של סריקת מיקרו-CT רגילה ומדעי צמחים אחרים. פרוטוקול זה ניתן לשנות בקלות כדי להתאים חומרים צמחיים אחרים, כגון התייבשות של הליך ייבוש. כדי להתחיל, לאסוף את הגבעול, עלה, ואת השורש מצמחים תירס טרי.
ולחלק אותם לשלוש קבוצות מדגם. לאחר מכן, השתמש בלהב כירורגי כדי לחתוך קטע אחד עד 1.5 ס"מ של internode גזע באמצע. באמצעות אותו להב כירורגי, חותכים קטע של 1/2 עד 2 ס"מ מרוחב העלה המרבי לאורך הכיוון האנכי עם הוריד הראשי.
השתמש בלהב הכירורגי כדי לחתוך קטע 1/2 ס"מ מהשורש הקרקע. לאחר מכן, השרו את מקטעי הדגימה בתסרון FAA למשך שלושה ימים לפחות. ייבשו את מקטעי הדגימה למשך 30 דקות בשישה מעברי צבע אתנול רציפים.
לאחר מכן מניחים את חומרי הצמח בסלי המדגם המתאימים. העבר במהירות את הסלים לתא המדגם של מערכת ייבוש נקודה קריטית פחמן דו חמצני. מניחים את החומרים הצמחיים המיובשים לתוך צינור צנטריפוגה 50 מיליליטר עם שני גרם של יוד מוצק.
ואז למקם את הצינורות בחדר חסין אור במשך ארבע עד חמש שעות. תחילה, הגדר את הפרמטרים לסריקת CT בהתאם לפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, הגדר את טווחי הסריקה בהתאם לגדלים ולנפחים השונים של חומרי הצמח המשמשים.
לאחר מכן, התאימו את גודל פיקסל ההדמיה באופן הבא:שני מיקרומטרים לשורש. 6.77 מיקרומטר לגזע. ו-10 מיקרומטר לעלה.
לבנייה מחדש של תמונות פרוסות, השתמשו בתוכנת בניית תמונות להמרת נתוני CT גולמיים לתמונות פרוסת CT ברזולוציית 2K. תחילה, ציין את סוג האיבר כדי לאתחל צינורות אלגוריתמים שונים בתוכנת ההדמיה האוטומטית. לאחר מכן, לחץ על לחצן הפרמטרים של השיטה ובחר גזע תירס, או עלה תירס, בתיבה הנפתחת הראשונה.
לחצו על לחצן 'ניהול נתונים', קבעו את ספריית העבודה וייבאו את כל תמונות הפרוסות בספריה. לאחר מכן בחרו תמונות בודדות או מרובות פרוסות בצינורות התמונה. לאחר מכן, קבעו את גודל הפיקסל של התמונה.
בחרו בלחצן 'פרמטרי שיטה' והזינו את גודל הפיקסל של התמונה בפריט העריכה המתאים. לאחר מכן, לחץ על כפתור חישוב phenotyping כדי לחלץ באופן אוטומטי תכונות פנוטיפיות של חבילות כלי הדם עבור כל התמונות פרוסה שנבחרו. לחץ על לחצן הניתוח הסטטיסטי כדי ליצור פלט של תוצאות ניתוח זה כקובץ טקסט או CSV.
ייבאו את התמונות המשוחזרות של שורשי תירס, וקבעו את פרמטרי החלל המדויקים. לאחר מכן השתמש בכלי הגאוסיאני רקורסיבי כדי להחליק את התמונות ולשפר את איכות התמונה. התאם את פרמטרי הסף כדי לבצע פילוח תלת-מימדי של כלי metaxylem.
פעולה זו תיצור תווית צבע אחידה עבור כל כלי metaxylem מחובר. לאחר מכן, לשפר ולזהות את כלי metaxylem באופן אינטראקטיבי באמצעות מורפולוגיה bitwise, פעולות מילוי שיטפון. לאחר מכן, לבצע הדמיה נפח ושחזור פני השטח של כלי.
לבסוף, השתמש בכלי סטטיסטיקת המסכה כדי לספור ולמדוד את התכונות הפנוטיפיות של כלי ברמות הדו-מימד והתל-מימד. באמצעות הניתוח המתואר בפרוטוקול, חושבו התכונות הפנוטיפיות של חבילות כלי דם בגבעולי תירס, עלים ושורשים. נוצרה הדמיה תלת-מימדית של כלי השורש והמטקסים, תוך שימוש בתוצאות של פילוח, שחזור והדמיה של אמצעי אחסון.
פרוטוקול הכנת הדגימה הנכון משפר באופן משמעותי את איכות הסריקה של מיקרו-CT לגזע תירס, עלה ושורש. עם צינור פולט אוטומטי כדי לחלץ במהירות את התכונות הפנוטיפיות של חבילות כלי דם עבור גזע תירס ועלה. ואת ההתקנה ואת פולטים עיבוד סריקה כדי לנתח את התכונות פנוטיפיות 3D של חבילות כלי דם עבור שורש תירס.
טכניקה זו מספקת דרך מעשית להסמכה פנוטיפית מדויקת ומהירה וזיהוי חבילות כלי דם תירס.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה חדשנית לשיפור ניגודיות בליעת קרני רנטגן ברקמת תירס, במטרה לשפר את תהליכי הסריקה במיקרו- computed tomography (micro-CT). הטכניקה תומכת ביעילות בניתוח של הצמגים הלימפתיים והניאגובים (vascular bundles) בתירס, ומאפשרת הערכה פנוטיפית מפורטת באמצעות זרימת עבודה מובנית של עיבוד תמונה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המחקר
- מדעי הצמחים
- טכניקות מיקרוסקופיה והדמיה
- ניתוח פנוטיפי
רקע
- חשיבותם של הצמגים בעשב השדה (תירס)
- הצורך בשיטויות דימות משופרות בפנוטיפיקה
- יישומים פוטנציאליים של סריקת micro-CT משופרת
שיטות שנעשה בהן שימוש
- סריקת Micro-CT
- רקמות צמח תירס (גבעול, עלה, שורש)
- תהליכי עבודה לעיבוד תמונות
תוצאות עיקריות
- מיצוי יעיל של תכונות פנוטיפיות מצוררי כלי דם של תירס
- שיפור באיכות הסריקה ובתוצאי הדימוי
- יישום מוצלח של הפרוטוקול על רקמות תירס שונות
מסקנות
- השיטה משפרת באופן משמעותי את ניתוח הצמעות הכליים בתירס.
- היא מדגימה תועלת בקידום מתודולוגיות של פנוטיפ תבנית בצמחים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
כימות מדויק של מבנים אנטומיים בצמחים תומך בתיקוף מטרות בביוטכנולוגיה חקלאית, בכך שהוא מאפשר סריקה פנוטיפית של תכונות כליות הקשורות לעמידות לעקה וליבול. שיטה זו משפרת את הביטחון החזוי בשלבים מוקדמים של הגילוי על ידי אספקת פנוטיפיקה ברזולוציית מיקרון ובספיקות גבוהה של צרורות כליים בתירס. היא ממצבת את ניתוח התכונות מבוסס ההדמיה ככלי שניתן להרחבה להפחתת סיכונים בזיהוי מועמדים בשרשראות לשיפור גידולים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של ארכיטקטורת הצומה הליכיסטית כדי להבהיר תכונות תפקודיות הקשורות להובלת חומרים מזינים ותגובה לעקה.
- ערך תפעולי: מבצע אוטומציה של מיצוי 31 תכונות פנוטיפיות של גבעול/עלה ו-33 תכונות פנוטיפיות של שורש, ובכך מפחית את השונות במדידות ידניות.
- ערך חיזוי: תומך בסינון פנוטיפי של תכונות ליכיסטיות כדי לתעדף מטרות גנטיות בעלות תורשתיות גבוהה ועמידות סביבתית.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר מדדי כלי דם סטנדרטיים בדו-ממד ובתלת-ממד (נפח, שטח פנים) לצורך השוואה הדירה של תכונות בין גנוטיפים שונים.
- ערך תפעולי: משתלב בזרימות עבודה של micro-CT ליצירת בדיקות דימות ניתנות להרחבה לצורך סריקה פנוטיפית בעלת תוכן גבוה.
- מוכנות הבדיקה: מייצר נתוני תכונות בפורמט CSV המאפשרים ניתוח סטטיסטי המשכי ושילוב בלמידת מכונה.
מחקר תרגומי ופרה-קלמיני
- המשכיות תרגומית: מקשרת בין פנוטיפיקה של כלי דם בשלב הגילוי להערכה פרה-קלינית של תכונות יעילות ניצול חנקן ועמידות לבצורת.
- הפחתת סיכונים מכניסטיים: מבהירה קשרי מבנה-תפקוד בצרורות כלי הדם כדי להפחית עמימות באימות המטרות.
- סנכרון סמנים ביולוגים: מדדי מורפולוגיה של כלי דם משמשים כסמנים ביולוגים הניתנים לתרגום לשם הערכת שלמות כלי הדם ומוליכות הידראולית.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת ברצף שבין השלב הגילוי לשלב הפרה-קליני על ידי כך שהיא מאפשרת ניתוח של תכונות כלי דם, המכוון את בחירת המטרה ואת אופטימיזציית המולקולה המובילה בתוכניות של ביוטכנולוגיה של גידולים חקלאיים.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת היפותזות של גנים להתפתחות כלי דם באמצעות פנוטיפויזציה אוטומטית של צפיפות ומורפולוגיה של צרורות כלי דם.
- סריקה: מספק תכונות כלי דם כמותיות וניתנות לשחזור לסריקת ספריות מוטנטים או פאנלים של שונות טבעית.
- אנליטיקה: מספק פלטיים סטטיסטיים (ממוצע, שונות, התפלגות) של תכונות כלי דם כדי לאפשר ניתוח השוואתי של תנאים.
- מחקר תרגומי: מקשר פנוטיפים של כלי דם בגבעול/עלה/שורש לביצועי הצמח כולו תחת תנאי עקה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פרוטוקול דימות בר-שימוש החל על מיני חד-פסיקיים לצורך סטנדרטיזציה של תכונות כלי דם.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות על ידי הפחתת רעש פנוטיפי באמצעות חילוץ תכונות אוטומטי ברזולוציה גבוהה.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של הכנת הדגימות ופרמטרי ההדמיה ברחבי רקמות הגבעול, העלה והשורש לצורך הדירות (reproducibility) בכל המעבדה.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) בצינורי תכונות על ידי אספקת נתוני פנוטיפ כליים בשלב מוקדם עם אי-ודאות מכומתת.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר קידום מטרות גנטיות מותאם-סיכון על בסיס יציבות תכונות כליים והערכות תורשתיות.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות באנטומיה של צמחים, תפעול micro-CT ותהליכי ניתוח תמונות.
- נדרשת גישה לסורקי micro-CT בעלי רזולוציית ווקסל ניתנת להכווננה (2–10 μm) ותוכנה לשחזור תמונות.
- נדרש סטנדרטיזציה של פרוטוקולי קיבוע ב-FAA, דהידרטציה באתנול וניגוד באמצעות יוד בין מעבדות שונות.
- נדרשת התאמה של ספי סגמנטציה עבור סוגים שונים של רקמות כליות ומינים מעבר לתירס.
- מוגבל על ידי אילוצי גודל דגימה בתוך מבחנות צנטריפוגה ומשך הצביעה עבור רקמות צפופות.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:04
Title
0:52
Sample Preparation Protocol
2:19
Micro-CT Scanning Protocol
3:03
"Image Analysis for a Single CT Imageof a Maize Stem or Leaf"
4:06
Image Analysis Protocol for CT Image Series of a Maize Root
5:09
Results: Phenotypic Traits of Vascular Bundles in Maize Stems, Leaves, and Roots Computed
5:35
Conclusion
