מודל העובר דג זברה, ויזואליזציה Vivo, ניתוח Intravital של Biomaterial-הקשורים Staphylococcus aureus זיהום

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח על איך ביו-חומרים להשפיע על רגישות לזיהום, איך הם משפיעים על ההתקדמות של זיהומים כאלה, וכיצד הם משפיעים על התנהגות תאי החיסון סביב ביו-חומרים כאלה ב vivo. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת מודל חדשני של בעלי חיים המאפשר הדמיה של vivo וניתוח תוך-ויטראלי של זיהומים הקשורים לביו-חומרים. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית כמו הזרקת מיקרוספרות ביו-חומריות הוא הליך עדין מאוד.

כדי ליצור השעיה לחיידקים בלבד, העברה ראשונה ארבע עד חמש מושבות של זן פלורסנט Staph aureus mCherry, מתורבת על צלחות חקלאות סויה טריפטית בתוספת 10 מיקרוגרם למיליליטר של כלוראמפניקול לתוך 10 מיליליטר של מרק סויה טריפטי בתוספת כלוראמפניקול, לצמיחה בשלב הצמיחה אמצע לוגריתמית ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד. כאשר התרבות מגיעה למדידת צפיפות אופטית ב 620 ננומטר של 0.4 עד 0.8, לאסוף את החיידקים על ידי צנטריפוגה, ולשטוף את התאים פעמיים עם מיליליטר אחד של PBS סטרילי לכל לשטוף. לאחר הכביסה השנייה, יש להתריע מחדש על גלולה ב-1.1 מיליליטר של PVP, ולוורטקס את ההשעיה החיידקית לפני שמודדים שוב את הצפיפות האופטית.

לאחר מכן להתאים את הריכוז של ההשעיה החיידקית עם PVP על פי הדרישות הניסיוניות כדי ליצור את ההשעיה חיידקים בלבד. כדי ליצור השעיה מיקרוספרית חיידקים, מיקרוספרות פוליסטירן מסחריות צנטריפוגות, PS-10, ולתלות מחדש את גלולת המיקרוספרה בהשעיה לחיידקים בלבד. לדלל את ההשעיה מיקרוספרה חיידקים עם נפח 1/2 של PVP כדי להגיע לריכוז מתאים של חיידקים בהשעיה כי הוא כ 2/3 מזה בהשעיה חיידקים בלבד.

מערבבים את ההשעיה על ידי מערבולת. כדי לבדוק את הריכוז של החיידקים בלבד ואת השעיית מיקרוספרה חיידקים, להוסיף 100 microliters של כל השעיה בארות בודדות של צלחת 96 באר. לדלל באופן סדרתי 10 aliquots microliter של המתלים ב 90 microliters של PBS סטרילי בארות הבאות, באמצעות טיפים טריים עבור כל שלב דילול.

יש למרוח עליקוטים כפולים של 10 מיקרוליטר של המתלים החיידקיים הלא מדוללים והמדוללים על צלחות אגר, ולהדגיר את הצלחות למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר, לספור את המושבות כדי לחשב את מספר החיידקים בתוך החיידקים המוכנים בלבד ומתלים מיקרוספרה חיידקים. לאחר איסוף עוברי הזברה, השליכו עוברים בלתי שקופים שאינם שקופים, והדגירה כ-60 עוברים לכל צלחת פטרי 100 מיליליטר ב-28 מעלות צלזיוס במדיום E3 טרי.

לאחר ההרדמה, יש לרוות את העוברים החיוביים ל-GFP למיקרוסקופיה פלואורסצנטית. מעבירים אותם לצלחת פטרי 100 מיליליטר של מדיום E3. כדי ליצור תבנית הזרקה, מלאו צלחת פטרי 100 מיליליטר עם אגרוז נוזלי אחד עד 1.5%.

השתמש בתבנית עובש פלסטיק כדי ליצור חריצים באגארוז. כאשר התעוררות התגבשה, להסיר את התבנית, ולכסות את אגר עם E3 בינוני בתוספת 0.02% tricaine. יום אחד שלוש לאחר ההפריה, להשתמש במקלפות כדי לשבור את קצה מחט microcapillary זכוכית משך כדי להשיג טיפים עם קוטר חיצוני כ 20 מיקרומטר תחת מיקרוסקופ אור עם סרגל קנה מידה העין.

ההתאמה של פתיחת קצה המחט היא מעשית להזרקת מיקרוספרות. יש להתאים את קוטר הפתח למיקרוספרות בגדלים שונים. לאחר מכן השתמש טיפ פיפטה Microloader כדי לטעון את המחט עם כ 20 microliters של מיקרוספרה חיידקים או חיידקים בלבד השעיה, ולהרים את המחט על micromanipulator מחובר microinjector.

עכשיו להעביר את העוברים שנבחרו לצלחת אגרוז מחורצת. לאחר המתנה של חמש דקות להדמה של העוברים, יש ליישר את העוברים בתוך החריצים בכיוון אחד להזרקתם. הגדר את המיקרו-מזרק להגדרות ההזרקה המתאימות, והכנס את המחט לרקמת השריר של העובר הראשון בזווית של 45 עד 60 מעלות תחת מיקרוסקופ סטריאו.

בעדינות להזיז את המחט קדימה ואחורה כדי להתאים את המיקום בתוך הרקמה לפי הצורך, ולהשתמש דוושת כף הרגל microinjector להזריק את המתלה טעון. בעת הזרקת השעיה מיקרוספרה חיידקים לתוך הרקמה של עוברי זברה, המחט צריכה להיות מוכנס בעדינות אבל עם יד יציבה. לאחר הכנסה מוצלחת, יש ליצור רווח עבור החומרים לפני ההזרקה.

כאשר כל העוברים הוזרקו, ציון העוברים עבור זריקה מוצלחת תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאו, ולשמור על העוברים במדיום E3 ללא tricaine בארות בודדות של 48 צלחות היטב עם שינויים בינוניים יומיים. כדי לפקח על התקדמות הזיהום על ידי כימות יחידה יוצרת מושבה, להעביר באופן אקראי חמישה עד שישה עוברים נגועים קיימא לתוך microtubes שני מיליליטר בודדים זמן קצר לאחר ההזרקה, בעדינות לשטוף את העוברים עם PBS סטרילי. לאחר השלכת הכביסה, מוסיפים 100 מיקרוליטרים של PBS סטרילי לכל צינור, ואחריו שניים עד שלושה חמוזי זירקוניה סטריליים בקוטר שני מילימטר.

ואז למחוץ את העוברים homogenizer ב 3, 500 סל"ד במשך 30 שניות, ותרבות הומוגנית כפי שהוכח. מניחים צלחת פטרי 100 מ"מ המכילה E3 בינוני בתוספת 0.02% tricaine על שלב מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאו, ומוסיפים 500 microliters של 2%methylcellulose לתוך צלחת פטרי. כדי לעקוב אחר התקדמות הזיהום על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטי, לצייד את השדה הבהיר המתאים מסנני פלואורסצנטי, ליישר את העוברים נגועים הרדמה אופקית בנקודה של מתילקלוז בצלחת פטרי.

השתמש במסנן השדה הבהיר כדי להביא את הרקמה המוזרקת הפגומה לפוקוס בהגדלה של פי 160. הגדר את עומק מחסנית Z ב- 10 מיקרומטר ואת גודל השלב בחמישה מיקרומטרים כדי לאפשר הקלטה של שלוש תמונות רצופות. לאחר מכן תדמיין את העוברים הבודדים תחת הגדרות ממוטבות זהות בהגדלה של פי 160.

השתמש בתוסף ObjectJ ב- ImageJ כדי לנתח את התמונות. הזרקה תוך שרירית של Staph aureus יוזם זיהום תלוי מינון בעוברים, עם התקדמות זיהום קיימא נצפתה בעוברים מנוהל מינונים אתגר גבוה בימים אחד ושניים לאחר הזרקה. כפי שהוכח, ניתן להזריק מספר דומה של חיידקים בנוכחות או היעדר מיקרוספרות.

בדרך כלל, כל העוברים עם יותר מ -20 יחידות יוצרות מושבה של Staph aureus mCherry הם חיוביים עבור פלואורסצנטיות תחת ניקוד מיקרוסקופי, אם כי נוכחות של מיקרוספרות נראה לא משפיע באופן משמעותי על התקדמות הזיהום בעוברים מאותגרים במינון נמוך. בעוברים מאותגרים בעלי מנונים גבוהים, ניקוד מיקרוסקופי אינו מדגים הבדלים בתדר העוברים הנגועים עם או בלי מיקרוספרות, אך התרבות הכמותית חושפת מספרי יחידות גבוהים יותר של יצירת מושבה שהוחזרו מעוברים ב- Staph aureus plus microsphere Group בהשוואה לאלה שנקטפו מהקבוצה של Staph aureus בלבד ביומיים שלאחר ההזרקה. נוכחות של ביו-חומר משפיעה הן על תגובת התא החיסוני והן על הרגישות הראשונית לזיהום.

לדוגמה, בחמש שעות לאחר ההזרקה, חדירת המקרופאג בתגובה להזרקה של Staph aureus בלבד גבוהה משמעותית מאשר בתגובה לאאוראוס Staph בתוספת הזרקת מיקרוספרות, ואילו ביום אחד לאחר ההזרקה, העוברים עם מיקרוספרות מפגינים רמות גבוהות משמעותית של זיהום Aureus Staph מאשר העוברים ללא מיקרוספרות. חשוב לזכור תמיד להתאים את פתיחת קצה המחט לגודל הביו-חומרים ולהתאים את היחס בין ריכוז החיידקים בהשעיה לחיידקים בלבד ואת ההשעיה המיקרוספרית של החיידקים. מודל זה של עובר זברה-דג מאפשר את הדמיה של in vivo ואת הניתוח ההפוכי של התקדמות הזיהום ואת התגובות של תאי החיסון המתגרים בנוכחותם והיעדרם של ביו-חומרים.

טכניקה זו מספקת מודל חדש של בעלי חיים שלמים לפיתוח ביו-חומרים מיקרוביאליים ואסטרטגיות טיפול עבור מכשירים רפואיים בטוחים.