המנגנונים שבבסיס הפרשת הורמון תחושת הבטן באמצעות מבודד את Perfused המעי הדק עכברוש
26 בפברואר 2019
כאן, אנו מציגים מודל פיזיולוגיים ועוצמתי כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים שבבסיס הפרשת הורמון תחושת הבטן, הספיגה במעיים – המעי הדק מבודד עכברוש perfused.
השיטה שפיתחנו כאן התבררה כמועילה ביותר בעבודה שלנו, בניסיון לגלות את המנגנונים המולקולריים של הפרשת הורמונים מהמעיים, אבל גם ספיגת חומרים מזינים, ואת הצימוד בין השניים. היתרון העיקרי של טכניקה פיזיולוגית גבוהה זו היא כי המעיים נשארים במקום, תוך מתן אפשרות מחקרים מפורטים המבוצעים בדרך כלל רק בתוך מודלים במבחנה. ראשית, מניחים את החולדה על שולחן ניתוחים מחומם, מאשרים חוסר תגובה לצביטת בוהן, ומפעילים כריתת עור וצבת כדי לחשוף את חלל הבטן.
להזיז את המעי הדק לצד כדי לחשוף את האזור המסוף של המעי הגס. וללקט את כלי הדם המספקים המעי הגס. בהדרגה לחלץ את המעי הגס, החל מאזור הטרמינל, נע לכיוון המעי הדק, לחות את הרקמה עם מלוחים איזוטוניים, ושימוש במטליות כותנה כדי להסיר את רקמת החיבור לפי הצורך.
כאשר כל המעי הגס הוסר, להכניס חתיכה 15 ס"מ של צינורות פלסטיק לתוך הקצה הפרוקסימלי של לומן מעיים קטן, ולאבטח את הצינורות עם תפרים. לאחר מכן השתמש במזרק 10 מיליליטר ומשאבת מזרק כדי לשטוף בזהירות את המעי הדק עם תמיסת מלח איזוטונית בטמפרטורת החדר בקצב זרימה של 25 מיליליטר לדקה. כאשר הרקמה התרוקנה של chyme, להתאים את הרקמות, כך העורק mesenteric העליון נגיש ולהסיר את רקמת החיבור ואת רקמת השומן כדי לחשוף את העורק.
השתמש במטלפי נקודה עדין כדי למקם שני תפרים מתחת לעורק mesenteric ושני תפרים מתחת לווריד הפורטל. מלאו קטטר פלסטיק 22-מד המחובר למשאבה מתגלגלת עם חיץ תדלוק ולהשתמש בזוג מספריים כירורגיים כדי לחתוך חור קטן בעזרה mesenteric, מיד החדרת קטטר לתוך החתך. הכנס את הקטטר בתוך שתי דקות של חיתוך חור בעורק, אחרת המעיים צפויים לסבול מנזק איסכמי.
ברגע שהקטטר אובטח בתפר, התחל את המשאבה המתגלגלת כדי ליזום חליטה בקצב זרימה של 7.5 מיליליטר לדקה. כאשר כלי הדם במעיים ובוריד השער הופכים חיוורים, חותכים חור בווריד השער. הכנס קטטר מתכת, ולאבטח את קטטר המתכת עם תפר אחר.
יש לדאוג בעת החדרת קטטר לתוך וריד הפורטל, כמו וריד דק מוקף חומה. עם זאת, כמו השומר הוא עכשיו להיות מנוון, הכנסה מהירה אינה קריטית. לאחר איסוף פלט תפוקת התדלוק לדקה אחת, למדוד את עוצמת הקול ולחץ לבצע ניסוי בתוכנית הקלטת הלחץ ליזום את הקלטות רכישת לחץ תדלוק.
לאחר מכן לכסות את המעיים עם רקמת מעבדה לחה כדי למנוע ממנו להתייבש, ולאשר כי הקצה הדיסטלי של המעי אינו חסום, ו haploid זוהר יכול לצאת. כדי למדוד את הלחץ החלקי של חמצן ופחמן דו חמצני, לאסוף חיץ תדלוק דרך שסתום עצירה-תרנגולי תלת כיווני מיד לפני שהוא נכנס לאיבר, לאחר כשלוש דקות של חליטה, ומהקטטר שהוכנס לווריד הפורטל. מניחים את הדגימות על קרח, ולהשתמש מנתח גז דם אוטומטי כדי למדוד את הדגימות זמן קצר לאחר איסוף.
השתמש במסוף שברים כדי להשיג את הדוגמאות הבסיסיות הראשונות. לאחר 10 עד 15 דקות של איסוף בסיסי, השתמש במשאבת מזרק כדי לנהל את ממריצי הבדיקה התוך-ארטיאלית הראשונה באמצעות עצירת ת'וק תלת-כיוון בקצב זרימה של 35 מיליליטר לדקה. בצע גירויים זוהרים על ידי הזרקת boas גירוי ראשוני נמסר בקצב זרימה של 2.5 מיליליטר לדקה במהלך חמש הדקות הראשונות של הגירוי, ואחריו ניהול של פתרון הבדיקה ב 5 מיליליטר לדקה קצב זרימה.
ברגע שתסתיים תקופת גירוי לומינלית, יש לשטוף את הלומן בתמיסת מלח איזוטונית בקצב זרימה של 2.5 מיליליטר לדקה למשך חמש דקות. לאחר מכן לאסוף דגימות בסיסיות ב 5 מיליליטר לדקה במשך 15 עד 30 דקות לפני חומר הבדיקה הבא מנוהל. בסוף הניסוי, לנהל מתאים, שליטה חיובית כדי לבדוק את ההיענות של ההכנה במשך חמש עד 10 דקות, איסוף ו 10 עד 15 דקות נוספות של דגימות בסיסיות בסוף תקופת גירוי שליטה חיובית.
להלן דוגמה לנתונים באיכות טובה, המדגימים פפטיד-1 דמוי גלוקגון או GLP-1, הפרשה ממעי דק מבודד של חולדה מנומקת שנאספה במרווחים של דקה אחת. בתנאים הבסיסיים, הפרשת היה יציב בעוד הן לפני ואחרי ניהול של גירוי הבדיקה ואת השליטה החיובית, תגובה הפרשה חזקה ניכרה. נתוני הפרשת GLP-1 אלה המתקבלים ממעי דק מבודד של חולדה מנוון הם באיכות ירודה עם הפרשה לא יציבה הנמדדת בתנאי בסיס שנסחפו כלפי מעלה לאורך כל הבדיקות באופן שנראה שאינו קשור לממשלי חומר הבדיקה או לשליטה החיובית.
לכן אי אפשר להסיק אם הפרשת GLP-1 המוגברת שנצפתה בסוף גירוי פרוקטוז כלי הדם הייתה תגובה מתווכה פרוקטוז. תוך כדי ניסיון הליך זה כדי לטפל כדי לאבטח את קטטרים כראוי כדי לנקות ביסודיות את ציוד חליטה כמו חיץ חליטה מספק מדיום מצוין לצמיחה חיידקית. בעקבות הליך זה, שיטות אחרות כמו In Vitro מחקרים על קווי תאים מפרישים הורמונים של תרכובות תאי מעיים ראשוניים, ניתן לבצע כדי לחקור ישירות את הייצור תאיים של AMP מחזורי או סידן תאי.
אז כבר השתמשנו בשיטה עכשיו להבהרה של מספר תהליכים מאחורי ספיגת חומרים מזינים ואת מנגנון הפרשת ההורמונים וזה התברר להיות מאוד שימושי. אל תשכח כי עבודה עם חוסמים או מפעילים של אתרים מולקולריים יכול להיות מסוכן מאוד אמצעי זהירות כגון שימוש במעיל מעבדה, כפפות, ומשקפי בטיחות, מכסה המנוע אדים תמיד צריך להילקח בעת ביצוע הליך זה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג מודל פיזיולוגי לבחינת המנגנוסים המולקולריים של הפרשת הורמוני המעי וספיגה במעי, תוך שימוש במעי דק של חולדה בבידוד עם פרפוזיה. שיטה זו מאפשרת ביצוע מחקרים מפורטים המוגבלים בדרך כלל למודלים in vitro, תוך שמירה על המעי במצבו הפיזיולוגי (in situ).
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- פיזיולוגיה
- אנדוקרינולוגיה
רקע
- למעי תפקיד מכריע בהפרשת הורמונים ובספיגת רכיבי תזונה.
- הבנת תהליכים אלו עשויה להוביל לתובנות לגבי הפרעות מטבוליות.
- ייתכן ששיטות מסורתיות אינן משקפות במדויק תנאים פיזיולוגיים.
- מודל זה שואף לגשר על הפער בין מחקרי in vivo למחקרי in vitro.
מטרת המחקר
- לחקור את המנגנונים המולקולריים של הפרשת הורמונים במעי.
- לבחון את ספיגת רכיבי תזונה במעי הדק.
- ללמוד על הזיקה בין הפרשת הורמונים לספיגת רכיבי תזונה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- טכניקה של פרפוזיה מבודדת של מעי דק של חולדה.
- תחזוקת המעי in situ לצורך רלוונטיות פיזיולוגית.
- הליכים כירורגיים מפורטים לחשיפת אזור המעי.
- הידרציה של הרקמה באמצעות סליין איזוטוני במהלך הניתוח.
תוצאות עיקריות
- השיטה מאפשרת לבחון את הדינמיקה של הורמוני המעי בהקשר פיזיולוגי.
- מקל על בחינת מנגנוני ספיגת רכיבי תזונה.
- מדגים את הצימוד בין הפרשת הורמונים לבין ספיגת רכיבי תזונה.
- מספק פלטפורמה למחקרים נוספים על תהליכים מטבוליים.
מסקנות
- מודל זה מהווה כלי בעל ערך לחקר פיזיולוגיה של המעי.
- הוא משפר את הבנתנו לגבי הגומלין בין הורמונים לספיגת רכיבי תזונה.
- מחקרים עתידיים יכולים להשתמש בטכניקה זו כדי להגיע לתובנות מעמיקות יותר לגבי בריאות מטבולית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מודל המעי הדק של חולדה בבידוד ועם פרפוזיה מאפשר חקירה רלוונטית פיזיולוגית של הפרשת הורמוני מעי ודינמיקה של ספיגת חומרים מזינים, ובכך הוא נותן מענה לפער קריטי במחקר מטבולי פרה-קלני. על ידי שימור השלמות של המעי תוך מתן שליטה ניסיונית, גישה זו תומכת בתיקוף מטרות ובצמצום סיכונים מכניסטיים עבור טיפולים המכוונים למסלולים אנדוקריניים של מערכת העיכול. המודל מספק גשר תרגומי בין רדוקציוניזם in vitro למורכבות in vivo, ובכך הוא מגביר את הביטחון החזוי בשלבים מוקדמים של הגילוי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של חיישנים מולקולריים ונתיבי איתות העומדים בבסיס הפרשת הורמוני מעי ממדורים לומנליים או וסקולריים.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות אנדוקריניות במעי בתוך הקשר של רקמה שלמה, ובכך מפחית תוצאות חיוביות כוזבות המהוות תוצר של מודלים רדוקציוניסטיים.
- ערך מדעי: מסייע בהערכת דינמיקה הפרשתית ספציפית לגירוי (עוצמה וקינטיקה) לצורך אפיון של תרכובות מובילות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר נתונים כמותיים של הפרשת הורמונים ברזולוציית זמן, המתאימים לסטנדרטיזציה של בדיקות ולהערכת הדירות.
- ערך תפעולי: מאפשר גרייה ספציפית לצד (לומינלי לעומת וסקולרי) כדי להגדיר נתיבי גישה עבור תרופות מועמדות המכוונות לקולטנים במעי.
- ערך מדעי: מאפשר מדידה משולבת של הפרשת הורמונים ופעילות נשאי חומרים מזינים לצורך זיהוי מודולטורים בעלי תפקוד כפול.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: ממדל פיזיולוגיה של המעי הרלוונטית לבני אדם כדי לחקור מנגנוני הפרשה של אינקרטינים (למשל, GLP-1, GIP) הרלוונטיים לטיפולים בסוכרת והשמנה.
- ערך תפעולי: מאפשר הערכה פרה-קלינית של השפעות תרכובות על הצימוד בין הורמונים לרכיבי תזונה, ובכך מספק מידע על תגובה למינון ומדד טיפולי.
- ערך מדעי: תומך בגילוי סמנים ביולוגיים על ידי קישור תגובות הפרשה לשיבושים מולקולריים במערכת השמורה פיזיולוגית.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי גילוי מוקדמים על ידי אספקת תובנות מכניסטיות לאחר זיהוי המטרה אך לפני אופטימיזציה של תרכיבי מוביל (lead optimization), ובמיוחד עבור תרכובות הפועלות במערכת העיכול.
- ביולוגיה של גילוי: בוחנת היפותזות הנוגעים לשחרור הורמונים המגורה על ידי רכיבי תזונה ותפקוד חיישנים במעיים בתוך תכשיר שלם פיזיולוגית.
- סריקה: מספקת תוצאות הפרשה כמותיות וניתנות לשחזור, המאפשרות השוואה של תרכובות בדיקה בין מעבדות שונות.
- אנליטיקה: מספקת פרופילים דינמיים של ריכוזי הורמונים לאורך זמן, התומכים במידול פרמקוקינטי-פרמקודנמי.
- מחקר תרגומי: מקשרת תגובות הפרשה לנתיבי ספיגת רכיבי תזונה, דבר הרלוונטי לטיפולים במחלות מטבוליות בעלי פעולה כפולה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה רב-פעמית למחקרי חשיפה כרונית לתרכובות ולאפיון דה-סנסיטיזציה של רצפטורים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון במטרה על ידי תיקוף מנגנוני הפרשת הורמונים בסביבה מעوية הקרובה למצב טבעי.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של פרוטוקולי פרפוזיה וסטימולציה, המשפרת את השחזור הבין-מעבדתי של פנוטיפים אנדוקריניים.
- ערך אסטרטגי: מפחית את הסיכון לנשירה על ידי זיהוי מוקדם של היעדר מודולציה של הורמוני מעי ברצף הגילוי.
- השפעה על הפורטפוליו: מספק מידע לקבלת החלטות של go/no-go עבור תוכניות מטבוליות, בהתבסס על פעילות אנדוקרינית חיזויית של המעי.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בניתוחים וסקולריים במכרסמים ובטכניקות של פרפוזיה למעי.
- תלוי בגישה למשאבות פרפוזיה, לאספני פראקציות ולבדיקות אימונו-ספציפיות להורמונים.
- מחייב הרכב סטנדרטי של תמיסת הפרפוזיה ובקרת טמפרטורה כדי לשמור על חיוניות הרקמה.
- כולל שיקולי התאמה בעת הסבת נתונים מחולדות לפיזיולוגיה של מעי אנושי.
- מוגבל על ידי משך ההכנה (בדרך כלל 2–4 שעות), דבר המגביל מחקרי חשיפה כרונית ארוכי טווח.
