פרוטוקול ניתן להתאמה אישית עבור מחרוזת הרכבה gRNA שיבוט (STAgR)

מערכת CRISPR-Cas9 החיידקית הגדילה באופן משמעותי את אפשרויות הניסוי עבור מדעני חיים. עם זאת, מספר גישות CRISPR תלויות באספקה בו זמנית של RNAs מדריך מרובים לתאים בודדים. שיבוט gRNA של הרכבת מחרוזות מאפשר ייצור פשוט ומהיר של וקטורים של ביטוי gRNA מולטיפלקס בשלב שיבוט אחד.

אבל STAgR הוא לא רק פשוט, זה גם יעיל, זול, וקל להתאים אישית. כדי להתחיל, להוסיף את רצפי GRNA N20 פריימרים הגברה קדימה עבור מחרוזת DNA STAgR כמו overhangs. הוסף רצפי gRNA חוש חמישה ראשוני פריימר קדימה, פריימר קדימה פיגומים, עבור פיגום קונבנציונלי, או SAM קדימה פריימר עבור פיגום המכיל MS2.

לאחר מכן, הוסף את רצפי N20 gRNA המשלימים ההפוכים לרצפי פריימר הפוכים, ובחר פריימרים של RP, בהתאם ליחצנים ולמחרוזות הספציפיים בהם נעשה שימוש. כדי להתחיל לייצר את שברי השיבוט הבודדים עבור הרכבת גיבסון, העבר 10 מיקרוליטרים של מאגר הנאמנות הגבוהה לצינור. הוסף מיקרוליטר אחד של 10 dNTPs milimolar ו 0.25 microliters של שני פריימרים 100 micromolar overhang.

הוסף 10 ננוגרם של מחרוזת תבנית ה- DNA, או הווקטור, ו- 1.5 מיקרוליטרים של DMSO. הוסף מספיק מים כדי להביא את הנפח הסופי ל 49.5 microliters, ולאחר מכן להוסיף 0.5 microliters של פולימראז HF. הדגירה את התגובות בתרמוציקלר, כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

לאחר מכן, קח aliquot 5.5 microliter מתגובת PCR. מוסיפים צבע טעינה לכל האליקוטים, וטען אותו על ג'ל 1% אגרוז. טוענים סולם דנ"א מתאים לשינוי גודל, ו מפעילים את הג'ל במאגר מתאים להפעלת ג'ל ב-120 וולט למשך 30 דקות.

בזמן הג'ל פועל, להוסיף חמישה microliters של המאגר המסופק עם אנזים ההגבלה, ו 0.5 microliters DpnI הנותרים 44.5 microliters של תגובת PCR וקטור כדי להסיר תבנית פלסמיד שיורית בשימוש במהלך PCR. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 עד 60 דקות. ודא שהאמפליקונים בגודל הנכון.

כדי להתחיל טיהור DNA, להוסיף 1.8 microliters של חרוזים מגנטיים לכל microliter אחד של מוצר PCR, ומערבבים על ידי צינור למעלה ולמטה. דגירה בטמפרטורת החדר במשך שתי דקות. באמצעות מגנט, להפריד את חרוזים שברי DNA מהנוזל שיורית.

שוטפים את גלולה עם 70% אתנול מבלי resuspending מלא אותו, לשטוף את חרוזים. חזור על שטיפה זו פעם נוספת. באמצעות פיפטה, להסיר את כל האתנול ולתת את האוויר גלולה להתייבש.

לאחר מכן מוסיפים 15 עד 20 מיקרוליטרים של מים, ואת פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב ולהמיס את גלולה. השתמש במגנט כדי להפריד את חרוזים מהנוזל. העבר את העל-טבעי הברור לצינור חדש.

לאחר מכן, השתמש בספקטרופוטומטר כדי לקבוע את ריכוזי הדנ"א. תחילה, הכן את מאגר התגובה ה- isothermal 5x כמפורט בפרוטוקול הטקסט. עבור מיקס מאסטר הרכבה גיבסון, לשלב 320 microliters של חיץ התגובה isothermal 5x עם 697 microliters של מים.

הוסף 3 מיקרוליטרים של T5 אקסונוקלאז, 20 מיקרוליטרים של פולימראז DNA, ו 160 mciroliters של קשירה DNA Taq. מעבירים 7.5 מיקרוליטרים של תערובת אב ההרכבה לצינור טרי. לאחר מכן הוסף 2.5 מיקרוליטרים של הוספה בווקטור, כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

דגירה הדגימות ב 50 מעלות צלזיוס במשך 45 עד 60 דקות. לאחר מכן, לאחסן דגימות על קרח, או ב 20 מעלות צלזיוס, לשינוי הבא. כאשר מוכן להפוך את החיידקים, להפשיר כימית מוסמך TOP10 חיידקי E.Coli על קרח.

לאחר מכן, הוסיפו חמישה מיקרוליטרים של גיבסון מיקס ל-50 מיקרוליטרים של חיידקים מוכשרים, ומערבבים על ידי החלק התחתון של הצינור בעדינות. דגירה על קרח במשך 30 דקות. מניחים את הצינור באמבט מים 42 מעלות צלזיוס או בלוק חום במשך 45 שניות כדי לזעזע את החיידקים.

ואז, לשים את הצינורות בחזרה על קרח. מוסיפים 250 מיקרוליטרים של מדיום SOC לחיידקים, ולתת להם להתאושש ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור רועד במשך 30 עד 45 דקות. לאחר שהחיידקים התאוששו, צלחת אותם על 1.5% LB אגר צלחות המכילות 100 מיקרוגרם למיליליטר אמפיצילין.

דגירה הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס במשך הלילה. כדי להתחיל, להכין לפחות שתי קבוצות של 200 צינורות תגובת PCR microliter עבור כל מבנה. למלא את אחד הסטים של צינורות תגובה עם 100 מיקרוליטר LB בינוני, המכיל 100 מיקרוגרם למיליליטר של אמפיצילין.

באמצעות קצה פיפטה סטרילי, לגרד את החומר הביולוגי מושבה חיידקית אחת, ולהפיץ אותו בתחתית צינור תגובה ריק 200 מיקרוליטר PCR. מיד להעביר את קצה פיפטה לצינור התגובה המתאים השני המכיל בינוני LB. מערבולת את הקצה סביב כדי לוודא כי חלק מהחיידקים מועברים לתקשורת LB.

דגירה ב 37 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר. לאחר מכן, הכינו 10 מיקרוליטרים של PCR Master Mix לכל צינור תגובה, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הוסף 10 מיקרוליטרים של PCR מאסטר מיקס לצינורות התגובה PCR שכותרתו, ללא מדיה LB.

באמצעות תרמוסיקלר, הדגירה את התגובות כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, מוסיפים צבע טעינה לרסיסים המוגברים, ועומסים אותם על ג'ל 1%. טוענים סולם דנ"א מתאים לשינוי גודל, ו מפעילים את הג'ל במאגר מתאים להפעלת ג'ל ב-120 וולט למשך 30 דקות.

חשב את הגודל התיאורטי של האמפליקון על-ידי הוספת הגדלים הבודדים של מקדמים משומשים, פיגומים של gRNA ומספר רצפי N20. מתוצאות המושבה PCR, לזהות את שיבוטים חיידקיים, בהתבסס על גודל הלהקה הנכון, והאם הם עשויים הנמל וקטורים נכונים. באמצעות תרבות 100 microliter המתאימה, לחסן 2.5 מיליליטר לילה LB תרבות המכילה 100 מיקרוגרם למיליליטר אמפיצילין.

דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 12 שעות. לאחר מכן, השתמש במיני ערכה מסחרית של פלסמיד כדי לחלץ את הדנ"א הפלסמיד, בהתאם להוראות היצרן. בהליך זה, שיבוט gRNA להרכבת מחרוזות משמש ליצירת פלסמידים של ביטויי gRNA במהירות.

תוצאה אופיינית של PCRs המשמשים להשגת חתיכות STAgR נראה כאן. ששת האמפליקונים מייצגים חלקי דנ"א ליניאריים, שכל אחד מהם מכיל את רצפי ה-gRNA N20 הבודדים בקצוות שלהם. עמוד השדרה פלסמיד הוארך עם רצפי מיקוד של gRNA1 ו gRNA6, ולכן בעל החפיפות הנדרשות לשני PCRs אחרים עבור הרכבת גיבסון.

לאחר הטיהור, ניתן להשיג תפוקת דנ"א של מיקרוגרם אחד לפחות לווקטורים ותוספים. לאחר הרכבת גיבסון, טרנספורמציה חיידקית תוצאות 100 כדי 700 מושבות חיידקים. ניתוח מייצג של 22 מושבות חיידקים, באמצעות PCR המושבה בעקבות פרוטוקול STAgR עם שש קלטות gRNA, עולה כי שבעה שיבוטים להראות את גודל אמפלייקון הצפוי להרכבה מלאה.

השיבוטים האחרים קיבלו ככל הנראה וקטורים STAgR, המכילים אחת עד חמש קלטות gRNA, ואילו שיבוט אחד ריק לחלוטין. לאחר השליטה, טכניקה זו יכולה להיעשות בעוד כמה שעות. מבוצע כראוי, זה מאפשר את הדור של שפע של וקטורים ביטוי gRNA מולטיפלקס בתוך פחות משבוע עבודה.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לשים לב להקצאה ולשילוב הנכונים של פריימרים של N20 overhang. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה צריך הבנה טובה על איך ליצור משלך מדריך מולטיפלקס RNA ביטוי וקטורים.