הקמת וניתוח של הגידול פרוסה Explants כתנאי בדיקות אבחון

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח במחקר פרה-קליני, שבו מחקרי תגובה לתרופות במפלי פרוסות גידול עשויים לשרת מטרות אבחון. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי explants פרוסה יכול עבור חלון זמן קצר מודל הביולוגיה המורכבת של רקמות מקומיות כולל פונקציות מבוזרות מרחבית. למרות שיטה זו יכולה לספק תובנה על השימוש בפרוסות מגידולי ריאות מורין, זה יכול להיות מיושם גם על סוגי רקמות אחרים כולל רקמות אנושיות.

כדי להתחיל, להכין את הרטט ולבצע VibraCheck על פי ההוראות המופיעות במדריך. ואז למלא כל באר של צלחת 24 גם עם מיליליטר אחד של תווי מלח מאוזנים של האנק בתוספת פניצילין וסטרפטומיצין ולשמור את הצלחת על קרח. הכנס מחטים 25-מד בכל ארבע כפות של עכבר המתת דם הניח על מכסה קלקר, כך החזה חשוף החיה נמתחת.

יש לרסס 70% אלכוהול על פני העור החשוף. השתמש מספריים להציב בתצב זוויתי לחתוך לפתוח את העור מהבטן לכיוון החזה עד לאזור הצוואר. למתוח את העור משני הצדדים באמצעות מדפים ולהכניס מחטים 25-מד.

חותכים את אזור הבטן. ואז לחתוך לפתוח את כלוב הצלעות ואת הסרעפת כדי לחשוף את הריאה והלב. לחשוף את קנה הנשימה על ידי חיתוך הרקמה שמסביב.

לנתח את הריאות, יחד עם הלב. מניחים את הרקמות לתוך צינור 50 מיליליטר המכיל 30 מיליליטר של קרח קר HBSS בתוספת עט סטרפטוקומפ להציב על קרח ולהמשיך לשלב הבא מהר ככל האפשר. עכשיו להעביר את הריאות נושאות הגידול לתוך צלחת תרבות רקמה 10 ס"מ.

השתמש מספריים סטריליים מדפים להפריד את האונות הריאה ולבחור אונות עם גידולים על פני השטח עבור חיתוך. מניחים אונה ריאות עם רקמת גידול על פיסת נייר מסנן כדי למנוע החלקה וחיתוך חלק הריאה הרגילה או רקמת גידול נוספת המקיפה את הגידול באמצעות אזמל סטרילי כדי ליצור משטח חתיכת רקמה שטוחה. טובלים את הצד השטוח בירידה של דבק cyanoacrylate ולהרים אותו על מחזיק דגימת רטט, כך הגידול פונה הלהב במצב זקוף, ולתת לו להתייבש במשך שתיים עד שלוש דקות.

מניחים את מחזיק דגימת הרטט במגש חיץ המתכת. מלאו את המגש ב-HBSS קר בתוספת Pen-Strep עד שהרקמות שקועות במאגר. מכסים את מגש החיץ עם מכסה פרספקס המסופק עם המכשיר ומ מניחים את המגש לתוך אמבט קרח לבן ומוסיפים קרח כדי לשמור על הרקמה קרירה במהלך חיתוך.

חבר את אמבט הקרח הלבן לוויבריום. לאחר מכן בחר הגדרות חיתוך מתאימות והתחל ב חיתוך. הביאו את להב הרטט לתדר הסכין והגדירו את חלון הסכין.

השתמש ממטרים סטריליים כדי לאסוף את הפרוסות בצלחת 24 באר מלא מיליליטר אחד של HBSS בתוספת עט סטרפטוקומפ לכל באר ולשמור על קרח. תוך כדי מעקב אחר סדר הניתוך, סמן כל באר של צלחת 24 הבאר על פי תוכנית הניסוי. אסוף פרוסת רקמה הסמוכה לפרוסות התרבותיות כאפס שעות או התייחסות לא תרבותית.

לאסוף לפחות שלוש פרוסות התייחסות כדי לייצג את החלק העליון, המרכזי והתחתון של הרקמה. וברגע שההסתעפת תושלם, המשך בתיקון ועיבוד. לאחר מכן, להכין צלחת שש באר המכיל 2.5 מיליליטר של תרבות בינונית לגם על ידי הצבת רשתות טיטניום בו.

ודאו שלא נוצרות בועות אוויר בין רשת הטיטניום למדיום. כדי לטעון פרוסה לרשת, שמרו על לוח שש בארות במיקום זוויתי כך שחלק מהמדיום יכסה את הרשת. לאחר מכן מניחים את הפרוסה במדיום על הרשת ולהשתמש במדפים כדי להפיץ אותו.

לאחר הנחת הפרוסות, העמיסו את לוחות ששת בארות על יחידת הדגירה המסתובבת הממוקמת בתוך חממה לחה המתוחזקת ב-37 מעלות צלזיוס עם 95%02 ו-5%CO2. התחל את מחזור הסיבוב. לטיפוח ארוך טווח לחדש את מדיום התרבות כל יום באמצעות מדפים סטריליים כדי להרים את הרשת המכילה את פרוסות הרקמה ולמקם אותו באר ריקה של צלחת שש בארות.

החלף 70% מהמדיום בגודל בינוני של תרבות רעננה והחזר את הרשת פנימה. המשך במחזור הסיבוב כבעבר. לטיפול תרופתי על פרוסות הגידול להוסיף 2.5 מיליליטר של מדיה עם התרופה מדולל או בקרת רכב לתוך צלחת שש באר.

מניחים את רשתות טיטניום לתוך בארות ולאחר מכן מניחים את הפרוסות על הרשתות כפי שנעשה בעבר. לאחר ביצוע הטיפולים במשך 24 שעות, להמשיך עם תיקון ועיבוד. כדי להתחיל לתקן את הפרוסה הרצויה בזהירות להעביר אותו באמצעות מדפים לתוך צלחת 10 ס"מ המכיל נייר מסנן ספוג מלא שניים עד שלושה מיליליטר PBS ולתת לו לצוף.

לאחר מכן הרם את נייר הסינון עם זוג מדפים והצב אותו בקלטת היסטו. העבר את נייר הסינון לקלטת היסטו. הוסף טיפה של hematoxylin מדולל על גבי פרוסת הרקמה כדי לסמן את המיקום של הפרוסה עבור השלבים הבאים.

סגרו את הקלטת, והעבירו אותה לתתסרון פורמלין במאגר ניטרלי של 4% ותעזבו למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר כביסה ועיבוד של הקלטת כמתואר בפרוטוקול, לפתוח את קלטת היסטו ולהשתמש אזמל כדי להרים בזהירות את הפרוסה הקבועה מנייר המסנן. משליכים את נייר הסינון ומעבירים את הפרוסה לתבנית המכילה פרפין נוזלי.

השתמש במשקל שטוח כדי ללחוץ על הרקמה נגד החלק התחתון של התבנית הטבעה כדי להבטיח אפילו חתך. מניחים את החלק התחתון של קלטת היסטו על גבי התבנית. מוסיפים עליו פרפין נוזלי.

ולתת לתבנית להתקרר על צלחת קרה במשך 30 דקות. לאחר מכן להפריד את התבנית מקורר מבלוק פרפין. השתמש במיקרוטום כדי להכין חלקים דקים של ארבעה מיקרומטר של בלוקי פרוסת רקמת FFPE.

לקצץ את עודף הפרפין המקיף את הרקמה. כדי להשיג אפילו חלקים לאורך הרקמה להתאים את הזווית של הבלוק, כך פני השטח של הבלוק הוא אופקית מכוונת ביחס ללהב. בעזרת מברשת דקה אוספים מקטעי רקמה רציפים של פרוסת הרקמה המוטבעת בפרפין החל מהחלק העליון של מגלשות הזכוכית.

המשך לאסוף את החלקים של שכבות הרקמה העמוקות יותר לאמצע, ואחריו החלק התחתון של שקופיות הזכוכית. אוסף החלקים משכבות שונות של כל פרוסת רקמה לשקופיות האובייקט נעשה כדי לאפשר לכידה של מעברי צבע פוטנציאליים הנגרמים על ידי תרבות בכדאיות, הגירת תאים או ביטוי סמן ביולוגי. לאחר איסוף הסעיפים ממשיכים בעיבודם וניתוח נוסף כמתואר בפרוטוקול.

עובי פרוסת רקמות יכול להשפיע על הכדאיות של פרוסות מתורבתות. במקרה זה, פרוסות בעובי 250 מיקרומטר מראות שיפוע נמק מוגבר בהשוואה לפרוסות בעובי 200 מיקרומטר עקב פרוסות עבות יותר הנוטה לחוסרים בחמצן או בדיפוזיה תזונתית על פני הפרוסות. עם זאת, פרוסות דקות 160 מיקרומטר מכילות אזורים נמקיים גדולים ככל הנראה נגרמת על ידי טיפול טכני במהלך מיקום הפרוסות כמו אלה הם שבירים נוטים להתכרבל.

ניתוח של NKX2-1, סמן של אדנוקרצינומה ריאות מובחנת היטב, מראה כי הביטוי שלה אינו משתנה באופן משמעותי פרוסות מתורבתות לעומת פרוסות אפס שעה לא תרבותית. ניתוח כמותי של ביטוי NKX2-1 אישר עוד כי הביטוי לא השתנה באופן משמעותי בפרוסות מתורבתות לעומת לא תרבותיות, דבר המצביע על כך שתהליך הטיפוח אינו משפיע באופן ברור על מצב ההידול של רקמת אדנוקרצינומה. כדי לבדוק אם פרוסות רקמת הגידול ניתן להשתמש כדי להעריך את היעילות של תרופות ממוקדות, הם טופלו עם DMSO או כמויות titrated של תרכובות.

כאשר מטופלים עם dactolisib מיקרומולרי אחד אשר מטרות זרחון מסלול mTOR של 4EBP1 היה מעוכב. 0.5 selumetinib מיקרומולרי אשר מטרות מסלול קינאז MAP היה יעיל בעיכוב זרחון של ERK1/2. לאחר צפייה בסרטון זה אתה צריך הבנה טובה של איך לעבוד עם ולנתח באופן ביקורתי פרוסות טרי לחתוך מרקמות גידול יקר.

הפוסט-דוק לשעבר שלנו, קטיה נרהי, תרם באופן משמעותי להקמת שיטה זו בשיתוף עם עמיתיו של פלטפורמת פרוסת הרקמה של קונסורציום Predect של IMI.